This thesis describes the cultivation and extraction of filamentous fungi isolated from extreme environments in the search for new antibiotic compounds. Filamentous fungi are a rich source of medicines including antibiotics, and it is believed that many currently unknown fungal species and bioactive fungal metabolites remain to be discovered. Aspergillus fumigatus and Penicillium nalgiovense strains were isolated from an antibiotic-contaminated riverbed near Hyderabad, India, and soil taken from a penguin’s nest on Paulete Island, Antarctica, respectively. It was anticipated that the extreme conditions within these environments would exert unusual selective pressures on their filamentous fungi, possibly causing the secretion of new bioactive compounds. The cultivation, extraction and analysis of metabolites from the A. fumigatus strain resulted in the isolation of the antimicrobial substance gliotoxin. Subsequent investigations revealed that this strain’s secretion of gliotoxin was increased by as much as 65 % when it was cultivated in the presence of pathogen-associated molecular patterns. These results indicate the existence of a fungal receptor/signaling system for detecting nearby bacteria. The scope for using gliotoxin and the related metabolite bis(methyl)gliotoxin as biomarker metabolites for diagnosing the lethal pulmonary condition invasive aspergillosis was also investigated. Bronchoalveolar lavage fluid from 42 patients with and without possible invasive aspergillosis was extracted and analyzed. The results obtained suggest that gliotoxin and bis(methyl)gliotoxin are not suitable markers for diagnosing invasive aspergillosis. Studies on the P. nalgiovense strain from Antarctica resulted in the isolation of the antifungal agent amphotericin B. The secretion of this compound increased when P. nalgiovense was cultured on a potato-dextrose agar enriched with coconut flakes rather than liquid RPMI 1640 medium. This was the first time amphotericin B was isolated from any organism other than the bacterium Streptomyces nodosus. The results presented in this thesis will be useful in the continuing search for novel bioactive compounds, the diagnosis of fungal infections, and as a source of insight into the interactions between microorganisms. Moreover, they show that even extensively studied fungal genera such as Aspergillus and Penicillium are not completely understood and may produce unexpected or previously unknown bioactive metabolites under appropriate conditions.

Fungal infections are ignored by social and political communities. However, they are estimated to affect more than a billion people, resulting in approximately 11.5 million life-threatening infections in the 'at risk' population and more than 1.5 million deaths annually. Though there have been huge advances in diagnostics and antifungal drug development over the past two decades, however, resource limited settings have not benefited from these advances. The aim of this research was to determine the burden of serious fungal infections in Nigerians with the appropriate underlying diseases. This epidemiological research was conducted across four study populations. Study 1; HIV-infected patients with CD4+ counts < 250 cells/mm³, irrespective of their ART status, a CrAg lateral flow assay was used for detecting cryptococcal antigenaemia (n=214). Study 2; a cross-sectional multicentre survey of TB patients being managed for smear negative or treatment failure TB irrespective of their HIV status (n=208). Study 3; a multicentre histoplasmin skin sensitivity survey amongst healthy HIV-infected and non-HIV infected participants; intradermally; induration ≥ 5 mm was considered to be histoplasmin positive (n=750). Study 4; a prospective cohort study of critically ill patients in a Nigerian ICU (n=71). Two retrospective studies to analyse the clinical picture of serious fungal infections in two at risk populations (HIV/AIDS and neonatal intensive care babies) in Nigerians was also conducted (n=7034; n=2712 respectively). Results revealed an overall seroprevalence of cryptococcal antigenemia of 8.9% with 6 (9.8%) in those with CD4+ cell counts < 100cells/mm³, 4 (5.0%) in the 100-200 group and 9 (12.3%) in 200-250 cells/mm³ group; a CPA prevalence of 8.7% (6.5% had HIV infection and 14.5% were HIV-negative) and a prior subclinical histoplasmosis of 4.4%. The ICU study revealed a 45% healthcare associated infection rate representing an incidence rate of 79/1000 patient-days in the ICU. The retrospective studies revealed a 2.3% rate of neonatal ICI with a case fatality rate of 18.5%. In the 12 years retrospective study 18% had a fungal OI with 88% of patients having initiated ART. In conclusion, serious fungal infections do occur in the at risk population in Nigeria and they constitute a significant public health challenge. Our findings demonstrate that there has been an underestimation of the burden of the problem in Nigerians. There is a dire need to design guidelines for the management of fungal infections in at risk population.

