This thesis aimed to evaluate the possibility to use nanoparticles as antifungal drug carriers as well as their potential application in screening and diagnostics of invasive aspergillosis. The interaction of nanogels, superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIOs) and gold nanoparticles (GNP) with fungal-specific polysaccharides, cells and biofilms was investigated. Firstly, it was evaluated how the charge of nanogels influence their interaction with fungal cells. Linear poly(glycidol)s (pG) and poly(2-methyl-2-oxazoline) (pMOx) polymers were synthesized and further functionalized with thiol groups for preparation of redox responsive nanogels. Results showed that negatively charged nanogels were internalized by the fungi to a much greater extent than positively charged ones. Furthermore, it was investigated how amphiphilicity of polymers used for preparation of nanogels influences nanogel-fungi interaction. It was concluded that nanogels prepared from polymers with degree of functionalization of 10% had the strongest interaction, regardless the length of the alkyl chain. Moreover, amphotericin B-loaded nanogels had a higher antifungal effect and lower toxicity towards mammalian cells than the free drug. In addition, inverse nanoprecipitation of thiol functionalized pGs was shown to be successful for preparation of nanogels with narrow size distribution. It was also demonstrated that crosslinking of the polymeric coating in hydrogel-like network with thiol functionalized pGs improved the SPIOs imaging performance. Finally, it was investigated whether GNPs could be used as model particles for the assessment of targeting to fungi. Fc dectin-1 was conjugated covalently to GNPs decorated with pGs, and binding affinity towards β-glucans was tested by surface plasmon resonance. In summary, this thesis demonstrated evidence for the potential of pG nanogels and pG coated nanoparticles for antifungal therapy and diagnostics of fungal infections caused by A. fumigatus. / Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Evaluation der Eignung von Nanopartikeln für das Screening, die Diagnose und als Wirkstofftransportsysteme für die Behandlung von invasiver Aspergillose. Hierzu wurde die Interaktion von Nanogelen, superparamagnetischen Eisenoxid Nanopartikeln (SPIO) und Gold Nanopartikeln (GNP) mit pilz-spezifischen Polysacchariden, dem Pilz Aspergillus fumigatus sowie Pilz-Biofilmen untersucht. ...

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist der häufigste Erreger der invasiven Aspergillose, welche vornehmlich immunsupprimierte Patientinnen und Patienten betrifft und mit einer hohen Letalität einhergeht. Zur Entwicklung neuer diagnostischer sowie therapeutischer Ansätze ist ein besseres Verständnis der Interaktion von A. fumigatus mit dem humanen Immunsystem zwingend erforderlich. Zur Erforschung dieser Interaktion werden häufig Mausmodelle herangezogen, welche aufgrund der unterschiedlichen Biologie des Wirts jedoch nicht direkt übertragbar sind. Ziel dieser Studie war es, einen funktionellen in vitro Vergleich zwischen humanen und murinen Makrophagen, neutrophilen Granulozyten (PMNs) und dendritischen Zellen (DCs) in ihrer Interaktion mit A. fumigatus Konidien, Keimschläuchen sowie depletiertem Zymosan zu erstellen, um eine bessere Beurteilung und Übertragbarkeit des Mausmodells bei der invasiven Aspergillose zu ermöglichen. Dabei wurden die verschiedenen Zellen des Immunsystems auf standardisierte und reproduzierbare Weise generiert und Stimulationsversuche durchgeführt. Hierbei zeigten humane und murine Zellen in vitro eine unterschiedliche Antwort auf die Stimulation mit A. fumigatus: Murine Makrophagen und neutrophile Granulozyten zeigten im Vergleich zu den humanen Zellen eine stärkere primäre Immunantwort mit einer vermehrten Ausschüttung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Humane DCs hingegen, welche als Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem fungieren, zeigten nach Stimulation mit A. fumigatus eine vermehrte Oberflächenexpression von Maturationsmarkern sowie eine höhere Phagozytoserate als die murinen DCs. Weiterhin konnte eine inverse Dectin-1-Expression auf humanen und murinen DCs nach Stimulation mit A. fumigatus nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass es für alle untersuchten Zelltypen