"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l'Université Laval comme exigence partielle du programme de maîtrise en médecine expérimentale offert à l'Université du Québec à Chicoutimi en vertu d'un protocole d'entente avec l'Université Laval pour l'obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)" / Les gènes ayant une activité biologique en lien avec le gène du récepteur de type 2 de l’interleukine 1 (IL1R2) sont des déterminants génétiques de l’asthme allergique L’asthme est une maladie chronique des voies respiratoires qui se traduit par une hyperactivité, une obstruction bronchique et un remodelage. Plusieurs facteurs génétiques et environnementaux sous-tendent le développement de cette maladie. En effet, plus de 300 gènes ont été jusqu’à présent associés à l’asthme. Dans ce mémoire, il sera question de certains de ces gènes associés avec les phénotypes reliés à l’asthme et qui sont en lien avec les activités du gène du récepteur de type 2 de l’interleukine 1 (IL1R2). Le gène IL1R2 est différemment exprimé dans les biopsies bronchiques de sujets asthmatiques allergiques comparativement aux sujets témoins et a également été associé avec l'atopie. Un criblage pangénomique (GWAS) a été réalisé sur cinq études d ’asthme indépendantes (SLSJ, EGEA, CAPPS, SAGE et BUSSELTON) afin d ’identifier des polymorphismes associés aux différents phénotypes reliés à l’asthme. Sept gènes ont été associés: beta-site APPcleaving enzyme-1 (BACE1) et la métalloprotéinase 2 (MMP2) avec l’asthme et l’asthme allergique, spleen focus form ing virus proviral integration oncogene (S P Il) avec l’atopie et l’asthme atopique, endoplasmic reticulum aminopeptidase (ERAP1) avec l’asthme allergique, interleukin 1 receptor accessory protein (IL1RAP) et interleukin 1 alpha (ILIA) avec l ’atopie, et le gène interleukin 1 receptor type 1 (IL1R1) avec l ’asthme, l’atopie et l’asthme allergique. Ces résultats soulignent l’importance du rôle &IL1R2 dans l’asthme et suggèrent qu’il serait pertinent de mieux caractériser sa voie biologique à l’aide d ’études génétiques fonctionnelles afin d’avoir une meilleure connaissance du rôle &IL1R2 dans la physiopathologie de l’asthme.

La régulation de l'expression des gènes est à la base de tous processus cellulaires tels que la différenciation, la migration, la réponse aux dommages, la survie et l'apoptose. La compréhension globale des mécanismes cellulaires passe donc par l'étude de la transcription. Définir les rôles, fonctions ainsi que les voies de signalisation pour chacun des facteurs de transcription d'une cellule est maintenant un incontournable dans la poursuite de la compréhension du génome humain. Les travaux de cette thèse cadrent dans cette optique en concentrant nos efforts sur la caractérisation des facteurs de transcription ± nuclear factor I ¿ (NFI). Nous démontrons, entre autre, la première preuve de liaison directe d'un répresseur au promoteur du gène p21. Cette répression exercée par les NFI est essentielle à la bonne progression du cycle cellulaire dans les cellules en prolifération, tout en permettant l'expression basale de p21. Nous avons aussi caractérisé les mécanismes de régulation des facteurs de transcription Spl, Sp3 et NFI sur le promoteur de l'intégrine α6, en présence de laminine et de la fibronectine. Nos résultats suggèrent une répression de l'expression de l'intégrine a6 par la liaison de NFI et la diminution des facteurs Spl et Sp3 en présence de laminine, pour ainsi expliquer les mécanismes de migration et prolifération cellulaire dans un modèle de cicatrisation cornéenne. Finalement, nous examinons l'étendue de la liaison des facteurs NFI dans les kératinocytes humains de peau, par une analyse globale d'immunoprécipitation de chromatine couplée aux puces à ADN îlots CpG, dans le but d'établir une meilleure compréhension des voies de signalisation dans lesquelles les facteurs de transcription NFI sont impliqués. Ces analyses permettront de mieux comprendre les mécanismes de régulation de la transcription, particulièrement en ce qui a trait à la régulation par les facteurs de transcription NFI