A pneumonia fúngica é uma infecção pulmonar profunda causada principalmente por fungos do gênero Aspergillus, incluindo A. fumigatus, A. niger, A. flavus e A. terreus. Se encontram mais comumente em matéria orgânica em decomposição. Seus propágulos estão presentes na poeira e no ar, o que favorece a inalação, porta principal de entrada do agente no organismo. Produzem grande quantidade de conídios com menos de 8 μ, fazendo com que, quando inalados, alcancem o leito pulmonar. É o gênero considerado o mais comum em nosso planeta e o A. fumigatus é a espécie mais frequentemente descrita em invasão tecidual. Em animais e humanos, os sistemas respiratório e imunológico saudáveis são suficientes para eliminar os propágulos das vias aéreas, evitando sua colonização. Doenças e fármacos imunossupressores têm sido descritos como fatores predisponentes da infecção pulmonar fúngica, considerada oportunística. É considerada rara em cães. Os sinais clínicos são variados, mas a tosse persistente e a não cessação dos sinais com o uso de antimicrobianos são dados para suspeita de pneumonia fúngica. No exame radiológico de pulmões, são descritas várias imagens, das quais a mais relatada é a de padrão intersticial nodular miliar generalizado, embora não seja imagem patognomônica. Este trabalho teve como objetivo verificar a ocorrência de aspergilose pulmonar em cães com sintomatologia respiratória atendidos no Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (HCV-UFRGS), localizado na cidade de Porto Alegre. A amostragem foi composta por 46 cães nos quais foi realizado Biópsia por Aspiração com Agulha Fina (BAAF) nos dois pulmões, coleta de sangue e exame radiológico torácico. O material obtido de uma punção foi homogeneizado com caldo Sabouraud Dextrose líquido. Parte deste homogeneizado foi semeado em Agar Malte para Aspergillus spp. e feito exame direto em lâmina e com colotração de Grocott. A outra parte foi semeada em vários meios de cultura para exame bacteriológico. Do material obtido na outra punção foi realizado exame citopatológico corado pelo método Panótico Rápido. Do soro obtido do sangue coletado foi realizado exame soromicológico para A. fumigatus, A. flavus e A. niger. Os resultados dos exames micológico, citopatológico, soromicológico e bacteriológico foram negativos para todas as amostras testadas. Não havendo positividade dos exames, não foi possível correlacionar a pneumonia fúngica com as imagens radiológicas obtidas dos pulmões dos 46 cães radiografados. A maioria dos cães viviam em áreas abertas, em contato com matéria orgânica onde o fungo frequentemente se encontra. Os exames para detecção de fungos devem ser analisados com cautela, pois o resultado positivo em um único exame não confirma a presença da infecção, pois o agente pode estar presente frequentemente no trato respiratório superior de cães. / Fungal pneumonia is a deeply lung infection caused by fungal agents of the genus Aspergillus, including A. fumigatus, A. niger, A. flavus and A. terreus. They are found most commonly in decaying organic matter. Their fungal propagules are present in dust and air, which favors the inhalation, the main entrance of the agent in the body. They produce large amounts of conidia with less than 8 μ, so that, when inhaled, reaching the pulmonary bed. It is the considered the most common kind genus on our planet and A. fumigatus is the most often reported species in tissue invasion. In animals and humans, a healthy immune and respiratory systems is sufficient to remove the seedlings of the airways, preventing colonization. Diseases and immunosuppressive drugs have been described as predisposing factors of pulmonary fungal infection, considered opportunistic. It is considered rare in dogs. Clinical symptoms are varied, but a persistent cough and no cessation of symptoms with the use of antimicrobials are data for suspected fungal pneumonia. In the radiological examination of the lungs, several images have been described, and the most described is a generalized miliary nodular interstitial pattern, but it is not a pathognomonic image. This work aimed to verify the occurrence of pulmonary aspergillosis in dogs with respiratory symptoms examined at the Veterinary Clinical Hospital of Federal University of Rio Grande do Sul (HCVUFRGS), located in Porto Alegre city, in Brasil. The sampling was composed of 46 dogs in which biopsy was performed by fine needle aspiration (FNAC) in both lungs, blood sampling and radiological examination of the chest. The material obtained from a puncture was homogenized with Sabouraud dextrose liquid. Part of this homogenate was seeded on malt agar for Aspergillus spp. and taken directly on slides and stained with “Grocott”. The other party was seeded in various culture media to bacteriological examination. The material obtained in another puncture was performed cytopathological examination with “Panótico” coloring. Serum obtained from blood collected was performed for serology to A. fumigatus, A. flavus and A. niger. The results of mycological examination, cytology, bacteriology and serology examinations were negative for all samples tested. In the absence of positive tests, it was not possible to correlate fungal pneumonia with radiological images obtained from the lungs of the 46 dogs radiographed. Most dogs live in open areas in contact with organic matter where the fungus is usually found. Tests to detect fungi should be analyzed with caution, because a positive result in a single test does not confirm the presence of infection, since the agent can be present normally in the upper respiratory tract of dogs.