Unterschiede zwischen humanen und murinen Zellen in der basalen und der Zytokinausschüttung nach Stimulation mit A. fumigatus gab. In Zusammenschau der Ergebnisse dieser Arbeit zeigt das murine Immunsystem eine stärkere angeborene Immunantwort mit vermehrter ROS-Ausschüttung, jedoch auch eine anti-inflammatorische Zytokinantwort, um möglicherweise eine überschießende Inflammation zu verhindern. Dies könnte durch die stärkere Exposition der Maus gegenüber A. fumigatus durch den bodennahen Lebensraum sowie ihrer kurzen Lebensdauer bedingt sein. Im humanen System kommt hingegen der Aktivierung des adaptiven Immunsystems über die DCs eine übergeordnete Rolle zu. So zeigen beide Spezies distinkte Unterschiede in ihrer in vitro Immunantwort gegenüber A. fumigatus, welche bei der Übertragung von experimentellen Daten von der Maus auf den Menschen beachtet werden sollten. / Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is the main causative organism of invasive aspergillosis which occurs almost exclusively in immunocompromised patients and is still associated with a high lethality. For the development of new diagnostic and therapeutical approaches a better understanding of the in vitro interaction of human and murine innate immune cell populations with A. fumigatus is urgently needed. To study host-pathogen interactions mice are frequently used as infection model. However, little is known about functional differences in the innate immune response of human and murine cell populations in the pathogenesis of invasive aspergillosis. Therefore, the aim of our study was to conduct a functional and highly standardized comparison of human and murine macrophages, polymorphonuclear cells (PMNs) and dendritic cells (DCs) regarding their interaction with A. fumigatus conidia, germtubes and depleted zymosan to improve extrapolation from data achieved in mice experiments. Human and murine innate immune cells displayed a differential behavior after the exposure to A. fumigatus. Murine macrophages and PMNs exhibited a significantly stronger release of reactive oxygen species (ROS) after exposure to A. fumigatus. Human DCs, which function as an important link between the innate and adaptive immune system, displayed a stronger cell surface expression of maturation markers after stimulation with A. fumigatus as well as a higher phagocytosis rate than their murine counterparts. Furthermore, human and murine DCs showed an inverse Dectin-1 surface expression after stimulation with A. fumigatus. Human and murine innate immune cells showed a differential basal as well as stimulated cytokine release. Our data indicate that the murine immune system may have a stronger innate immune response after stimulation with A. fumigatus with an increased release of ROS. However, murine cells also showed a strong anti-inflammatory cytokine release to potentially inhibit excessive inflammation. This effect in mice might be due to the higher exposure to A. fumigatus caused by near-ground habitat as well as the shorter life span. In humans the activation of the adaptive immune system by activation of DCs seems to predominate. To summarize, immune cells of both species display distinct differences in their in vitro immune response after stimulation with A. fumigatus, which should be considered when conducting host-pathogen interaction studies in mice.

In der Hämatoonkologie nimmt die Inzidenz von Pilzinfektionen in den letzten 2 Jahrzehnten deutlich zu, wobei eine frühzeitige Diagnostik und adäquate Therapie hinsichtlich einer hohen Komplikationsrate wichtig ist. Umso deutlicher wird die Notwendigkeit einer Intensivierung und Verbesserung der Diagnostik, beispielsweise durch PCR. Es soll die Wertigkeit der routinemässigen PCR-Untersuchung als frühen Indikator einer Erkrankung in einer nicht durch Studiendiagnostik verfälschten klinischen Routine untersucht werden. Ein weiterer zentraler Punkt dieser Studie ist, ein Risikoprofil für neutropenische Patienten mit Chemotherapie bei Akuter Leukämie zu erstellen. Grundlegende Zusammenhänge zwischen individuellen wie auch generellen Risikofaktoren und Diagnosestellung einer IPI sollen durch die Untersuchung von 62 Patienten geklärt werden. Die PCR-Untersuchung ist ein schnelles und sensitives Verfahren zum Nachweis von Pilz-DNS. Es werden für die Sensitivität einer PCR, hinsichtlich