Introduction : L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie caractérisée par une augmentation des pressions pulmonaires menant à une défaillance cardiaque droite. Les cellules musculaires lisses des artères pulmonaires (CMLAP) sont exposées à un niveau de stress accru notamment dû à l’inflammation des tissus et du milieu pseudo-hypoxique. Malgré cet environnement hostile, elles arrivent à proliférer et à survivre. Toutefois, cela entraine une augmentation anormale du dommage à l’ADN. Il existe, cependant, un équilibre entre les dommages à l’ADN et les mécanismes de réparation. PIM1, une onco-protéine à l’activité kinase, est surexprimée en HTAP. Elle est impliquée dans plusieurs voies de signalisation cellulaire, telles la survie et la prolifération, mais la voie de réparation du dommage à l’ADN n’a jamais été explorée en HTAP. De plus, l’inhibiteur de PIM1, le SGI-1776, a été testé en essai clinique en cancer, ainsi l’évaluation de son efficacité pour les patients HTAP pourrait rapidement être mise en place. Objectifs : Évaluer le potentiel thérapeutique du SGI-1776 et élucider l’implication de PIM1 dans la réparation du dommage à l’ADN en HTAP. Méthodes/Résultats : Nous démontrons premièrement que les poumons de patients HTAP (n=10) ainsi que les CMLAP-HTAP (n=5) présentent une surexpression de PIM1. Sur ces mêmes tissus et lignées cellulaires, le précurseur de la reconnaissance des dommages à l’ADN (γH2AX) est également augmenté comparativement aux sujets sains. Ce précurseur est essentiel à l’initiation de la réparation à l’ADN et l’inhibition de PIM1 par SGI-1776 (1,3 et 5μM) diminue la capacité de la réponse au dommage à l’ADN via la voie de la jonction des extrémités non-homologues (NHEJ) : le traitement cause une diminution des facteurs du NHEJ comme Ku70, DNA-PKcs et γH2AX (n=4). Par essai comet, nous démontrons que les dommages sont toujours présents et que ceci diminue la prolifération (Ki67 n=3; p<0.05) et augmente l’apoptose (AnnexinV n=3; p<0.05). In vivo, le SGI-1776 diminue les pressions pulmonaires (n=30, 30±2mmHg vs 49±5mmHg) et diminue le remodelage des artères pulmonaires distales (H&E, 45% vs 65%), ce qui est principalement dû à la restauration de la balance entre la prolifération (Ki67 n=25; p<0.05) et l’apoptose (TUNEL n=25; p<0.05) des artères pulmonaires distales. Conclusion : Nous avons démontré pour la première fois l’implication de PIM1 dans la réparation du dommage à l’ADN en HTAP et que l’inhibition de son activité améliore in vitro et in vivo l’HTAP. / RATIONALE: Pulmonary Arterial Hypertension (PAH) is a fatal disease characterized by the narrowing of pulmonary arteries (PA) due to vascular remodeling. It is now established that this phenotype is associated with enhanced pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) proliferation and suppressed apoptosis. This phenotype is sustained in part by the activation of several DNA repair pathways allowing PASMC to survive despite the environmental stresses seen in PAH. PIM1 is an oncoprotein upregulated in PAH and that has been implicated in many pro-survival pathways in cancer, including DNA repair. PIM1 inhibitors, like SGI-1776, are already in clinical trials in cancer and could thus be beneficial to PAH patients. OBJECTIVES: The aim of this study is to demonstrate the implication of PIM1 in the DNA damage response and the beneficial effect of its inhibition by SGI-1776 in human PAH-PASMC and in rat preclinical model of PAH. METHODS/RESULTS: Using western blot we showed in both human PAH lungs (n=10) and PAH-PASMC (n=5) a significant upregulation of PIM1 compared to control donor (n=5). PIM1 upregulation in PAH was associated with a significant activation of DNA damage sensor (γH2AX), which is critical for DNA repair initiation. We showed that PIM1 inhibition using SGI-1776 (1,3, and 5μM) significantly impaired DNA repair capacity in PASMC (n=4) with a significant repression of Ku70, DNA-PKcs, and γH2AX and decreased ATM expression. We showed no diminution of DNA damage with SGI-1776 treatment (Comet Assay, n=3). As expected, the lack of DNA repair in SGI-1776 treated PAH-PASMC lead to a significant reduction in proliferation (Ki67 n=3; p<0.05) and resistance to apoptosis (AnnexinV assay n=3; p<0.05). In vivo, SGI-1776 10mg*kg-1 given 3 times a week, improves significantly (n=30; p<0.05) monocrotaline-induced PH (decreased RVSP, mean PA pressures and vascular remodeling). CONCLUSION: We demonstrated for the first time that PIM1 is implicated in DNA repair signaling in PAH-PASMC and that repressing its activity everses PAH both in vitro and in vivo.

