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Compte tenu de ses aspects multiples, de sa dangerosité potentielle et du taux de<p>survie considérablement bas qui lui est associé dans ses formes les plus graves, l’aspergillose<p>pulmonaire est encore à l’heure actuelle dévastatrice sur le plan clinique. L’approche<p>médicamenteuse conventionnelle consiste en l’administration par voie orale ou<p>intraveineuse (IV) d’agents antifongiques. Ces voies classiques requièrent l’administration de<p>doses très élevées qui sont nécessaires à l’obtention de concentrations systémiques<p>suffisantes pour obtenir un effet thérapeutique au niveau pulmonaire. Cependant, ces<p>concentrations systémiques sont également la cause d’effets secondaires indésirables et<p>d’interactions médicamenteuses importantes. Une alternative thérapeutique à ces voies<p>classiques serait de localiser ces antifongiques dans le poumon, en utilisant la voie inhalée.<p>Cela permettrait d’augmenter le taux de succès thérapeutique en déposant et en<p>concentrant directement la dose au niveau du site d’infection tout en minimisant les<p>concentrations systémiques.<p>Pour ce faire, nous avons choisi de développer des poudres sèches pour inhalation à<p>base d’itraconazole (ITZ), un antifongique actif à l’égard des souches d’aspergillus. Celles-ci<p>sont administrable via un inhalateur à poudre sèche pour les avantages que présente ce<p>mode d’administration comparativement aux nébuliseurs et aux inhalateurs pressurisés. Le<p>développement des formulations implique entre autres l’obtention de caractéristiques<p>aérodynamiques appropriées, c’est-à-dire, ayant, après décharge à partir d’un dispositif<p>d’inhalation, un profil de déposition pulmonaire permettant d’atteindre des doses<p>pulmonaires pharmacologiquement efficaces. Toutefois, l’ITZ présente une solubilité<p>aqueuse extrêmement faible (solubilité aqueuse à pH 7 ~ 4 ng/ml à 25°C). Or, une fois<p>déposée dans le poumon, la dose inhalée doit se solubiliser pour exercer son action<p>pharmacologique. Nous avons donc inclus dans les concepts de formulation, une stratégie<p>permettant l’amélioration du profil de dissolution et l’augmentation de la solubilité de l’ITZ.<p>Cela permettrait en effet d’en potentialiser au maximum l’action pharmacologique au sein<p>des lésions fongiques avant qu'il ne soit éliminé sous sa forme non dissoute par les<p>mécanismes de clairance non absorptifs du poumon. De plus, le poumon étant un organe ne<p>tolérant qu’un nombre limité de substances administrables par inhalation, nous nous<p>sommes focalisés sur l’utilisation d’excipients présentant un faible potentiel toxique ou bien<p>tolérés après inhalation. Enfin, nous avons gardé à l’esprit lors du développement des procédés de fabrication qu’ils pouvaient être sujets à la mise à l’échelle industrielle. Nous<p>avons donc privilégié des procédés de fabrication simples incluant des technologies<p>transposables telles que l’atomisation par la chaleur et l’homogénéisation à haute pression.<p>Une attention particulière lors de la caractérisation des poudres a été portée sur les<p>propriétés d’écoulement des formulations, toujours dans l’optique de faciliter une<p>potentielle future manutention à plus grande échelle.<p>Pour répondre à ces critères, durant la première partie de ce travail, nous avons<p>imaginé deux concepts de formulation qui ont pour but de former des microparticules de<p>mannitol dans lesquelles est dispersé l’ITZ sous forme « modifiée ».<p>Le premier concept de formulation qui a été développé consistait à former une<p>dispersion solide (DS) entre l’ITZ, si possible amorphe pour en augmenter la solubilité, et un<p>agent matriciel en utilisant le procédé d’atomisation par la chaleur d’une solution contenant<p>tous les ingrédients sous forme dissoute. Lors de tests préliminaires, nous avons évalué trois<p>types d’agents matriciels, deux agents hydrophiles (le mannitol et le lactose) et un agent<p>hydrophobe (le cholestérol). Sur base de la faisabilité, des résultats préliminaires de<p>solubilité, de dissolution et de déposition pulmonaire in vitro, le mannitol a été retenu.<p>Après une optimisation des conditions d’atomisation, les formulations ont été produites en<p>vue d’être caractérisées. Il a été observé, par diffraction de rayons X sur poudre (PXRD) et<p>par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), qu’après atomisation, l’ITZ était obtenu sous<p>forme amorphe et le mannitol sous forme cristalline. Les tests d’évaluation des propriétés<p>aérodynamiques ont été réalisés à l’aide d’un impacteur liquide multi-étages (MsLI) en<p>suivant les recommandations pratiques de la Pharmacopée européenne. Ce type de<p>compositions, atomisées dans les conditions optimales, permettait d’obtenir des poudres<p>sèches présentant les caractéristiques de taille (diamètre médian < 5 μm, mesuré par<p>diffraction laser) et les propriétés aérodynamiques appropriées à l’administration<p>pulmonaire (fraction de particules fines (FPF) déterminées lors des tests d’impaction<p>comprises entre 40 % et 70 %). La formation d’une DS avec le mannitol était nécessaire afin<p>d’augmenter la solubilité et d’accélérer la cinétique de dissolution de l’ITZ comparativement<p>à son homologue micronisé sous forme cristalline ou encore à sa forme amorphe atomisée<p>sans mannitol. Par exemple, dans sa configuration amorphe atomisée sans excipient ou sous<p>sa forme cristalline initiale, l’ITZ présentait une solubilité à saturation (mesurée dans un tampon phosphate contenant 0,02% de dipalmytoyl phosphatidyl choline) inférieure à 10<p>ng/ml. Après formation d’une DS avec le mannitol suivant notre procédé de formulation,<p>nous sommes parvenus à des valeurs de solubilité atteignant 450 ng/ml. Il s’est avéré que<p>l’ajout à la composition d’un surfactant, le tocopherol polyethylène glycol 1000 succinate<p>(TPGS), permettait d’accélérer la cinétique de dissolution du principe actif. Toutefois,<p>l’utilisation du TPGS induisait une diminution des performances aérodynamiques des<p>formulations. Etant donné que cette augmentation de la cinétique de dissolution