der Diagnosestellung einer IPI im Zeitraum der Datenerhebung, ein Wert von 59,3 % und eine Spezifität von 71,4 % ermittelt. Betrachtet man den Zeitrahmen von 14 Tagen nach Beginn der Aplasie, so kann eine höhere Sensitivität von 72,7 % eruiert werden, wie auch ein hoher negativ prädiktiver Wert von 91,7. Eine invasive Mykose bei Patienten mit mehrfach negativem PCR-Nachweis kann somit als unwahrscheinlich angesehen werden. Besonderes Augenmerk wird in der Studie auch auf das Erstellen eines Risikoprofils für die Patienten hinsichtlich einer invasiven Mykose gelegt. In Hinblick auf die Chemotherapie-Protokolle und -Zyklen wird ein Trend zur frühen Chemotherapie deutlich. Bei der Überprüfung der epidemiologischen Verteilung für Deutschland kann erstmals eine signifikant unterschiedliche jahreszeitliche Verteilung an IPI nachgewiesen werden. So kommt es im Sommer signifikant seltener zu einer invasiven Mykose. Hingegen ist das Risiko der Krankheitsentstehung in den Monaten September, Oktober und November hochsignifikant gesteigert. Dieses sollte bei zukünftigen epidemiologischen Untersuchungen aber eventuell auch zur engmaschigen Diagnostik und Indikation prophylaktischer und empirischer Therapien berücksichtigt werden. / IFI are a life threatening complication in immunsupressed patients and have an increased incidence after chemotherapy for treatment of acute leukaemia (AL). Due its clinical implication as well as to difficulties in diagnosis and the isolation of causal organism, patients most often receive empirical and increasingly prophylactic antifungal therapy (AFT). The best choice of indication and also pharmacoeconomy depend on the local incidence and otherwise applied AFT. Therefore further characterisation of patients at risk and the knowledge influencing factors are essential for improving antifungal approaches. Little is known about climatic influence and seasonal distribution of fungal infections. Here we describe an epidemiological single center evaluation of AFT, clinical diagnosed IFI and its temporal distribution in AL patients. In a prospective evaluation during 2005 to 2006 patients diagnosed with AL and expected neutropenia for more than 9 days after chemotherapy were included and observed for up to 6 months. Underlying disease, patient characteristics, radiological evidence of pulmonary infiltrates, IFI as well as time point and indication of AFT have been collected. 62 patients with AL have been included in the evaluation. For 27 an IFI has been diagnosed clinically but only in a minority a causal pathogen could be detected. 42 patients received AFT. No correlation between the kind of chemotherapy and IFI could be found. There had been a relevant difference in the seasonal distribution of IFI. Especially for patients enrolled between September to November a significant higher incidence of 92% (p 0,002) could be detected. A further aim was to assess the performance of PCR in terms of diagnosing invasive aspergillosis, and we succeeded in supporting the value of a negative PCR result for ruling out IA and thereby helping to limit empirical therapy to those patients who are most likely to have a n invasive fungal infection. IFI is often a clinical indication for antimicrobial therapy in patients suffering from AL. In this evaluation only in a minority of patients the infection and its causal organism could be proven. In the majority of cases an empirical or preemptive therapy was initiated. This emphasis the necessity to intensify diagnostic efforts (e.g. galactomannan testing, BAL) and to improve tests (e.g. PCR). For the first time a seasonal influence on IFI in Germany could be demonstrated showing a significant higher rate in autumn. This should be taken into account in future epidemiological evaluations and might be helpful for the differentiation of prophylactic or empiric AFT.

Die invasive Aspergillose ist eine schwerwiegende opportunistische systemische Infektion bei immunsupprimierten Patienten. In dieser Arbeit wurden verschiedene PCR-Verfahren und ein ELISA-Verfahren zum Antigennachweis in Hinblick auf Sensitivität, Sensibilität und positiver bzw. negativer Vorhersagewahrscheinlichkeit verglichen. Die konventionelle 18S-PCR ist ein panfungales Assay und wegen zahlreicher falsch-positiver Ergebnisse nicht geeignet zur Frühdiagnose. Die ITS-PCR hat sich aufgrund guter Spezifität als vielversprechend erwiesen, muss aber noch mit größeren Fallzahlen evaluiert werden. Der Antigennachweis (Platelia, Fa. Bio-Rad) weist eine hohe Sensitivität und negativen prädiktiven Wert auf. Als vielversprechend dürfte zukünftig eine Kombination aus PCR und Antigennachweisverfahren gelten. / Diagnosis of Invasive Aspergillosis in immunocompromised patients