La famille des facteurs de transcription NFI comprend les isoformes NFI-A, -B, -C et -X, qui peuvent agir comme activateurs ou répresseurs de la transcription génique. Récemment, nous avons démontré le rôle répresseur de NFI dans la transcription du gène encodant la sous-unité α5 de l'intégrine α5βl. Dans cette étude, nous avons démontré que la suppression de certains isoformes du facteur de transcription NFI altère l'expression du gène α5 dans une lignée particulièrement agressive de mélanome uvéal humain (T97). Nous avons démontré que la diminution de l'expression de certains isoformes permet l'augmentation significative l'expression de l'intégrine α5β1 à la surface des cellules de la lignée T97. Nous avons également identifié quelques protéines qui intéragissent in vitro avec NFI et qui pourraient ainsi modifier ses propriétés modulatrices en regard du gène de α5β1.

Le glaucome primaire à angle ouvert (GPAO), caractérisé par une dégénérescence du nerf optique, est une maladie complexe et génétiquement hétérogène. La grande famille canadienne française CA, où la mutation myociline K423E cause le GPAO selon un mode autosomique dominant, présente une très grande variabilité de l'âge au diagnostic (AAD) pour la maladie. Pour déterminer si WDR36, le troisième gène identifié pour le GPAO, est aussi un gène modificateur altérant la sévérité du glaucome, nous avons fait une étude de corrélations génotype-phénotype chez 142 porteurs hétérozygotes de myociline K423E. Nous avons comparé l'AAD des doubles-porteurs de myociline K423E et de variations non-synonymes dans WDR36 avec la médiane de l'AAD de leurs proches parents porteurs seulement de myociline K423E. La majorité des dix-huit porteurs WDR36 satisfaisant les critères d'analyse avait un AAD plus jeune que la médiane de leurs proches parents. Quatre des cinq porteurs WDR36 D658G furent diagnostiqués de 9 à 15 ans plus jeune que leur médiane. En conclusion, notre étude suggère que WDR36 pourrait être un gène modificateur du glaucome puisque certains variants diminuent l' AAD lorsque le GPAO est causé par une mutation myociline.

L'utérus est un tissu complexe fonctionnant sous le contrôle d'hormones stéroïdiennes et hypophysaires, et faisant intervenir de nombreux facteurs. Les hormones stéroïdiennes ovariennes jouent un rôle particulièrement important au niveau des changements morphologiques et de la différenciation vasculaire de l'utérus. Bien que l'utérus tienne une place fondamentale dans le domaine de la fertilité et de la santé des femmes, les mécanismes hormonaux, cellulaires, et moléculaires qui contrôlent le fonctionnement de l'utérus ne sont pas entièrement définis. Ainsi, nos travaux visaient l'identification des gènes modulés par l'oestradiol (E2) et la dihydrotestostérone (DHT) dans l'utérus de souris ovariectomisées. Plus précisément, l'analyse de ces gènes avait pour but de caractériser ou de raffiner la compréhension des sentiers métaboliques et/ou signalétiques impliqués dans la régulation du fonctionnement de l'utérus, et ultimement, de déterminer des gènes pouvant potentiellement servir de cibles thérapeutiques. Mettant à profit les récentes avancées technologiques pour l'acquisition et l'analyse de données génomiques, nous avons entrepris l'étude détaillée du profil de l'expression génique induit par l'E2 ou la DHT dans l'utérus de souris. Ces investigations ont confirmé l'activation par E2 d'une série d'événements transcriptionnels, potentiellement impliqués dans le contrôle de l'effet utérotrophique de l'oestradiol. Il ressort également de nos analyses que la DHT module la transcription de gènes liés au contrôle du cycle cellulaire, et que cette hormone pourrait éventuellement participer aux modifications périodiques de la couche endométriale de l'utérus. Cette étude n'a toutefois pas encore permis la caractérisation de nouveaux sentiers métaboliques ou signalétiques. En résumé, les résultats présentés dans ce mémoire ont non seulement permis de préciser les profils d'expression génique induits par l'E2 ou la DHT dans l'utérus de souris, mais également de mettre en évidence les sentiers IGF1 (pour E2) et ATM/Gadd45g (pour DHT), et d'émettre ainsi de nouvelles hypothèses à tester par des approches de biologie moléculaire classique.