pouvait<p>être un avantage après administration pulmonaire, nous avons considéré un autre type de<p>surfactant, les phospholipides (PL). L’utilisation de la lécithine de soja hydrogéné s’est<p>révélée être très efficace. Les performances aérodynamiques des formulations ont été<p>préservées et même améliorées. Leur incorporation à la DS permettait également d’obtenir<p>une accélération du profil de dissolution de l’ITZ. De plus, l’augmentation de la quantité de<p>PL dans nos formulations, dans la gamme des concentrations utilisées, était corrélée avec<p>une amélioration d’autant plus marquée du profil de dissolution de l’ITZ. En outre, les<p>solubilités de l’ITZ en présence de PL furent considérablement améliorées avec, par<p>exemple, des concentrations mesurées de 870 ng/ml et 1342 ng/ml pour les formulations<p>contenant respectivement 10 % (m/mpoudre) et 35 % (m/mpoudre) d’ITZ, ainsi que 10 % de PL<p>exprimés par rapport à la quantité d’ITZ.<p>Le deuxième concept de formulation développé consistait à produire des<p>microparticules de mannitol dans lesquelles étaient dispersées des nanoparticules (NP)<p>cristallines d’ITZ. Le procédé de fabrication était le suivant. Une suspension de nanocristaux<p>d’ITZ produite par homogénéisation à haute pression (HPH) était re-suspendue dans une<p>solution de mannitol qui était par la suite atomisée pour obtenir les microparticules de<p>poudres sèches. Après optimisation des conditions d’homogénéisation, nous sommes<p>parvenus à produire des nanosuspensions d’ITZ dont les particules présentaient un diamètre<p>médian inférieur à 250 nm. Nous avons alors évalué l’influence qu’avait l’ajout du mannitol<p>et du taurocholate sodique sur l’état d’agrégation des NP avant l’étape d’atomisation et sur<p>les performances des formulations sous forme sèche. Il a été observé que l’ajout de<p>mannitol était nécessaire à la production de solutions sursaturées en ITZ avec une solubilité<p>maximale d’ITZ mesurées à 96 ng/ml dans le tampon phosphate précédemment cité. L’ajout<p>de mannitol s’est avéré nécessaire afin de minimiser le phénomène d’agrégation des NP durant l’étape d’atomisation. De plus, l’ajout de taurocholate de sodium permettait<p>également d’inhiber leur agrégation. La cristallinité des NP d’ITZ a été confirmée par PXRD et<p>DSC. Ce type de formulation présentait des tailles et des performances aérodynamiques<p>compatibles à l’administration pulmonaire (tailles des particules < 5 μm et FPF entre 35 % et<p>46 %). Néanmoins, comparativement aux DS précédemment décrites, ces formulations à<p>base de NP s’avèrent sensiblement moins performantes. En effet, au niveau des<p>caractéristiques aérodynamiques, les formulations à base de NP présentent des FPF<p>nettement inférieures à celles obtenues pour les DS (FPF de ~40 % pour les formulations<p>nanoparticulaires contre ~70 % pour les DS d’ITZ amorphe). De plus, à partir des<p>formulations à bases de NP, les taux de sursaturation en ITZ atteints étaient nettement<p>inférieurs à ceux obtenus avec les DS (~100 ng/ml Vs > 1000 ng/ml pour les meilleurs DS). En<p>outre, la production des nanosuspensions nécessitait l’étape supplémentaire d’un minimum<p>de 300 cycles d’homogénéisation, ce qui représente un désavantage considérable en termes<p>de rendement économique en cas de transposition à échelle industrielle comparativement à<p>l’étape unique nécessaire pour la fabrication des DS. Pour ces raisons, seules les DS ont été<p>évaluées in vivo.<p>Après la mise au point des formulations, la seconde partie de ce projet consistait à<p>évaluer les DS développés dans un système biologique complet, la souris. Nous avons en<p>premier lieu réalisé une pharmacocinétique (PK) après administration pulmonaire pour<p>déterminer l’effet de l’augmentation de la solubilité observée in vitro et de l’ajout de PL dans<p>la formulation. Ensuite, nous avons entrepris une étude d’activité sur un modèle murin<p>d’aspergillose pulmonaire invasive (API) permettant de comparer l’efficacité thérapeutique<p>ou prophylactique de nos formulations comparativement à une thérapie standard par voie<p>orale. Pour effectuer ces deux études, nous avons préalablement validé une méthode<p>d’administration des poudres sèches chez la souris à l’aide d’un insufflateur (DP-4M®, Penn<p>Century, Wyndmoor, USA) en utilisant la voie endotrachéale. Le premier point de cette<p>investigation avait pour objet de déterminer si l’intervalle de taille particulaire généré lors de<p>la décharge de nos formulations au sortir de l’insufflateur permettait une répartition<p>homogène dans les poumons ainsi qu’une pénétration profonde des particules jusqu’aux<p>alvéoles pulmonaires. Le deuxième point sur lequel nous nous sommes également attardés était la reproductibilité des doses pulmonaires générées après insufflation, facteur<p>déterminant lors de la réalisation d’une étude PK.<p>Sur base des observations constatées durant la validation du dispositif<p>d’administration, nous avons entrepris une étude PK après administration pulmonaire d’une<p>dose de 0,5 mg/kg d’ITZ, représentant une quantité inhalable par l’homme et pouvant<p>garantir des taux pulmonaires en antifongiques théoriquement adéquats. Cette étude a<p>permis de comparer les concentrations pulmonaires et plasmatiques en ITZ après<p>l’administration de poudres sèches à base d’une DS de mannitol et d’ITZ qui était soit<p>cristallin soit amorphe, avec ou sans PL. Après administration de la DS à base d’ITZ sous sa<p>forme amorphe, une augmentation de la quantité d’ITZ absorbée vers le compartiment<p>systémique a été observée. En effet, il a été observé une augmentation d’un facteur 2,7 de<p>l’aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en ITZ de 0 à 24 heures (AUC0-24h)<p>comparativement à celle obtenue après administration de la DS à base d’ITZ sous sa forme<p>cristalline. Le temps pour atteindre la concentration plasmatique maximale (tmax) était<p>également plus court pour la formulation à base ITZ sous sa forme amorphe (tmax de 10 min<p>vs 30 min pour la formulation cristalline). De plus, dans cette configuration amorphe, les<p>temps de rétention