Infecções fúngicas invasivas têm emergido como causa de alta morbimortalidade entre pacientes com neoplasia hematológicas, principalmente os submetidos a transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH). Fungos estão onipresentes na natureza, logo, medidas com o objetivo de reduzir a carga fúngica em ambientes hospitalares têm sido preconizadas. No presente estudo, foi realizada coleta de fungos no ar em dois centros de referência em TCTH do sul do Brasil, que possuem instalações distintas, assim como diferentes formas de controle de ar. Todos os quartos do hospital 2 são equipados com filtro de partículas de ar de alta eficiência (HEPA), enquanto no hospital 1 não há sistema específico de filtragem do ar; além disso, os pacientes internados no hospital 2 são de maior risco para doença fúngica invasiva, em função de fatores relacionados ao hospedeiro. Foram realizadas 130 coletas de ar no período de dezembro de 2009 a janeiro de 2011, sendo as amostras provenientes de quartos, banheiros e corredor. Para fins de análise, os fungos pertencentes ao gênero Aspergillus, Rhizopus e Fusarium foram considerados como fungos filamentosos potencialmente patogênicos, enquanto os demais fungos foram classificados como ambientais. A comparação entre os corredores dos hospitais 1 e 2 não mostrou diferença quanto a quantidade de fungos isolados (p=0,114 para fungos ambientais e p=0,622 para fungos filamentosos potencialmente patogênicos). Já os quartos de ambos os hospitais apresentaram redução significativa na quantidade de fungos filamentosos potencialmente patogênicos, quando comparados com os corredores (p<0,0001). Comparando-se os quartos dos hospitais 1 e 2, observou-se menor quantidade de fungos ambientais no hospital 2 (p<0,0001); contudo, para fungos filamentosos potencialmente patogênicos não se encontrou diferença (p=0,7145). Durante o período de estudo, a incidência de doença fúngica invasiva por fungos filamentosos foi de 2,1% no hospital 1 e 7,6% no hospital 2. A baixa carga fúngica nos quartos do hospital 1 poderia ser explicadas pelo uso de medidas protetoras adicionais, incluindo janelas e portas fechadas, reforçando-se a importância de tais medidas no cuidados em ambientes protegidos. / Invasive fungal infections have emerged as a cause of high morbidity and mortality among patients with hematologic malignancies, especially among those undergoing hematopoietic stem cell transplantation. Fungi are ubiquitous in nature, therefore measures aimed at reducing fungal burden in hospitals have been emphasized. In this study air samples were collected in two HSCT centers in Southern Brazil, which have distinct facilities, as well diferent air control systems. All rooms of hospital 2 are equipped with HEPA filters. In addition, patients hospitalized in this unit are at a higher risk for invasive fungal diseases. A total of 130 samples were obtained during December 2009 to January 2011 from rooms, restrooms and corridors. For analysis, all fungi belonging to the genus Aspergillus, Rhizopus and Fusarium were considered filamentous fungi potentially pathogenic, while others were considered environmental fungi. The comparison between corridors of hospital 1 and 2 showed no difference in fungal concentration (p=0.114 for environmental fungi and p=0.622 for potentially pathogenic). The rooms of both hospitals showed a significant lower concentration in PPF, as compared to corridors (p<0.0001). Comparing rooms of hospital 1 e 2 there was a lower amount of environmental fungi in hospital 2 (p<0.0001) – however no difference was observed for potentially pathogenic (p=0.714). During the period of study, the incidence of invasive mold infection was 2.1% in hospital 1 and 7.6% in hospital 2. The low fungal burden in rooms in hospital 1 may be explained by the implementation of additional protective measures, emphasizing the importance of such measures in protected environments.