Die Invasive Aspergillose (IA) stellt eine Hauptursache der infektassoziierten Morbidität und Mortalität bei pädiatrischen Patienten mit hämato-onkologischer Grunderkrankung und/oder allogener Stammzelltransplantation dar. Die sichere und frühzeitige Diagnose ist bei Kindern aufgrund spärlicher pädiatrischer Daten weiterhin eine klinische Herausforderung. Die Kombination der Biomarker Galactomannanantigen und Aspergillus DNA hat sich in Erwachsenenstudien als vorteilhaft in der Diagnose der IA erwiesen. Ziel der durchgeführten Studie war daher, die diagnostische Güte des kombinierten Biomarkerscreenings in einer pädiatrischen Hochrisikokohorte zu ermitteln. Hierfür wurden 39 pädiatrische Patienten, die während eines Zeitraumes von drei Jahren aufgrund einer hämato-onkologischen Grunderkrankung und Notwendigkeit einer Stammzelltransplantation in der Würzburger Kinderklinik behandelt wurden, einem hochstandardisierten, zweimal wöchentlichen Screening auf Galactomannanantigen und fungaler DNA zugeführt. Zusätzlich wurde für jeden Patienten ein breites Spektrum an klinischen Daten sowie mikrobiologischen und radiologischen Ergebnissen erfasst und die IA-Klassifikation nach den EORTC/MSG-Kriterien durchgeführt. Unsere Daten zeigten eine IA-Inzidenz (probable IA) von 10%, was per definitionem einer Hochrisikokohorte entspricht. Das kombinierte Monitoring der Biomarker Galactomannanantigen und Aspergillus-DNA wies eine hohe diagnostische Genauigkeit mit einer Sensitivität/Spezifität/PPV/NPV von 1.00 und gute Eignung als Screeningtest auf. Die antifungale Prophylaxe zeigte keinen negativen Einfluss auf die diagnostischen Gütekriterien der beiden Biomarker, wie in anderen Studien postuliert. Der Galactomannanindex erwies sich als vielversprechender Surrogatmarker für das Outcome und das Therapieansprechen. Weiterführende Studien sind notwendig, um festzulegen, ob die Biomarkerkombination eine Detektion asymptomatischer subklinischer Infektionen als eine Art „Frühwarnsystem“ ermöglicht und somit eine Reduktion der Mortalität bedingen kann. / Invasive aspergillosis (IA) is a major cause of infection-associated morbidity and mortality in pediatric patients with underlying hemato-oncologic disease and/or allogeneic stem cell transplantation. Reliable and early diagnosis remains a clinical challenge in children due to sparse pediatric data. The combination of the biomarkers galactomannan antigen and Aspergillus DNA has been shown to be beneficial in the diagnosis of IA in adult studies. Therefore, the aim of the conducted study was to determine the diagnostic performance of the combined biomarker screening in a pediatric high-risk cohort. For this purpose, 39 pediatric patients who were treated at the Würzburg Children's Hospital during a period of three years due to an underlying hemato-oncological disease and the need for stem cell transplantation were subjected to a highly standardized, twice weekly screening for galactomannan antigen and fungal DNA. In addition, a wide range of clinical data as well as microbiological and radiological results were recorded for each patient and IA classification was performed according to the EORTC/MSG criteria. Our data showed an IA incidence (probable IA) of 10%, which by definition corresponds to a high-risk cohort. Combined monitoring of the biomarkers galactomannan antigen and Aspergillus DNA showed high diagnostic accuracy with a sensitivity/specificity/PPV/NPV of 1.00 and good suitability as a screening test. Antifungal prophylaxis showed no negative effect on the diagnostic accuracy criteria of either biomarker, as postulated in other studies. The galactomannan index proved to be a promising surrogate marker for outcome and treatment response. Further studies are necessary to determine whether the biomarker combination allows detection of asymptomatic subclinical infections as a kind of "early warning system" and thus may condition a reduction in mortality.