pulmonaire en ITZ étaient considérablement plus élevés (t1/2<p>d’élimination de 6,5 h pour l'ITZ cristallin vs 14 ,7 h pour l’ITZ amorphe) permettant de<p>maintenir une concentration pulmonaire en ITZ supérieure à la CMI de la souche<p>d’aspergillus la plus fréquente (A. fumigatus ;2 μg/gpoumon) pendant plus de 24h. L’ajout de<p>PL dans un rapport ITZ:PL:mannitol (1:3:97) dans la DS influençait le profil PK de l’ITZ<p>amorphe en accentuant et accélérant d’avantage la phase d’absorption initiale de l’ITZ<p>observée (Cmax et tmax plasmatique supérieur et inférieur à ceux obtenus pour l’ITZ amorphe,<p>respectivement). Toutefois, cette formulation a été éliminée plus rapidement des poumons<p>(t1/2 d’élimination pulmonaire de l’ITZ de 4,1h pour les formulations avec PL vs 14,7h sans<p>PL). Pour cette raison, nous avons décidé d’évaluer l’efficacité des formulations à base d’ITZ<p>sous forme amorphe sans phospholipides dans un modèle murin d’aspergillose pulmonaire<p>invasive (API) que nous avons développé.<p>Nous ne sommes pas parvenus à mettre en évidence un effet thérapeutique de<p>l’administration des poudres sèches administrées dans ce modèle murin neutropénique<p>d’API. Nous justifions ce manque d’activité par une agressivité du modèle trop prononcée et par l’impossibilité de pouvoir administrer de manière plus fréquente le traitement par<p>inhalation en raison de l’anesthésie nécessaire pour la procédure d’administration<p>endotrachéale. Toutefois, des essais complémentaires vont être envisagés (modification de<p>la charge fongique, administration des poudres par une tour d’inhalation, optimisation du<p>dosage et de la fréquence d’administration). En revanche, il a été mis en évidence que<p>l’administration prophylactique (début des administrations 2 jours avant l’infection) d’une<p>dose de 5 mg/kg/48h d’une DS d’ITZ amorphe augmentait significativement le taux de survie<p>de 12 jours après l’infection par A. fumigatus comparativement aux animaux non traités<p>(taux de survivants :50 % vs 0 %). A titre de comparaison, le pourcentage de survie obtenu<p>après prophylaxie quotidienne d’une dose de 12,5 mg/kg/12h de solution orale de VCZ (la<p>thérapie recommandée pour l’API) n’était que de 25 %.<p>En conclusion, les DS d’ITZ destinées à être administrées par inhalation constituent<p>une approche thérapeutique prometteuse dans le cadre de la prévention et du traitement<p>de l’aspergillose pulmonaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Invasive Pilzinfektionen stellen ein großes Problem bei Transplantatempfängern dar. Candida und Aspergillus spp. sind die häufigsten pathogenen Pilze bei Patienten nach KMT und Organtransplantationen. Diese Infektionen sind durch eine hohe Morbidität und Mortalität gekennzeichnet, insbesondere bei Patienten mit persistierender Granulozytopenie und damit jene nach allogener KMT. Die Mortalitätsrate kann durch eine Frühdiagnostik und durch Gabe einer geeigneten Therapie wesentlich reduziert werden. Die Symptome und Zeichen einer systemischen Pilzinfektion sind bei Transplantatempfängern untypisch. Die serologische Diagnostik von invasiven Candidosen oder Aspergillosen stellt eine zusätzliche Möglichkeit zur klinischen Untersuchung und anderen diagnostischen Maßnahmen dar. Diese Untersuchung umfasste 252 Patienten (17 Patienten nach KMT) und 235 Patienten von Intensivtherapiestationen (z. B. nach Organtransplantationen) in den Jahren 1991-1994 von der Humboldt-Universität zu Berlin (Charite). Die Patientenseren wurden routinemäßig auf das Vorkommen einer Candida- und Aspergillus Antigenämie geprüft. Zum Nachweis von zirkulierendem Galactomannan wurde ein Latex Agglutinationstest- Pastorex Candida und Aspergillus, Sanofi Diagnostics Pasteur, genutzt. Invasive Aspergillus-Pilzinfektionen wurden bei acht von 235 Patienten unter Intensivtherapie gefunden. Alle acht Patienten mit invasiver Aspergillose hatten einen positiven Aspergillus-Antigen-Test. Der direkte Nachweis von Antigenbestandteilen von Candida oder Aspergillus spp. erwies sich als vielversprechender frühdiagnostischer Test bei kritisch kranken und immunsupprimierten Patienten. / Invasive fungal infections are a major problem in transplant recipients. Candida and Aspergillus spp. are the most common fungal pathogens causing infection in patients undergoing BMT or solid organ transplantation. These infections are characterised by high morbidity and mortality, especially in patients with persistent granulocytopenia and in these receiving allogeneic bone marrow transplant. The mortality rate can be substantially reduced if an early diagnosis is made and the proper therapy given. The symptoms and signs of deep fungal infection in the transplant recipients are unreliable and often absent regardless of the type of organism or the site of infection. Laboratory tests are essential to establish the diagnosis of invasive fungal infection. The serological diagnosis of invasive candidosis or aspergillosis is at best an adjunct to clinical evaluation and other diagnostic procedures. The study comprises 252 patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation (17 patients) and 235 patients from intensive care units (for instance after solid organ transplantation) in the years 1991-1994 at the Humboldt-University of Berlin (Charité). The serum of the patients were routinely screened for the occurrence of Candida and Aspergillus antigenemia (circulating galactomannan was detected using a latex agglutination test-Pastorex Candida and Aspergillus, Sanofi Diagnostics Pasteur). Invasive Aspergillus fungal infection was found in eight of the 235 intensive care patients. All these eight patients with invasive aspergillosis had an positive Aspergillus antigen test. The direct detection of antigenic components of Aspergillus and Candida spp. in serum appears promising as an early diagnostic test in critical ill and immunocompromised patients.