O Platelia® Aspergillus EIA é um teste de ELISA sanduíche para diagnóstico precoce de aspergilose em pacientes neutropênicos que se baseia na detecção de um antígeno (galactomanana) da parede celular de Aspergillus spp. O trabalho objetivou avaliar a eficácia deste teste em outros hospedeiros suscetíveis à aspergilose e ainda, avaliar a interferência de potenciais falso-positivos no Platelia® Aspergillus EIA, como outras micoses sistêmicas e um antimicrobiano produzido a partir de fungos (piperacilina-tazobactam). Quatro experimentos foram realizados para contemplar os objetivos propostos. Amostras de lavado broncoalveolar de 60 pacientes transplantados de pulmão provenientes da Santa-Casa Complexo Hospitalar de Porto Alegre foram colhidas durante um período de aproximadamente 2 anos e testadas para detecção de galactomanana. Os pacientes foram classificados em aspergilose comprovada, provável e possível, colonização ou exame de vigilância de acordo com critérios do EORTC. Utilizando os casos comprovados (5) e prováveis (6) como positivos, foi calculada a curva ROC que demonstrou valores de sensibilidade de 90,9% e especificidade de 90,6% em um ponto de corte de 1,5. A eficácia do Platelia® Aspergillus EIA foi avaliada também em pingüins em cativeiro. Soros de 35 animais foram incluídos no estudo, 9 com aspergilose, 3 com malária, 2 com caquexia e 21 saudáveis. Os soros foram testados por imunodifusão dupla e ELISA sanduíche, resultando em valores de sensibilidade de 33% e 100% e especificidade de 96% e 0, respectivamente. A reação cruzada de outras micoses sistêmicas no Platelia® Aspergillus EIA foi avaliada a partir de 120 amostras de soro de pacientes com paracoccidioidomicose, histoplasmose, criptococose por Cryptococcus neoformans e criptococose por C. gattii. Todas as micoses foram responsáveis por resultados falso-positivos no ELISA sanduíche, sendo de 50%, 67%, 66% e 36,6% a taxa de positividade de cada micose, respectivamente. Em adição, 5 lotes de piperacilina-tazobactam foram testados em concentração de uso clínico (45mg/ml) para avaliação de interferência no Platelia® Aspergillus EIA. Destas, apenas uma resultou em valores maiores do que o ponto de corte (0,5), sendo submetida a sucessivas diluições até mimetizar concentrações plasmáticas do fármaco alcançáveis no soro humano, as quais resultaram em valores menores que 0,5, sendo consideradas negativas. Concluindo, utilizando um ponto de corte maior do que indicado pelo fabricante para uso em neutropênicos, a eficácia do teste foi comprovada para utilização em amostras de lavado broncoalveolar de pacientes transplantados de pulmão. Por outro lado, no hospedeiro animal testado, pingüins, o teste apresentou especificidade nula, não possuindo aplicabilidade como ferramenta diagnóstica para aspergilose neste grupo. Quanto aos fatores de interferência no Platelia® Aspergillus EIA avaliados, a alta taxa de resultados falso-positivos referentes à infecção por outras micoses sistêmicas reflete na necessidade de interpretar um teste positivo dentro do contexto epidemiológico do paciente. Por outro lado, as piperacilinas-tazobactam disponíveis no mercado brasileiro não interferiram no resultado do Platelia® Aspergillus EIA. No entanto como a variabilidade de galactomanana existe entre lotes, ainda é aconselhável que as amostras para realização do ELISA sanduíche sejam colhidas antes da próxima administração do fármaco. / Platelia® Aspergillus EIA is a sandwich ELISA to the diagnostic of aspergillosis in neutropenic patients. It detects an antigen (galactomannan) from Aspergillus cell wall. Here it was evaluated the performance of this test in other susceptible hosts and the interference of potentials false-positives factors in Platelia® Aspergillus EIA. Systemic mycosis and an antimicrobial produced from molds (piperacillin-tazobactam) were tested. Four experiments were executed to study conduce. Bronchoalveolar samples from 60 lung transplant recipients from Santa Casa-Complexo Hospitalar de Porto Alegre were collected during almost two years and tested for galactomannan detection. Patients were classified in proven, probable or possible aspergillosis according to EORTC criteria, or in colonization or surveillance. Considering proven (5) and probable (6) as true positive cases, ROC curve was calculated and showed 90.9% of sensitivity and 90.6% of specificity with 1.5 as optimal cutoff. Platelia® Aspergillus EIA efficacy was also tested in captive penguins. Sera from 35 animals were included in the study, 9 with aspergillosis, 3 with malaria, 2 with cachexia and 21 healthy. Samples were tested by double immunodiffusion and sandwich ELISA, resulting in sensitivity values of 33% and 100% and specificity of 96% and 0, respectively. Cross reaction in Platelia® Aspergillus EIA was evaluated with 120 serum samples of patients with paracocciddioidomicosis, histoplasmosis, criptococosis due to Cryptococcus neoformans and criptococosis due to C. gattii. False-positive results were observed in all mycosis, with rates of 50%, 67%, 66% and 36,6%, respectively. In addition, 5 piperacillin-tazobactam batches were tested, in a concentration of clinical use (45mg/ml), to evaluate it interference in Platelia® Aspergillus EIA. Those, only one showed positive value, and had been retest after serial dilutions until plasmatic concentration, resulting in value lower than 0.5, negative. In conclusion, with a higher cut-off than the indicated from the manufacturer, the efficacy of bronchoalveolar samples tested in Platelia® Aspergillus EIA for the diagnostic of aspergillosis in lung transplant recipients was proved. Controversially, in penguins, the test specificity was zero, showing non applicability as a diagnostic method for aspergillosis in this group of risk. Interference in Platelia® Aspergillus EIA due to other systemic mycoses shows the necessity to interpret a positive result after the evaluation of patient epidemiologic context. Finally, piperacillin-tazobactam available in the Brazilian market did not correspond to false-positive results in Platelia® Aspergillus EIA. However, given that variability occurs between distinct batches, still is indicating to collect samples for galactomannan detection before the next administration of the drug.