Due au champignon Aspergillus fumigatus, l’aspergillose pulmonaire invasive représente une grave menace pour les individus souffrant d’immunodépression sévère. En parallèle d’un diagnostic manquant de spécificité, les traitements actuels présentent une forte toxicité. Ces travaux se sont dans un premier temps intéressés au développement d’anticorps thérapeutiques dirigés contre les protéines pariétales Chitin ring formation du champignon. Le ciblage de ces protéines impliquées dans la croissance fongique a permis la mise en évidence d’effets modérés in vitro, et ont induit, in vivo, un recrutement significatif de cellules immunitaires impliquées dans la défense anti-aspergillaire. Dans un second temps, ces travaux se sont intéressés au ciblage du microenvironnement et de la réponse de l’hôte au cours de l’aspergillose, afin de mieux comprendre les processus physiopathologiques induits au cours de la maladie, et de permettre l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques. L’utilisation de la spectrométrie de masse iTRAQ®, chez des rats et des manchots, a permis la mise en évidence de plusieurs voies de signalisation surreprésentées. Ces travaux se sont également intéressés à la caractérisation immunologique d’un modèle rat d’API. En plus de la mise en évidence des effets du champignon sur le recrutement de certaines populations de cellules immunitaires, l’utilisation de l’iTRAQ® a permis la mise en évidence de la surexpression de l’interleukine-33 et de son récepteur ST2 au cours de la maladie. Ces travaux ouvrent d’intéressantes perspectives dans la mise en place de nouveaux traitements contre l’API. / Caused by the fungus Aspergillus fumigatus, invasive pulmonary aspergillosis is a serious threat for individuals suffering from severe immunosuppression. In parallel of a diagnosis lacking specificity, current treatments present a high toxicity. This work first focused on the development of therapeutic antibodies directed against cell wall proteins Chitin ring formation of the fungus. Targeting of these proteins involved in fungal growth highlighted moderate effects in vitro, and induced, in vivo, a significant recruitment of immune cells involved in anti-aspergillary defense. In a second time, this work focused on targeting the microenvironment and the host response during aspergillosis, in order to better understand pathophysiological processes induced during the disease, and allow the identification of new biomarkers and therapeutic targets. Use of iTRAQ® mass spectrometry in rat and penguins allowed the identification of several overrepresented signaling pathways. This work also focused on the immune characterization of a rat model of IPA. In addition of highlighting the effects of the fungus in the recruitment of some immune cell populations, use of iTRAQ® exhibited an overexpression of interleukin-33 and its receptor ST2 during the disease. Overall, this work is bringing interesting insights in the establishment of new treatments against IPA.

Der Schimmelpilz Aspergillus (A.) fumigatus stellt den häufigsten Erreger der invasiven Aspergillose (IA) dar, die vor allem bei immunsupprimierten Patienten auftritt. Unter den unspezifischen klinischen Symptomen dieser Erkrankung ist Fieber das häufigste. Dennoch wurden physiologische Aspekte wie eine erhöhte Körpertemperatur in Arbei-ten zur Interaktion menschlicher Immunzellen mit A. fumigatus bisher nicht berück-sichtigt. Zahlreiche Studien konnten den Einfluss einer erhöhten Temperatur auf den Verlauf von Infektionserkrankungen in vivo sowie auf die Funktionen verschiedener Immunzellen – einschließlich dendritischer Zellen (DCs) – in vitro zeigen. DCs spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr gegenüber A. fumigatus, ihre besondere Be-deutung liegt in der Verknüpfung der angeborenen mit der erworben Immunantwort. Ziel dieser Arbeit war die in vitro Analyse des Einflusses einer erhöhten Temperatur auf die Immunantwort humaner DCs gegenüber A. fumigatus. Dazu wurden DCs mit A. fumigatus oder Zymosan, einem ß-1,3-Glucan, bei Normo- (37 °C) und Hyperthermie (40 °C) für bis zu 24 h inkubiert und spezifische DC-Funktionen charakterisiert. Hierbei tolerierten DCs die Inkubation und Stimulation unter Hyperthermie ohne signifikanten Viabilitätsverlust. Die Zytokinexpression und -sekretion durch A. fumigatus-Stimulation wurde durch Hyperthermie nicht signifikant verändert. Die Fähigkeit zur Aufnahme von A. fumigatus-Konidien wurde durch eine kurzzeitige (1 h) Hyperthermie nicht beein-flusst, längerfristige (24 h) Hyperthermie reduzierte diese Fähigkeit jedoch signifikant. Ebenso bestand unter