L'obésité viscérale est souvent associée à un profil métabolique détérioré, aussi défini comme un syndrome métabolique (SMet), et qui inclut une résistance à l'insuline, une dyslipidémie et une hypertension. Les individus obèses ne sont pas tous égaux face au développement du SMet et une dysfonction du tissu adipeux, de même qu'une susceptibilité génétique et épigénétique pourraient expliquer cette hétérogénéité. Une précédente analyse transcriptomique du tissu adipeux viscéral (TAV) a identifié plusieurs gènes différentiellement exprimés entre des hommes avec obésité sévère atteints (SMet+) ou non (SMet-) d'un SMet. Le principal objectif de cette thèse était d'identifier des variations génétiques et épigénétiques parmi des gènes différentiel lement exprimés dans le TAV entre des hommes SMet+ et SMet- et qui sont associées à une variabilité de l'expression génique et aux composantes du SMet chez des individus avec obésité sévère. Des associations significatives ont été observées entre une variation génétique des gènes interferon-gamma-inducible protein 30 (IFI30) et thymic stromal lymphopoietin (TSIP) avec l'hyperglycémie / diabète de type 2 et la pression artérielle, respectivement. Des niveaux plus faibles de méthylation globale de l'ADN du génome, en quantifiant la méthylation des éléments répétitifs du génome de type LINE-1, étaient associés avec un plus grand risque de SMet. Les pourcentages de méthylation près de l'exon 2 du gène dipeptidylpeptidase-4 (DPP4) étaient associés avec son expression génique dans le TAV et avec les concentrations de cholestérol-HDL, mais étaient semblables entre un plus grand groupe d'individus SMet+ et SMet- dans le TAV et les globules blancs périphériques. Finalement, une approche d'analyse in silico a été proposée afin de cibler des gènes candidats de l'obésité dont l'expression serait potentiellement régulée par la méthylation dans leur pomoteur. Cette dernière étude a été effectuée lors d'un stage à l'étranger et l'approche proposée serait applicable dans d'autres contextes pathologiques, dont le SMet. Cette thèse dresse donc un aperçu des connaissances actuelles sur la génétique et l'épigénétique du SMet et les résultats qui y sont présentés contribueront, à leur manière, à améliorer notre compréhension de la pathophysiologie du SMet, ainsi que la susceptibilité génétique et épigénétique à développer des complications métaboliques en présence d'obésité.