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-04-27T14:24:41Z No. of bitstreams: 1 DAIANE DE OLIVEIRA CUNHA.pdf: 2074632 bytes, checksum: 76e82c4169a9d294dcddcc8e9ad849cb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T14:24:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DAIANE DE OLIVEIRA CUNHA.pdf: 2074632 bytes, checksum: 76e82c4169a9d294dcddcc8e9ad849cb (MD5) Previous issue date: 2017-03-13 / The present dissertation was constructed in the form of scientific articles, being constituted by two articles. The first one, titled "Epidemiological evaluation of patients submitted to the serum galactomannan test with suspected Aspergillosis Invasive", aimed to evaluate the incidence of Invasive Aspergillosis in patients with hematological diseases followed at a reference hospital in Goiânia, Goiás, Brazil. Determine the main factors that contribute to the development of the disease. For this, 1367 samples of 264 patients with malignant hematological diseases treated in the Hematology Sector of Hospital Araújo Jorge, who underwent galactomannan detection, were evaluated in the period from 2013 to 2015, and were excluded patients who had no clinical data in Medical records and loss of follow-up at the hospital. Among the data obtained through the present study it was observed that the mean age was 43.7 years, where 55.5% were male. Of the total number of patients evaluated, 133 performed BMT, 38.9% of which were autologous and 17.9% of the allogeneic type. According to the classification for Invasive Aspergillosis according to the European Organization for Research and Treatment of Cancer, the disease was interpreted as proven in 7.3%, defined by culture positive for the fungus, 6.4% as probable by the detection of galactomannan in the Blood and presence of pulmonary infiltrates and 5.1% as possible by radiological alterations suggestive of Invasive Aspergillosis and galactomannan negative. The estimated / probable / probable Aspergillosis Invasive mortality rate was 61.3% and showed that the disease was significantly associated with the risk of death (p <0.0001). When considering the high mortality rate caused by the development of Aspergillosis Invasive and the fact that an early therapy promotes a significant improvement in the prognosis of patients, we conclude that the detection of galactomannan, performed as a follow-up of patients at high risk of developing the disease, can Be considered an effective method to aid in the identification of Invasive Aspergillosis. The second article entitled "Association between polymorphisms of genes encoding Dectin-1 and Toll-like cellular receptors and susceptibility to Invasive Aspergillosis", aimed to describe the polymorphisms in genes encoding Dectin-1 and Tolllike receptors, Seeking possible associations with the individual susceptibility to Invasive Aspergillosis. This study used as a methodological basis a systematic review of the literature and as a database to PubMed and PMC of the NCBI. The keywords used were: Invasive aspergillosis, polymorphism, Dectin-1 and Toll-like. From this search, 415 studies were found and according to the inclusion and exclusion criteria 8 studies were selected. With the accomplishment of this, it was verified that several are the studies that describe the single base polymorphisms with a greater susceptibility to the Invasive Aspergillosis. The major ones are in genes encoding Toll-like receptors and those that encode cytokines and chemokines (Dectin-1). Thus, it can be observed that, according to studies already carried out, there is a significant association of genetic polymorphisms with Aspergillosis Invasive, but more extensive studies must be performed to obtain more reliable results. In general, we conclude with this dissertation that the development of Invasive Aspergillosis is associated with several factors, one of them being genetic, and that, due to the high mortality rates caused by Invasive Aspergillosis, the detection of galactomannan is of fundamental importance for the Treatment of patients who are more likely to develop the disease, mainly aiding in the prognosis and early diagnosis of it. / A presente dissertação foi construída na modalidade de artigos científicos, sendo constituída por dois artigos. O primeiro, intitulado “Avaliação epidemiológica de pacientes submetidos ao teste de galactomanana sérica com suspeita de Aspergilose Invasiva”, teve como objetivo avaliar a incidência de Aspergilose Invasiva em pacientes com doenças hematológicas acompanhadas em um hospital de referência de Goiânia, Goiás, Brasil, e determinar os principais fatores que contribuem para o desenvolvimento da doença. Para isso, foram avaliadas 1367 amostras de 264 pacientes com doenças hematológicas malignas tratadas no Setor de Hematologia do Hospital Araújo Jorge, os quais realizaram exame de detecção de galactomanana, no período de 2013 a 2015, e foram excluídos pacientes que não possuíam dados clínicos em prontuários e com perda de seguimento no hospital. Dentre os dados alcançados por meio do presente estudo observou-se que a média de idade foi de 43,7 anos, onde 55,5% eram pertencentes ao sexo masculino. Do total de pacientes avaliados, 133 realizaram TMO, sendo que 38,9% eram do tipo autólogo e 17,9% do tipo alogênico. De acordo com a classificação para Aspergilose Invasiva conforme a European Organization for Research and Treatment of Cancer, a doença foi interpretada como comprovada em 7,3%, definida por cultura positiva para o fungo, 6,4% como provável pela detecção de galactomanana no sangue e presença de infiltrados pulmonares e 5,1% como possível por alterações radiológicas sugestivas de Aspergilose Invasiva e galactomanana negativo. A taxa de mortalidade para Aspergilose Invasiva comprovada/provável/possível foi de 61,3% e mostrou que a doença estava significativamente associada com o risco de morte (p<0,0001). Ao considerarmos a alta taxa de mortalidade causada pelo desenvolvimento da Aspergilose Invasiva e que a realização de uma terapia precoce promove significativa melhora do prognóstico dos pacientes, concluímos que a detecção de galactomanana, realizada como acompanhamento dos pacientes com alto risco de desenvolver a doença, pode ser considerada um método eficaz para auxiliar na identificação de Aspergilose Invasiva. O segundo artigo, intitulado “Associação entre polimorfismos dos genes que codificam os receptores celulares Dectina-1 e Toll-like e susceptibilidade à Aspergilose Invasiva”, teve como objetivo descrever os polimorfismos nos genes que codificam os receptores Dectina-1 e Toll-like, buscando possíveis associações com a susceptibilidade individual à Aspergilose Invasiva. Este estudo utilizou como base metodológica uma revisão sistemática da literatura e como base de dados a PubMed e PMC do NCBI. As palavras-chaves utilizadas foram: Invasive aspergillosis, polymorphism, Dectin-1 e Toll-like. A partir desta busca, 415 estudos foram encontrados e de acordo com os critérios de inclusão e exclusão 8 estudos foram selecionados. Com a realização deste, constatou-se que vários são os estudos que descrevem os polimorfismos de base única com uma maior susceptibilidade à Aspergilose Invasiva. Os principais são em genes que codificam os receptores Toll-like e os que codificam citocinas e quimiocinas (Dectina-1). Assim, pode-se perceber que de acordo com estudos já realizados há uma associação significativa de polimorfismos genéticos com a Aspergilose Invasiva, porém estudos mais amplos devem ser realizados para se obter resultados mais fidedignos. De modo geral, concluímos com essa dissertação que o desenvolvimento da Aspergilose Invasiva está associado com diversos fatores, sendo um deles o genético, e que, devido aos altos índices de mortalidade causados pela Aspergilose Invasiva, a detecção de galactomanana é de fundamental importância para o tratamento dos pacientes que apresentam uma maior probabilidade de desenvolver a doença, auxiliando principalmente no prognóstico e diagnóstico precoce da mesma.

Estudos recentes têm sugerido que doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) possa ser um fator de risco para aspergilose invasiva (AI), particularmente no contexto de ventilação mecânica e uso de esteróides. Neste trabalho, realizamos estudo de coorte prospectivo multicêntrico (2009-2010) em três unidades de terapia intensiva no Sul do Brasil. Foram incluídos no estudo pacientes com DPOC que apresentassem novo infiltrado pulmonar enquanto em ventilação mecânica e sob uso de corticosteróides. Para estes pacientes, foram realizados os seguintes testes, em amostras respiratórias (maioria aspirado traqueal): exame micológico direto, cultura quantitativa para fungos, pesquisa de antígeno galactomanana (GM) (Platelia Aspergillus) e PCR em tempo real para Aspergillus. O DNA das amostras respiratórias foi extraído utilizando-se o kit de extração MycXtra (Myconostica, UK), sendo a amplificação feita com dois kits comerciais de q-PCR: Aspergillus spp q-PCR Alert kit (Nanogen, Itália) e MycAssayTM Aspergillus kit (Myconostica, UK). Foi também obtido soro destes pacientes, onde foi testada GM, precipitinas para Aspergillus e IgE total. O estudo foi aprovado no comitê de ética dos dois hospitais. Foram incluídos no estudo 47 pacientes (40,4% do sexo masculino), sendo a idade média de 68,6 anos (±9,9). A maioria (72,8%) dos pacientes possuía DPOC grave (GOLD III/IV). A dosagem de esteróides (equivalentes de prednisona) variou de 100-4125 mg (mediana: 900 mg). Exame micológico (direto e cultivo) foi positivo para Aspergillus seção Fumigatti em apenas dois pacientes (4,2%). Outros fungos identificados foram Scedosporium apiospermum (n=1) e Histoplasma capsulatum (n=1). Precipitinas para Aspergillus foram positivas em três pacientes, com títulos baixos (<1:2). Os níveis de IgE variaram de 2 a >3000 UI/ml (mediana de 74 UI/ml). Em sua grande maioria, os índices de GM no soro foram <0,5, enquanto que nas amostras respiratórias, os índices de GM foram >0,5, >1,0 e >1,5 em 74,5%, 40,5% e 21,3%, respectivamente. PCR da Myconostica foi positivo em 10 pacientes, enquanto PCR Nanogen detectou apenas um paciente. A mortalidade geral foi de 53,2%. Este estudo prospectivo multicêntrico mostrou uma baixa incidência (4,2%) de AI em pacientes com DPOC. A determinação de GM mostrou altos índices nas amostras analisadas (50% com índices ópticos >1,3), possivelmente necessitando um maior ponto de corte para excluir resultados falso-positivos. A combinação de PCR e GM para o diagnóstico de AI em amostras respiratórias merece investigação adicional, devido à baixa sensibilidade dos métodos de cultivo observados nos estudos clínicos realizados. / Recent data have suggested that chronic obstructive pulmonary disease (COPD) may be an important risk factor for invasive aspergillosis (IA), particularly in the context of mechanical ventilation (MV) and therapy with corticosteroids. Here we present the results of a prospective multicentric study (2009-2010) conducted in three intensive care units (ICUs) in Southern Brazil. COPD patients on steroids showing a new lung infiltrate while on mechanical ventilation were included and the following tests were performed in respiratory samples (mostly tracheal aspirates): microscopy, quantitative fungal culture, galactomannan (GM) (Platelia Aspergillus EIA) and real-time PCR to detect Aspergillus DNA. DNA was extracted using MycXtra kit (Myconostica, UK) and amplification was performed using two q-PCR commercial kits: Aspergillus spp q-PCR Alert kit (Nanogen, Italy) and MycAssayTM Aspergillus kit (Myconostica, UK). Serum was also obtained and tested for Aspergillus precipitins, GM and total IgE levels. Ethical approval was obtained in each of the participant hospitals. A total of 47 patients were enrolled in the study (male 59.6%). Mean age was 68.6 years-old (± 9.9). Most patients had severe COPD (GOLD stages III/IV in 72.8%). Steroid dosage (prednisone equivalent) ranged from 100-4125 mg (median 900 mg). Microscopy and culture were positive for Aspergillus section Fumigatti in only 2 patients (4.2%). Other fungi included H. capsulatum (n=1) and S. apiospermum (n=1). Aspergillus precipitins were positive for three patients, at low titers (<1:2). IgE levels ranged from 2 to >3,000 IU/ml (median 74 IU/ml). All serum GM indexes were <0.5 and respiratory samples, GM indexes of >0.5, >1.0 and >1.5 were observed in 74.5%, 40.5%, and 21.3%, respectively. Myconostica PCR was positive in 10 patients, while Nanogen PCR detected only one patient. Overall mortality was 53.2%. This prospective multicenter study showed a low incidence (4.2%) of IA in critically ill patients with COPD. High optical indices were observed when GM was tested in respiratory samples (50% of the results showed indices of >1.3). Therefore, the test did not discriminate IA and a a higher cutoff would be needed to exclude false-positive results. The combination of PCR and GM for the diagnosis of IA in respiratory samples deserves further investigation due to the low diagnostic sensitivity of the classical mycology methods.