Hyperthermie eine verstärkte Expression von CD86 und HLA-DR auf unstimulierten DCs sowie von CD80, CD86 und HLA-DR auf stimulierten DCs. Die reduzierte Aufnahmekapazität für A. fumigatus-Konidien und die verstärkte Expression der kostimulatorischen Moleküle unter Hyperthermie zeigten, dass Hyper-thermie in vitro einen reiferen Phänotyp unstimulierter DCs bewirkt sowie die DC-Reifung durch A. fumigatus-Stimulation verstärken kann. Diese reiferen DCs könnten zu einer verbesserten T-Zell-Aktivierung und Abwehr von A. fumigatus und zu einem verbesserten Outcome der IA beitragen. Außerdem könnte Hyperthermie als Adjuvans zur in vitro Generierung A. fumigatus-spezifischer DCs eingesetzt werden. / In immunocompromised patients, invasive aspergillosis (IA) is the most frequent disease caused by the pathogenic mould Aspergillus (A.) fumigatus. Fever is one of the most common yet nonspecific clinical symptoms of IA. However, physiological aspects such as febrile body temperature have never been taken into account in studies investigating the interaction between human immune cells and A. fumigatus in vitro. It has been shown that elevated body temperatures can influence the course and out-come of infectious diseases in vivo as well as the functions of different immune cells in vitro, including dendritic cells (DCs). DCs play an important role in the immune response to A. fumigatus, as they act as a bridge between the innate and adaptive immune system. In order to determine the influence of elevated body temperature during IA, I investigated the effect of hyperthermia on human DCs confronted with A. fumigatus in vitro. DCs were stimulated with germ tubes of A. fumigatus or the fungal cell wall component zymosan, a ß-1,3-glucan, at 37 °C or 40 °C for up to 24 h, followed by characterization of specific DC functions. My results demonstrate that DC viability was maintained under hyperthermia. Expression and secretion of cytokines by DCs following A. fumigatus-stimulation were not influenced by hyperthermia. Short-time hyperthermia did not affect antigen uptake, however, long-time hyperthermia reduced uptake of A. fumigatus-conidia by DCs significantly. Hyperthermia enhanced CD86 and HLA-DR expression on unstimulated DCs as well as CD80, CD86 and HLA-DR expression on A. fumigatus-stimulated DCs. As the expression of costimulatory molecules on DCs was enhanced and uptake of A. fumigatus-conidia by DCs was reduced at 40°C, hyperthermia might cause a more mature phenotype in unstimulated DCs and enhance DC-maturation caused by A. fumi-gatus-stimulation. This could contribute to an increased T-cell-activation and to an improved A. fumigatus-defense and might influence the course and outcome of IA. Moreover, hyperthermia might even be a useful adjuvant in the in vitro generation of A. fumigatus-specific DCs for immunotherapy.

La paroi du champignon filamenteux A. fumigalus conditionne la croissance et est responsable du maintien de l'intégrité cellulaire lors de l'infection. Les protéines de la paroi de ce champignon filamenteux n'avaient pas été étudiées jusqu'à présent alors qu'elles semblent jouer un rôle essentiel dans la structuration de la paroi de la levure modèle S. cereviciae. Une approche essentiellement biochimique a permis de caractériser les protéines associées à la paroi de A..fumigatus. La majorité des protéines pariétales chez A. fumigatus sont des protéines solubles. Une seule protéine est relarguée à partir de la paroi par un traitement f3- (1 .3) glucanase : c'est une phosphatase acide qui possède une ancre GPl et dont l'expression est réprimée en présence de phosphate inorganique. Par ailleurs, une étude des protéines GPl chez A. fumigatus par génomique comparative a montré que les protéines GPI décrites comme associées de façon covalente à la paroi chez la levure n'ont pas d'homologue chez A. fumigatus. Ainsi. l'organisation des protéines au sein de la paroi de A..fumigatus est différente de celle de la levure : les protéines pariétales ne semblent pas avoir un rôle essentiel dans l'élaboration de la paroi. Ensuite, une nouvelle famille de glycoprotéines portant un N-glycane lié à un galactofuranose en position terminale a été décrite. Cette famille comprend une phospholipase C, une phosphatase alcaline et une phytase. Enfin, une analyse morphologique de deux mutants chitine synthase et gluconosyltransférase a permis d'associer la réduction de la croissance à un hyper-branchement du mycélium et à une diminution de la taille de la cellule apicale sans que l'organisation globale des polysaccharides pariétaux et le taux de croissance spécifique soient affectés.