Descrição: A rinossinusite fúngica (RSF) é uma infecção oportunística, caracterizada pela inflamação da mucosa nasal e dos seios paranasais. É considerada um problema emergente na clínica médica diária, com prevalência aumentada nas últimas décadas, com etiologia nos mais diversos fungos ubíquos. Objetivos: Este trabalho objetivou analisar todos os casos de RSF pertencentes ao banco de dados do Laboratório de Micologia da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, no período de 28 anos (1986-2014), relacionando-os com as características clínicas e epidemiológicas. Materiais e métodos: O estudo foi retrospectivo observacional, resultando em uma série de 82 casos, confirmados histopatologicamente e pelos exames micológicos para identificação de fungos, comparados-os com os achados nas imagens radiológicas. Resultados: Foram identificados 54 casos de RSF por aspergilose, com predominância do agente etiológico Aspergillus fumigatus (14/54), e 27 casos de RSF por fungos diferentes do gênero Aspergillus, com superioridade de isolamento de agentes responsáveis por hialohifomicoses (12/27). Configurado, nestes achados, o ineditismo de três casos em nosso meio, com destaque para o primeiro caso de RSF e infecção humana por Trichoderma asperellum. Conclusões: Estes achados representam a maior casuística brasileira identificada, podendo contribuir para uma melhor compreensão epidemiológica, melhorando os critérios de suspeição médica, refletindo na efetividade dos tratamentos, principalmente, no diagnóstico dos casos de RSF invasiva, com altas taxas de mortalidade. / Description: The fungal rhinosinusitis (FRS) is an opportunistic infection characterized by inflammation of the nasal mucosa and sinuses. It is considered an emerging problem in daily medical practice, with prevalence increased in recent decades, with etiology in diverse ubiquitous fungi. Objectives: This study aimed to analyze all cases of RSF belonging to the Mycology Laboratory of the database of the Brotherhood of the Santa Casa of Misericordia Porto Alegre during the period of 28 years (1986-2014), relating them with the clinical and epidemiological characteristics. Methods: The study was observational retrospective, resulting in a series of 82 cases confirmed by histopathological and mycological examinations for identification of fungi, compared them with the findings on radiographs. Results: We identified 54 cases of aspergillosis by RSF, especially the etiologic agent Aspergillus fumigatus (14/54), and 27 cases of RSF different fungi Aspergillus, with insulation superiority of agents responsible for hyalohyphomycosis (12/27). Configured, these findings, the three cases unprecedented in our country, especially the first case of human infection with RSF and Trichoderma asperellum. Conclusions: These findings represent the largest identified Brazilian series and can contribute to a better epidemiological understanding, improving clinical suspicion criteria, reflecting the effectiveness of treatments, mainly in diagnosing cases of invasive RSF, with high mortality rates.

O objetivo deste estudo foi avaliar os achados na tomografia computadorizada de alta resolução (TCAR) de pacientes transplantados de pulmão diagnosticados com infecção pulmonar por Aspergillus. Foram revisados retrospectivamente os exames de TCAR de 23 pacientes diagnosticados com aspergilose. Os exames de imagem foram realizados entre 2-5 dias após o início dos sintomas. A amostra de pacientes incluiu 12 homens e 11 mulheres com idades entre 22-59 anos (idade média: 43,6 anos). Todos os pacientes apresentaram taquipnéia, dispnéia e tosse. O diagnóstico foi estabelecido com o ensaio imunoenzimático (Platelia Aspergillus) para a detecção do antígeno galactomanana no lavado broncoalveolar e recuperação dos sintomas e dos achados de TCAR após tratamento com voriconazol. As TCAR foram analisadas independentemente por dois observadores que chegaram a uma decisão em consenso. O principal padrão na TCAR encontrado foi o de nódulos centrolobulares com padrão de árvore-em-brotamento associados com espessamento de paredes brônquicas que foi visualizado em 65% (n=15) dos pacientes. Este padrão foi descrito em associação com áreas de consolidação e opacidades em vidro-fosco em 13% (n=3) dos pacientes. Consolidação e opacidades em vidro-fosco foi o padrão principal em 22% (n=5) dos pacientes. O padrão de nódulos grandes com e sem o sinal do halo foi observado em 13% (n=3) dos pacientes e, em um caso, esteve associado com consolidação e opacidades em vidro-fosco. Conclui-se que os achados predominantes na TCAR em pacientes transplantados de pulmão com aspergilose foram espessamento de paredes brônquicas e opacidades centrolobulares com padrão de árvore-em-brotamento bilateralmente. Além disso, opacidades em vidro-fosco e / ou áreas de consolidação bilaterais foram achados comuns. Os nódulos com o sinal do halo foram encontrados em apenas 13% dos pacientes. / The aim of this study was to assess high-resolution computed tomographic (HRCT) findings at presentation in lung transplant patients diagnosed with pulmonary Aspergillus infection. We retrospectively reviewed HRCT findings from 23 patients diagnosed with pulmonary aspergillosis. Imaging studies were performed 2–5 days after the onset of symptoms. The patient sample comprised 