Laspergillose naso-sinusale (ANS) est une des causes les plus fréquentes de jetage nasal chez le chien. Cette affection peut être fortement suspectée sur la base du signalement, de lanamnèse et de lexamen clinique. Cependant, la confirmation du diagnostic requiert la combinaison de divers examens complémentaires dont lendoscopie et limagerie médicale en coupe, deux techniques principalement réservés aux centres de médecine vétérinaire spécialisés. Il serait pourtant utile pour le vétérinaire praticien de pouvoir poser lui-même le diagnostic grâce à une méthode alternative fiable et peu/non-invasive. Cest pourquoi, nous avons, dans la première partie de ce travail, investigué plus en profondeur lutilité de deux types de prélèvements faciles à prélever pour le vétérinaire (du sang et des sécrétions nasales) dans le diagnostic de lANS. Lors dune première étude, nous avons investigué lintérêt de la détection danticorps spécifiques dAspergillus dans le sérum par deux tests sérologiques (un test dimmunodiffusion sur gel dagarose (AGDD) et un test ELISA IgG indirect) en utilisant une nouvelle solution commercialisée dantigènes purifiés dAspergillus. Nous avons également investigué la valeur diagnostique de la détection de galactomannan (antigènes dAspergillus) (GM) dans le sérum au moyen dun test ELISA (PlateliaTM Aspergillus). Alors que les tests sérologiques (AGDD et ELISA IgG) ont montré une excellente spécificité (100% et 96.8% respectivement) et une bonne sensibilité (76.5% et 88.2% respectivement), une spécificité correcte (82,3%) et une très faible sensibilité (23,5%) ont été obtenues pour la détection sérique de GM. Lexplication la plus logique à cette faible sensibilité réside probablement dans le caractère non-invasif de lANS dans lespèce canine. Dans une deuxième étude, nous avons tenté de déterminer le type de prélèvement nasal et la température dincubation les plus appropriés pour lobtention de résultats fiables lors de cultures fongiques de sécrétions nasales chez le chien. Trois types déchantillon nasal dinvasivité croissante (sécrétions nasales par écouvillon, biopsie de muqueuse nasale et placard fongique) et deux températures dincubation (air ambiant et 37°C) ont été comparés. Nos résultats ont montré que les placards fongiques étaient les échantillons de choix pour les cultures fongiques et quune incubation à 37°C améliorait également significativement la sensibilité de la culture fongique par rapport à la température ambiante (avec une sensibilité de 88% et une spécificité de 100%). Dans une troisième étude, nous avons investigué la valeur diagnostique des cultures fongiques à 37°C et de la détection de GM à partir de deux nouveaux types de prélèvement non-invasifs des sécrétions nasales (un nouvel écouvillon en nylon plus performant (le flocked swab (FSwab)) et du liquide de lavage nasal (LLN)) en comparaison avec les écouvillons traditionnels en coton (EC) et les placards fongiques. Malgré un nombre croissant de résultats de cultures positif avec lutilisation respective dEC, de FSwab et de LLN à partir des échantillons prélevés chez les chiens avec ANS, il ny avait pas de différence significative entre les types déchantillon. Même sil y avait significativement plus de GM au sein des LLN et des FSwab quau sein des EC si on tenait compte de lensemble des chiens (quil soient atteints dANS, de maladie non-fongiques ou indemnes de maladie respiratoire), lutilisation des ces deux nouvelles méthodes déchantillonnage na pas entrainé daugmentation significative des GM dans les sécrétions nasales des chiens atteints dANS par rapport à la quantité obtenue en utilisant les EC. Globalement, tous prélèvements confondus, ce test sest révélé peu sensible (41.7%) et modérément spécifique (77.4%) pour le diagnostic dANS et il ny a pas eu de différence de sensibilité en comparaison avec les cultures fongiques. Si le diagnostic de lANS représente un challenge pour le clinicien, son traitement lest tout autant. Aucune méthode thérapeutique nest à lheure actuelle totalement satisfaisante. En effet, soit la méthode nécessite un abord invasif des cavités nasales et/ou sinus frontaux, soit elle nécessite une anesthésie de longue durée. De plus, aucune des méthodes décrites nest efficace dans tous les cas. Le traitement idéal devrait donc être efficace, non-invasif et de courte durée. Cest pourquoi, dans une quatrième étude, nous avons testé lefficacité dun nouveau traitement topique rapide et non-invasif (dépôt sous endoscopie dune crème à base de bifonazole 1% (Canestene, Bayer)) comme traitement unique (DC) ou en combinaison avec un traitement classique dirrigation à lénilconazole 2% (DEC) chez des chiens atteints dANS. Il en a résulté que lajout du dépôt de bifonazole au protocole classique (DEC) offre une guérison dans 100% des cas après un voire deux traitements ; ces résultats sont comparables voire meilleurs que les résultats des autres études relatives au traitement topique de lANS chez le chien. Les résultats de cette étude ont montré également que le protocole DC nest efficace que lors dinfection fongique modérée et quil peut dès lors remplacer le protocole DEC lorsquil ne reste quun nombre réduit de placards fongiques après un traitement classique. Par ailleurs, la durée du protocole DC est nettement moins longue que celle du protocole DEC permettant de diminuer le temps danesthésie et donc le coût du traitement. Par contre lutilisation unique du protocole DC sur les cas dANS sévère semble peu efficace.