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Methoden zur Diagnostik der Aspergillose bei Greifvögeln, um neue Erkenntnisse über die Aussagekraft dieser nicht invasiven Diagnostika zu gewinnen. In der ersten Studie wurden bei ausschließlich Aspergillose-positiven Falken (Falco spp.) (n = 110) spezifische Röntgenzeichen an digital erstellten Röntgenbildern systematisch ermittelt und mit den typischen Röntgenzeichen von Papageien mit Erkrankungen des unteren Respirationstrakts verglichen. In der zweiten Studie wurden gesunde (n = 73) und an Aspergillose erkrankte (n = 32) Jagdfalken (Falco spp.) mittels Serumelektrophorese untersucht, Referenzwerte für die gesunden Falken erstellt und mit den Werten der erkrankten Falken verglichen. In beiden Studien stammten die Tiere aus dem Patientengut derselben Klinik. Bei der Auswertung von Röntgenbildern Aspergillose-positiver Falken wurden hauptsächlich subtile Röntgenzeichen beschrieben. Von den 110 Tieren waren 29 (26,4 %) radiologisch vollkommen unauffällig. Die am häufigsten beschriebenen Befunde waren inhomogene Verschattungen des Lungenfeldes (38,2 % laterolateral [ll]) und strichförmige Verschattungen der kaudalen Lungengrenze (30,0 % ll) sowie inhomogene (34,5 % ll; 29,1 % ventrodorsal [vd]) und streifige (26,4 % ll) Verschattungen der Luftsäcke, aber auch eine schlechte Abgrenzbarkeit des Herzschattens in der laterolateralen Projektion (42,7 %). Im Vergleich zu an Papageien mittels konventioneller Projektionsradiographie durchgeführten Studien war der Anteil an subtilen Röntgenzeichen geringer und der Anteil an massiven Röntgenzeichen größer. Verglichen mit Referenzwerten diverser Greifvogelspezies aus der Literatur zeigten die Referenzwerte der gesunden Falken dieser Studie unter Verwendung des hochauflösenden Elektrophoresesystems SAS 1 unit (Helena, Saint Leu La Forest, Frankreich) relativ niedrige Gesamtproteinwerte und relativ hohe Präalbuminwerte auf. Bei den 32 Serumproben der an Aspergillose erkrankten Falken ließ sich im Gegensatz zu den 73 Serumproben der gesunden Falken ein signifikant erniedrigter Totalalbuminwert (Albumin + Präalbumin) sowie ein hoch signifikant erniedrigter Präalbuminwert mittels Serumelektrophorese feststellen. Obwohl die Falken meist schon in frühen Krankheitsstadien vorgestellt wurden und die Diagnostik in diesen Stadien besonders schwierig ist, konnten mit beiden Untersuchungsmethoden von gesunden Tieren differierende Befunde erhoben werden. Diese in Zusammenhang mit Aspergillose erhobenen Befunde wichen jedoch teilweise deutlich von den in der Literatur beschriebenen „typischen“ Befunden bei an Aspergillose erkrankten Vögeln ab. Dies kann damit erklärt werden, dass die meisten vergleichbaren Studien an als Heimtiere gehaltenen Papageien oder gefangen gehaltenen Zoovögeln (von Falken abweichende Haltungsform, Anatomie und Physiologie sowie Leistungsniveau) und mit unterschiedlicher Technik (digitale versus konventionelle Projektionsradiographie, unterschiedliche Elektrophoresesysteme und Verwendung von Serum anstelle von Plasma) durchgeführt wurden. Die digitale Projektionsradiographie kann aufgrund ihrer schonenden, einfachen und schnellen Durchführbarkeit sowohl den Vogelmedizin spezialisierten Institutionen als auch den Kleintierpraktikern uneingeschränkt empfohlen werden. Die Proteinelektrophorese kann bis zum heutigen Zeitpunkt nur bedingt für den Praktiker, wohl aber für spezialisierte Institutionen bei Beachtung aller Besonderheiten als zusätzliches Diagnostikum empfohlen werden. / The present study concentrates on two methods for diagnosing birds of prey with aspergillosis with the intent to increase the knowledge of the validity of these non-invasive diagnostic methods. In the first study, specific radiographic signs of digitally created radiographs of falcons (Falco spp.) which were exclusively positive for aspergillosis (n = 110) were systematically analyzed and compared to the typical radiographic signs of parrots with diseases of the lower respiratory tract. In the second study, healthy falcons (n = 73) and falcons affected with aspergillosis (n = 32) (Falco spp.) were examined by using serum protein electrophoresis in order to create reference values for healthy falcons and compare them with the values of the affected falcons. In both studies, the animals were patients of the same clinic. While evaluating the radiographs of the falcons with aspergillosis, mainly subtle radiographic signs were described. Radiographically within normal limits were 29 (26.4%) of the 110 animals. The most commonly reported findings were inhomogeneous increased radiodensity of the lung area (38.2% laterolateral [ll]), line-shaped shadowings of the caudal lung border (II 30.0%) as well as an inhomogeneous (34.5% ll, 29.1% ventrodorsal [vd]) and streaky (26.4% II) radiodensity of the air sacs, but also a poor delineation of the cardiac silhouette in the laterolateral projection (42.7%). Compared to studies performed on parrots by conventional radiography, the portion of subtle radiographic signs was lower and the portion of severe signs was higher. Compared to reference values of various raptor species from the literature, this study, which made use of the high-resolution electrophoresis SAS 1 unit (Helena, Saint Leu La Forest, France), revealed relatively low values for total proteins and relatively high values for prealbumin in the reference values of the healthy falcons. The 32 serum samples of the falcons suffering from aspergillosis showed a significantly reduced total albumin (albumin + prealbumin) level and a highly significantly reduced prealbumin level compared to the 73 serum samples of healthy falcons. Although the falcons were for the most part already brought to the clinic in one of the early stages of the disease, when diagnosing aspergillosis is particularly difficult, both examination methods revealed different results for the healthy and diseased animals. However, the findings related to aspergillosis were in some cases significantly different from those described in the literature as the \"typical\" findings in birds suffering from aspergillosis. This can be explained by the fact that most of the comparable studies were conducted with parrots held as pets or with captive zoo birds (when husbandry, anatomy and physiology, as well as performance level are different from falcons) and with a different technique (digital versus conventional radiography, different electrophoresis systems and the use of serum instead of plasma). The digital radiography can be fully recommended for specialized medical institutions for avian medicine as well as for small animal practitioners because of its easy, rapid and gentle feasibility. To date, the protein electrophoresis can only be recommended with restrictions for practitioners, however for specialized institutions, it can be useful as additional diagnostic tool if all its specific features are taken into account.