12 men and 11 women aged 22–59 years (mean age, 43.6 years). All patients had dyspnea, tachypnea, and cough. Diagnoses were established with Platelia Aspergillus enzyme immunoassays for galactomannan antigen detection in bronchoalveolar lavage and recovery of symptoms, and HRCT findings after voriconazole treatment. The HRCT scans were reviewed independently by two observers who reached a consensus decision. The main HRCT pattern, found in 65% (n = 15) of patients, was centrilobular tree-in-bud nodules associated with bronchial thickening. This pattern was described in association with areas of consolidation and ground-glass opacities in 13% (n = 3) of patients. Consolidation and ground-glass opacities were the main pattern in 22% (n = 5) of patients. The pattern of large nodules with and without the halo sign was observed in 13% (n = 3) of patients, and were associated with consolidation and ground-glass opacities in one case. In conclusion, the predominant HRCT findings in lung transplant patients with pulmonary aspergillosis were bilateral bronchial wall thickening and centrilobular opacities with the tree-in-bud pattern. Ground-glass opacities and/or bilateral areas of consolidation were also common findings. Pulmonary nodules with the halo sign were found in only 13% of patients.

O Platelia® Aspergillus EIA é um teste de ELISA sanduíche para diagnóstico precoce de aspergilose em pacientes neutropênicos que se baseia na detecção de um antígeno (galactomanana) da parede celular de Aspergillus spp. O trabalho objetivou avaliar a eficácia deste teste em outros hospedeiros suscetíveis à aspergilose e ainda, avaliar a interferência de potenciais falso-positivos no Platelia® Aspergillus EIA, como outras micoses sistêmicas e um antimicrobiano produzido a partir de fungos (piperacilina-tazobactam). Quatro experimentos foram realizados para contemplar os objetivos propostos. Amostras de lavado broncoalveolar de 60 pacientes transplantados de pulmão provenientes da Santa-Casa Complexo Hospitalar de Porto Alegre foram colhidas durante um período de aproximadamente 2 anos e testadas para detecção de galactomanana. Os pacientes foram classificados em aspergilose comprovada, provável e possível, colonização ou exame de vigilância de acordo com critérios do EORTC. Utilizando os casos comprovados (5) e prováveis (6) como positivos, foi calculada a curva ROC que demonstrou valores de sensibilidade de 90,9% e especificidade de 90,6% em um ponto de corte de 1,5. A eficácia do Platelia® Aspergillus EIA foi avaliada também em pingüins em cativeiro. Soros de 35 animais foram incluídos no estudo, 9 com aspergilose, 3 com malária, 2 com caquexia e 21 saudáveis. Os soros foram testados por imunodifusão dupla e ELISA sanduíche, resultando em valores de sensibilidade de 33% e 100% e especificidade de 96% e 0, respectivamente. A reação cruzada de outras micoses sistêmicas no Platelia® Aspergillus EIA foi avaliada a partir de 120 amostras de soro de pacientes com paracoccidioidomicose, histoplasmose, criptococose por Cryptococcus neoformans e criptococose por C. gattii. Todas as micoses foram responsáveis por resultados falso-positivos no ELISA sanduíche, sendo de 50%, 67%, 66% e 36,6% a taxa de positividade de cada micose, respectivamente. Em adição, 5 lotes de piperacilina-tazobactam foram testados em concentração de uso clínico (45mg/ml) para avaliação de interferência no Platelia® Aspergillus EIA. Destas, apenas uma resultou em valores maiores do que o ponto de corte (0,5), sendo submetida a sucessivas diluições até mimetizar concentrações plasmáticas do fármaco alcançáveis no soro humano, as quais resultaram em valores menores que 0,5, sendo consideradas negativas. Concluindo, utilizando um ponto de corte maior do que indicado pelo fabricante para uso em neutropênicos, a eficácia do teste foi comprovada para utilização em amostras de lavado broncoalveolar de pacientes transplantados de pulmão. Por outro lado, no hospedeiro animal testado, pingüins, o teste apresentou especificidade nula, não possuindo aplicabilidade como ferramenta diagnóstica para aspergilose neste grupo. Quanto aos fatores de interferência no Platelia® Aspergillus EIA avaliados, a alta taxa de resultados falso-positivos referentes à infecção por outras micoses sistêmicas reflete na necessidade de interpretar um teste positivo dentro do contexto epidemiológico do paciente. Por outro lado, as piperacilinas-tazobactam disponíveis no mercado brasileiro não interferiram no resultado do Platelia® Aspergillus EIA. No entanto como a variabilidade de galactomanana existe entre lotes, ainda é aconselhável que as amostras para realização do ELISA sanduíche sejam colhidas antes da próxima administração do fármaco. / Platelia® Aspergillus EIA is a sandwich ELISA to the diagnostic of aspergillosis in neutropenic patients. It detects an antigen (galactomannan) from Aspergillus cell wall. Here it was evaluated the performance of this test in other susceptible hosts and the interference of potentials false-positives factors in Platelia® Aspergillus EIA. Systemic mycosis and an antimicrobial produced from molds (piperacillin-tazobactam) were tested. Four experiments were executed to study conduce. Bronchoalveolar samples from 60 lung transplant recipients from Santa Casa-Complexo Hospitalar de Porto Alegre were collected