Descrição: Bola fúngica é definida como uma macrocolônia composta por emaranhado de hifas, células inflamatórias, fibrina, muco e fragmentos de tecidos. Aspergillus fumigatus é o agente etiológico mais frequente, responsável por cerca de 90% dos casos, seguido de A niger e A flavus, respectivamente. O antecedente mais comum para o desenvolvimento da bola fúngica é cavidade secundária à tuberculose e a manifestação clínica mais presente e causadora de óbitos nesses pacientes é a hemoptise. Objetivos: Investigar as espécies de Aspergillus causadoras de bola fúngica pulmonar, determinar as condições predisponentes e/ou associadas e a comprovação laboratorial para o diagnóstico etiológico e observar a resposta as diferentes medidas terapêuticas dos pacientes com bola fúngica pulmonar. Delineamento: Foram analisados retrospectivamente, prontuários de pacientes para a caracterização da bola fúngica pulmonar por Aspergillus. Local do estudo: Laboratório de Micologia da Santa Casa Complexo Hospitalar, no período de 1980 a 2009. Pacientes e métodos: Foram incluídos neste estudo todos os pacientes com diagnóstico de bola fúngica pulmonar aspergilar de uma população de 750 casos de aspergilose, de 1980 a 2009. Os critérios para o diagnóstico foram os seguintes: isolamento da espécie de Aspergillus proveniente do material de cavidade pulmonar associado à imagem radiográfica compatível; isolamento da espécie de Aspergillus em outros materiais do trato respiratório, excluindo material da cavidade, associado ou não ao exame direto positivo; imunodifusão radial dupla positiva para Aspergillus associada ao exame de imagem compatível. Resultados: Foram incluídos 391 pacientes com bola fúngica pulmonar aspergilar, a idade variou de 18-78 anos, sendo 67,3% do gênero masculino. O diagnóstico foi baseado nos achados clínicos, radiológicos e laboratoriais. Em todos os pacientes foram detectados achados característicos de bola fúngica tanto no radiograma quanto na tomografia de tórax e bola fúngica complexa foi detectado em 97,4% da casuística. Tuberculose curada foi a principal condição predisponente (89%). Hemoptise foi manifestação clínica mais frequente (89%). A espécie A. fumigatus foi o agente etiológico mais isolado, 89,3% dos casos, seguido de A niger 7,1% e menos frequente A flavus 3,3%. A positividade no cultivo foi de 84,7% nos espécimes clínicos e a imunodifusão radial dupla de 81,6% dos pacientes. A principal medida terapêutica foi ressecção cirúrgica apresentando desfecho favorável em 88,3%. A eliminação da bola fúngica por lise espontânea ocorreu em 2,3% dos casos. Mortalidade foi atribuída à cirurgia e a hemoptise em 32,3 e 13,8%, respectivamente. Conclusões: Tuberculose curada e hemoptise é a primeira hipótese diagnóstica de bola fúngica pulmonar. O sinal radiológico indicativo de bola fúngica é cavidade contendo produto patológico com densidade de partes moles, espessamento da parede da cavidade e da pleura circunjacente. A detecção de anticorpos séricos por imunodifusão radial dupla, e o cultivo de espécimes do trato respiratório inferior determinaram A. fumigatus como o principal agente etiológico da bola fúngica pulmonar. A medida terapêutica mais utilizada nos pacientes do presente estudo foi ressecção cirúrgica, e a metade da ocorrência de óbito esteve presente nestes casos. / Background: Pulmonary fungus ball is defined as a conglomeration, within a cavity of intertwined Aspergillus hyphae, inflammatory cells, fibrin, mucus and cellular debris. Aspergillus fumigatus is the most frequent etiologic agent, about 90% of cases, followed by A niger and A flavus, respectively. The most common condiction to develop fungus ball is residual cavities of healed tuberculosis, and the most prevalent clinical manifestation and cause of death is hemoptysis in these patients. Objectives: To investigate the species of Aspergillus causing pulmonary fungus ball, we compared underlying conditions, laboratory evidence to the etiological diagnosis, and response of the different therapy, and outcome of patients with pulmonary fungus ball. Design: We analyzed retrospectively the medical records of patients for the characterization of pulmonary Aspergillus fungus ball. Settings: A university-based tertiary care hospital in Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil. Patients and methods: The study included patients diagnosed with pulmonary Aspergillus fungus ball in a population of 750 cases of aspergillosis, from 1980 to 2009. The criteria for the diagnosis were: isolation of Aspergillus species from the material of the pulmonary cavity associated with the compatible radiographic image; isolation of Aspergillus species from other materials of the respiratory tract, excluding cavity material, with or without direct examination positive; double immunodiffusion positive for Aspergillus associated with compatible image. Results: We included 391 patients with pulmonary Aspergillus fungus ball, age ranged from 18 to 78 years, 67.3% were male. The diagnosis was based on clinical, radiological, and laboratory findings. In all patients we detected the characteristic findings of fungal ball, on X-ray and tomography; and complex fungal ball, on their radiological appearance, was detected in 97.4% of cases. Healed tuberculosis was the commonest pre-existing disease (89%). Hemoptysis was the major symptoms (89%). The species A. fumigatus was the most common etiologic agent, 89.3% of cases, followed by 7.1% A niger and A flavus less frequent in 3.3%. Culture was positive in 84.7% specimes, and immunodiffusion in 81.6% patients. The main treatment was surgical resection in 88.3% that had a favorable outcome. Spontaneous lysis was obtained in 2.3% of cases. Mortality was attributed to the surgery and hemoptysis in 32.3 and 13.8%, respectively. Conclusions: Patient with healed tuberculosis and hemoptysis is the first hypothesis diagnostic fungus ball. The most frequent radiological signs were rounded dense opacity surrounded with a halo of air in a thick cavity wall and thickening of the pleura over cavity. The detection of serum antibodies by double immunodiffusion, and the cultive of the lower respiratory tract specimens determined A. fumigatus as the main agent of pulmonary fungal ball. The detection of serum antibodies by double immunodiffusion, and the cultivation of the lower respiratory tract specimens determined A. fumigatus as the main agent of pulmonary fungal ball. The measure most commonly used therapy in patients of this study was to surgical resection, and half of the patients who died were in these cases.