Résumé Les plaquettes jouent un rôle central dans le maintien de l’hémostase et sont impliquées dans les maladies cardiovasculaires. Ces éléments sont anucléés, mais contiennent des ARN messagers (ARNm), dont la traduction pourrait être régulée par leurs microARN. Au cours de ce projet, je me suis concentrée à mieux caractériser ces microARN, afin de déterminer leur rôle dans la fonction plaquettaire. L’étude du répertoire complet des microARN plaquettaires humains, réalisée par séquençage à haut débit, montre un profil caractérisé par la forte expression de microARN impliqués dans la différentiation cellulaire et la mégacaryopoïèse. La diversité des microARN plaquettaires est enrichie par l’expression d’isoformes décalées en 5’, tel que miR-140-3p, ce qui leur confère la capacité de réguler des ARNm différents de l’isoforme principale. Beaucoup de microARN plaquettaires sont modifiés en 3’, ce qui peut altérer leur stabilité et influencer leur fonction. La présence de deux nucléotidyl-transférases et l’activité d’uridylation, observées dans des extraits protéiques de plaquettes in vitro, démontrent la capacité des plaquettes à modifier et à réguler leurs microARN. Dans un second temps, j’ai étudié l’implication des microARN dans les défauts plaquettaires observés chez les patients urémiques, dialysés ou non. Bien que les complexes impliqués dans la biogenèse et la fonction des microARN demeurent fonctionnels, le profil des microARN plaquettaires est altéré chez les patients urémiques, et semble rétabli par la dialyse. Deux gènes ont été identifiés comme étant régulés par des microARN altérés chez les patients urémiques, suggérant que l’altération de la régulation de certains ARNm par les microARN pourrait contribuer aux défauts plaquettaires chez ces patients. Militant en faveur d’un rôle des microARN dans la traduction des ARNm plaquettaire, j’ai mis en évidence (i) l’association des complexes effecteurs Argonaute 2 (Ago2)•microARN avec les ARNm, et (ii) la régulation de certains ARNm, traduits dans les plaquettes, par des microARN abondamment retrouvés dans celles-ci. Suite à l’activation des plaquettes, ces dernières sécrètent des microARN, essentiellement dans des microparticules, à l’intérieur desquelles ils sont associés à Ago2. Globalement, mes résultats laissent entrevoir un rôle important pour les microARN plaquettaires dans la régulation de leurs ARNm et la communication intercellulaire. / Platelets play a central role in hemostasis and are involved in cardiovascular diseases. Devoid of a nucleus, platelets nevertheless contain messenger RNAs (mRNAs) and are capable of de novo protein synthesis. MicroRNAs are particularly abundant in platelets, suggesting that they may regulate mRNA translation. In this project, I characterized further the microRNA repertoire and pathway of human platelets in order to gain more insights into their role in platelet function. High-throughput sequencing analysis of human platelet small RNAs revealed an abundant array of microRNAs involved in cell differentiation or megakaryopoiesis. The diversity of platelet microRNAs is expanded by the expression of 5’ shifted isoforms, as observed with miR-140-3p that may regulate mRNAs different than the reference sequence. Most platelet microRNAs are extensively modified at their 3’ extremity, a process that is thought to alter their stability and function. The detection of two nucleotidytranferases, as well as uridylation activity in platelets, demonstrate their ability to modify and regulate their microRNAs. I then studied the implication of microRNAs in the platelet defects observed in uremic patients, undergoing dialysis or not. Although the complexes involved in microRNA biogenesis and function remain functional, the platelet microRNA profile of uremic patients was altered, but seems to be restored by dialysis. The identification of two genes that are regulated by microRNAs altered in uremic patients suggests that an alteration of microRNA-based mRNA regulatory mechanisms may underlie the platelet response to uremia. Consistent with a role for microRNAs in regulating platelet mRNAs, Ago2•microRNA complexes are associated with platelet mRNAs. In addition, certain mRNAs translated in platelets can be regulated by microRNAs that are particularly abundant in platelets. Following their activation, platelets secrete microRNAs, mainly via microparticles, in which they are found associated with Ago2. Altogether, my results suggest that platelet microRNAs may play an important role in the regulation of platelet mRNAs as well as in intercellular communications.