during almost two years and tested for galactomannan detection. Patients were classified in proven, probable or possible aspergillosis according to EORTC criteria, or in colonization or surveillance. Considering proven (5) and probable (6) as true positive cases, ROC curve was calculated and showed 90.9% of sensitivity and 90.6% of specificity with 1.5 as optimal cutoff. Platelia® Aspergillus EIA efficacy was also tested in captive penguins. Sera from 35 animals were included in the study, 9 with aspergillosis, 3 with malaria, 2 with cachexia and 21 healthy. Samples were tested by double immunodiffusion and sandwich ELISA, resulting in sensitivity values of 33% and 100% and specificity of 96% and 0, respectively. Cross reaction in Platelia® Aspergillus EIA was evaluated with 120 serum samples of patients with paracocciddioidomicosis, histoplasmosis, criptococosis due to Cryptococcus neoformans and criptococosis due to C. gattii. False-positive results were observed in all mycosis, with rates of 50%, 67%, 66% and 36,6%, respectively. In addition, 5 piperacillin-tazobactam batches were tested, in a concentration of clinical use (45mg/ml), to evaluate it interference in Platelia® Aspergillus EIA. Those, only one showed positive value, and had been retest after serial dilutions until plasmatic concentration, resulting in value lower than 0.5, negative. In conclusion, with a higher cut-off than the indicated from the manufacturer, the efficacy of bronchoalveolar samples tested in Platelia® Aspergillus EIA for the diagnostic of aspergillosis in lung transplant recipients was proved. Controversially, in penguins, the test specificity was zero, showing non applicability as a diagnostic method for aspergillosis in this group of risk. Interference in Platelia® Aspergillus EIA due to other systemic mycoses shows the necessity to interpret a positive result after the evaluation of patient epidemiologic context. Finally, piperacillin-tazobactam available in the Brazilian market did not correspond to false-positive results in Platelia® Aspergillus EIA. However, given that variability occurs between distinct batches, still is indicating to collect samples for galactomannan detection before the next administration of the drug.

Descrição: A rinossinusite fúngica (RSF) é uma infecção oportunística, caracterizada pela inflamação da mucosa nasal e dos seios paranasais. É considerada um problema emergente na clínica médica diária, com prevalência aumentada nas últimas décadas, com etiologia nos mais diversos fungos ubíquos. Objetivos: Este trabalho objetivou analisar todos os casos de RSF pertencentes ao banco de dados do Laboratório de Micologia da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, no período de 28 anos (1986-2014), relacionando-os com as características clínicas e epidemiológicas. Materiais e métodos: O estudo foi retrospectivo observacional, resultando em uma série de 82 casos, confirmados histopatologicamente e pelos exames micológicos para identificação de fungos, comparados-os com os achados nas imagens radiológicas. Resultados: Foram identificados 54 casos de RSF por aspergilose, com predominância do agente etiológico Aspergillus fumigatus (14/54), e 27 casos de RSF por fungos diferentes do gênero Aspergillus, com superioridade de isolamento de agentes responsáveis por hialohifomicoses (12/27). Configurado, nestes achados, o ineditismo de três casos em nosso meio, com destaque para o primeiro caso de RSF e infecção humana por Trichoderma asperellum. Conclusões: Estes achados representam a maior casuística brasileira identificada, podendo contribuir para uma melhor compreensão epidemiológica, melhorando os critérios de suspeição médica, refletindo na efetividade dos tratamentos, principalmente, no diagnóstico dos casos de RSF invasiva, com altas taxas de mortalidade. / Description: The fungal rhinosinusitis (FRS) is an opportunistic infection characterized by inflammation of the nasal mucosa and sinuses. It is considered an emerging problem in daily medical practice, with prevalence increased in recent decades, with etiology in diverse ubiquitous fungi. Objectives: This study aimed to analyze all cases of RSF belonging to the Mycology Laboratory of the database of the Brotherhood of the Santa Casa of Misericordia Porto Alegre during the period of 28 years (1986-2014), relating them with the clinical and epidemiological characteristics. Methods: The study was observational retrospective, resulting in a series of 82 cases confirmed by histopathological and mycological examinations for identification of fungi, compared them with the findings on radiographs. Results: We identified 54 cases of aspergillosis by RSF, especially the etiologic agent Aspergillus fumigatus (14/54), and 27 cases of RSF different fungi Aspergillus, with insulation superiority of agents responsible for hyalohyphomycosis (12/27). Configured, these findings, the three cases unprecedented in our country, especially the first case of human infection with RSF and Trichoderma asperellum. Conclusions: These findings represent the largest identified Brazilian series and can contribute to a better epidemiological understanding, improving clinical suspicion criteria, reflecting the effectiveness of treatments, mainly in diagnosing cases of invasive RSF, with high mortality rates.