Les infections fongiques sont une complication fréquente des patients d’hématologie et en particulier des patients ayant reçu un greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH). L’objectif de ce travail était d’identifier les facteurs de risque d’infections fongiques intrinsèques et la transmission.Nous avons d’abord étudié l’aspergillose invasive (AI) qui est l’infection fongique la plus fréquente chez les greffés de CSH en croisant les données du registre européen des greffés ProMise et la base de données de l’étude prospective SAIF. Nous avons mené une étude cas-témoins nichée dans une cohorte de 185 cas et 651 témoins appariés. Les facteurs associés à la survenue d’une aspergillose étaient l’irradiation corporelle totale, une GvH aiguë de grade ≥2 et la rechute de l’hémopathie. Trente-cinq cas étaient précoces (<J40), 33 tardifs (entre J40 et J100) et 117 très tardifs (>J100). Le facteur associé à la survenue d’une AI précoce était l’absence de prise de greffe. Le facteur associé à la survenue d’une AI tardive était la GvH aiguë de grade 3-4. Les facteurs associés à la survenue d’une AI très tardive étaient la GvH aiguë de grade ≥2, la rechute et la neutropénie secondaire. Tous les facteurs pré-greffe étaient effacés par les facteurs post-greffe.Puis nous avons étudié la transmission d’infection fongique par l’étude d’une épidémie de pneumocystose survenue dans le service. Douze cas de pneumocystose sont survenus en 7 mois dans le service soir beaucoup plus qu’au cours des années précédentes. L’analyse moléculaire a permis de montrer que 4 cas appartenaient au même génotype, qui est un génotype rare jamais décrit dans une série de plus de 300 génotypes en Europe. La carte de transmission a permis de constater que ces 4 patients se sont rencontrés uniquement en hôpital de jour. Cette étude est la première démonstration moléculaire d’une épidémie de pneumocystose dans un service d’hématologie. / Fungal infections are a common complication of hematology patients and especially in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) recipients. The objective of this work was to identify intrinsic risk factors for fungal infections and transmission.We first studied invasive aspergillosis (IA), which is the most common fungal infection after HSCT by crossing data from the European HSCT registry ProMise and the prospective study database SAIF. We conducted a nested case-control study in a cohort of 185 cases and 651 matched controls. Factors associated with onset of aspergillosis were total body irradiation, acute GVHD grade ≥2, and relapse of the underlying disease. Thirty-five IA were early (<D40), 33 late (between D40 and D100) and 117 very late (> D100). The factor associated with the occurrence of an early IA was the absence of engraftment. The factor associated with the occurrence of late IA was acute grade 3-4 GvH. Factors associated with the occurrence of very late IA were acute GVHD grade ≥2, relapse, and secondary neutropenia. All pre-transplant factors were supplanted by post-transplant factors.Then we studied the transmission of fungal infection by studying a pneumocystosis outbreak occurring in the hematology department. Twelve cases occurred within 7 months. Molecular analysis showed that 4 of them belonged to the same genotype, which is a rare genotype never described in a series of more than 300 genotypes in Europe. The transmission map permitted to identify that these 4 patients met only in the daycare center. This study is the first molecular demonstration of a pneumocystis outbreak in a hematology ward.