La prééclampsie (PE), une complication de la grossesse caractérisée par la présence d’hypertension et de protéinurie, est associée à une mortalité et une morbidité maternelle et néonatale significatives à travers le monde. Les études récentes suggèrent que les femmes ayant souffert de PE ont également un risque accru de maladies cardiovasculaires (MCV) à long terme et que le lien entre ces deux entités pourrait possiblement être expliqué via le syndrome métabolique (SM). Comme l’inflammation semble être un élément majeur impliqué tant au niveau de la PE qu’au niveau du SM et des MCV, nos travaux de recherche visaient à investiguer l’association potentielle entre des variations génétiques de gènes candidats impliqués dans le processus inflammatoire et le risque de PE chez 307 femmes ayant souffert de PE et 603 témoins appariés. À cet égard, nous avons donc analysé des polymorphismes connus des gènes de l’interleukine-1α (IL-1α; 4845G&gt; T), de l’interleukine-6 (IL-6; -174C&gt; G), de l’interleukine-10 (IL-10; -1082A&gt; G, -2849G&gt; A), de TNF-α (TNF-α; -308G&gt; A, -857C&gt; T) et des récepteurs de TNF-α (TNFRІ 36A&gt; G, TNFRІІ 676T&gt; G). Nos résultats suggèrent la présence d’un « effet-dose » de la combinaison de gènes impliqués dans le processus inflammatoire sur le risque de PE. / Preeclampsia (PE), a pregnancy complication characterized by increased blood pressure and proteinuria, is associated with significant maternal and neonatal mortality and morbidity worldwide. Recent studies suggest that women who suffered from PE are at increased risk of long term cardiovascular diseases (CVD) and that the link between these two entities could be explained by the metabolic syndrome (MS). As inflammation appears to be a major element involved as much in PE than in MS and CVD, our research aimed to investigate the potential association between genetic variations in candidate genes involved in the inflammatory process and PE risk in a study sample that included 307 women who suffered from PE and 603 matched controls. In this regard, we analysed known polymorphisms of interleukin-1α (IL-1α; 4845G&gt; T), interleukin-6 (IL-6; -174C&gt; G), interleukin-10 (IL-10; -1082A&gt; G, -2849G&gt; A), TNF-α (TNF-α; -308G&gt; A, -857C&gt; T) and TNF-α receptors (TNFRІ 36A&gt; G, TNFRІІ 676T&gt; G) genes. Our results suggest the presence of a dose-effect of the combination of genes involved in the inflammatory process on the risk of PE.

La protéine de liaison à l’ARN, Fragile Mental Retardation Protein (FMRP) est une protéine conservée dans l'évolution et particulièrement abondante dans le cerveau en raison de sa forte expression dans les neurones. L'absence de FMRP est responsable du syndrome du X Fragile, première cause du retard mental héréditaire. Cette protéine semble jouer un rôle important dans la régulation de la traduction des ARNm, puisqu’elle se retrouve sur les polyribosomes en traduction active. Elle se retrouve également dans des structures contenant des ARNm sous forme réprimée ce qui suggère qu’elle se comporte plutôt comme une protéine ayant un rôle de répresseur traductionnel. Il a déjà été montré que la surexpression de la protéine FMRP chez les mammifères peut induire la formation de granules cytoplasmiques d'ARN qui ressemblent aux granules neuronaux et aux granules de stress. Les mécanismes de formation de ces granules FMRP et leur dynamisme sont cependant totalement inconnus. Contrairement à FMRP chez les mammifères qui a deux homologues (FXR1 et FXR2), la drosophile possède un seul gène codant pour dFMRP. L'utilisation de ce modèle simple nous a permis d’étudier la formation des granules dFMRP et le rôle de dFMRP dans la formation des granules de stress. Nous avons pu montrer que l'expression de dFMRP dans les cellules de la drosophile induit la formation de granules dynamiques. La formation de ces granules dFMRP se fait sans activation d’une réponse générale au stress et leur mécanisme de formation ne ressemble pas à celui des granules de stress. La formation de ces granules implique le domaine de dimérisation de dFMRP. Ce domaine ne semble cependant pas important pour le recrutement de la protéine dans les granules de stress. Nos expériences de FRAP montrent que le domaine de dimérisation de dFMRP est plutôt nécessaire à la mobilité de la protéine entre les granules de stress et le cytoplasme. Dans l'ensemble, nos études suggèrent que la dimérisation de dFMRP est un événement important pour l’induction des granules-dFMRP et permet le trafic de dFMRP entre les granules à ARN et le cytoplasme.