Aspergilose é uma das principais causas de mortalidade em aves imunocompetentes e imunodeprimidas. A manifestação clínica aguda da doença é geralmente observada em aves jovens, com episódios de surtos em aviários, enquanto a forma crônica é mais frequentemente observada em aves adultas. A inspeção das carcaças é fundamental para a detecção e monitoramento da prevalência de doenças. Os objetivos do trabalho foram avaliar a ocorrência de aspergilose causada por Aspergillus fumigatus em aves comerciais através do diagnóstico micológico e histopatológico e verificar a possibilidade de associação causal entre os critérios de diagnóstico de aspergilose e condenação por aerossaculite em frangos de corte através de um estudo de casocontrole. O estudo foi realizado com 380 amostras pulmonares. Foram coletados pulmões de frangos condenados (95) por aerossaculite e não condenados (285), diretamente na linha de abate de um frigorífico. Quarenta e seis (12%) amostras de pulmão foram positivas na cultura micológica. Do total de amostras, 177 (46,6%) apresentaram alterações histopatológicas, sendo as mais frequentes pneumonia fibrinoheterofílica necrótica, pneumonia heterofílica e hiperplasia linfóide. Do total de 380 pulmões analisados, 30 (65,2%) apresentaram concomitantemente alterações histopatológicas e isolamento fúngico. A relação entre a presença de lesões histopatológicas e isolamento de A. fumigatus testada por McNemar indicou que houve associação significativa entre a presença de alterações histopatológicas e o isolamento de A. fumigatus. A identificação molecular foi realizada em 44 isolados, sendo todos confirmados como sendo A. fumigatus através dos genes b-tub e rodA. O cultivo micológico e o exame histopatológico aumentam as chances de se detectar alterações pulmonares em aves condenadas pelo Sistema de Inspeção Final do que nas aves normais, sugerindo que tais critérios de diagnóstico são eficazes para aprimorar a avaliação e condenação de aves por aerossaculite. O perfil genético entre os isolados foi variado, mostrando que isolados de aves normais podem ser potencialmente causadores de aspergilose em aves suceptíveis. / Aspergillosis is one of the main causes of mortality in both immunocompetent and immunodepressed birds. The clinical manifestation of acute aspergillosis is usually observed in young birds, often with episodes of outbreaks in poultry farms, whereas chronic aspergillosis is more frequently observed in adult birds. The inspection of carcasses is fundamental for the detection of diseases and for monitoring their prevalence. The objectives of this study were to evaluate the occurrence of aspergillosis caused by Aspergillus fumigatus in poultry through mycological and histopathological diagnosis and to verify the possibility of a causal association between the criteria for aspergillosis diagnosis and carcass condemnation due to airsacculitis in broilers through a case-control study. The study was made with 380 lung samples. Lungs were collected from condemned (95) and not condemned (285) broilers due to airsacculitis, directly from the slaughter line of a slaughterhouse. Forty-six (12%) lung samples were positives in mycological culture. From the total samples, 177 (46.6%) showed histopathological alterations, the most frequent being necrotic, fibrinous, heterophilic pneumonia, heterophilic pneumonia and lymphoid hyperplasia. Of the 380 lungs analyzed, 30 (65.2%) showed histopathological alterations and isolation of fungi. The relation between the presence of histopathological lesions and the isolation of A. fumigatus, as observed with the McNemar test, indicated the significant association between the presence of histopathological alterations and the isolation of A. fumigatus.The molecular identification was made in 44 isolates, and all of them were confirmed to be A. fumigatus through analysis of the b-tub and rodA. The mycological cultivation and the histopathological test increase the chances of detecting pulmonary alterations in birds condemned by the Final Inspection System than in normal birds, suggesting that such diagnostic criteria are efficient to improve the assessment and condemnation of birds affected by airsacculitis. There were different genetic profiles among the isolates, which shows that isolates obtained from normal birds can potentially cause aspergillosis in those susceptible.