Estudos recentes têm sugerido que doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) possa ser um fator de risco para aspergilose invasiva (AI), particularmente no contexto de ventilação mecânica e uso de esteróides. Neste trabalho, realizamos estudo de coorte prospectivo multicêntrico (2009-2010) em três unidades de terapia intensiva no Sul do Brasil. Foram incluídos no estudo pacientes com DPOC que apresentassem novo infiltrado pulmonar enquanto em ventilação mecânica e sob uso de corticosteróides. Para estes pacientes, foram realizados os seguintes testes, em amostras respiratórias (maioria aspirado traqueal): exame micológico direto, cultura quantitativa para fungos, pesquisa de antígeno galactomanana (GM) (Platelia Aspergillus) e PCR em tempo real para Aspergillus. O DNA das amostras respiratórias foi extraído utilizando-se o kit de extração MycXtra (Myconostica, UK), sendo a amplificação feita com dois kits comerciais de q-PCR: Aspergillus spp q-PCR Alert kit (Nanogen, Itália) e MycAssayTM Aspergillus kit (Myconostica, UK). Foi também obtido soro destes pacientes, onde foi testada GM, precipitinas para Aspergillus e IgE total. O estudo foi aprovado no comitê de ética dos dois hospitais. Foram incluídos no estudo 47 pacientes (40,4% do sexo masculino), sendo a idade média de 68,6 anos (±9,9). A maioria (72,8%) dos pacientes possuía DPOC grave (GOLD III/IV). A dosagem de esteróides (equivalentes de prednisona) variou de 100-4125 mg (mediana: 900 mg). Exame micológico (direto e cultivo) foi positivo para Aspergillus seção Fumigatti em apenas dois pacientes (4,2%). Outros fungos identificados foram Scedosporium apiospermum (n=1) e Histoplasma capsulatum (n=1). Precipitinas para Aspergillus foram positivas em três pacientes, com títulos baixos (<1:2). Os níveis de IgE variaram de 2 a >3000 UI/ml (mediana de 74 UI/ml). Em sua grande maioria, os índices de GM no soro foram <0,5, enquanto que nas amostras respiratórias, os índices de GM foram >0,5, >1,0 e >1,5 em 74,5%, 40,5% e 21,3%, respectivamente. PCR da Myconostica foi positivo em 10 pacientes, enquanto PCR Nanogen detectou apenas um paciente. A mortalidade geral foi de 53,2%. Este estudo prospectivo multicêntrico mostrou uma baixa incidência (4,2%) de AI em pacientes com DPOC. A determinação de GM mostrou altos índices nas amostras analisadas (50% com índices ópticos >1,3), possivelmente necessitando um maior ponto de corte para excluir resultados falso-positivos. A combinação de PCR e GM para o diagnóstico de AI em amostras respiratórias merece investigação adicional, devido à baixa sensibilidade dos métodos de cultivo observados nos estudos clínicos realizados. / Recent data have suggested that chronic obstructive pulmonary disease (COPD) may be an important risk factor for invasive aspergillosis (IA), particularly in the context of mechanical ventilation (MV) and therapy with corticosteroids. Here we present the results of a prospective multicentric study (2009-2010) conducted in three intensive care units (ICUs) in Southern Brazil. COPD patients on steroids showing a new lung infiltrate while on mechanical ventilation were included and the following tests were performed in respiratory samples (mostly tracheal aspirates): microscopy, quantitative fungal culture, galactomannan (GM) (Platelia Aspergillus EIA) and real-time PCR to detect Aspergillus DNA. DNA was extracted using MycXtra kit (Myconostica, UK) and amplification was performed using two q-PCR commercial kits: Aspergillus spp q-PCR Alert kit (Nanogen, Italy) and MycAssayTM Aspergillus kit (Myconostica, UK). Serum was also obtained and tested for Aspergillus precipitins, GM and total IgE levels. Ethical approval was obtained in each of the participant hospitals. A total of 47 patients were enrolled in the study (male 59.6%). Mean age was 68.6 years-old (± 9.9). Most patients had severe COPD (GOLD stages III/IV in 72.8%). Steroid dosage (prednisone equivalent) ranged from 100-4125 mg (median 900 mg). Microscopy and culture were positive for Aspergillus section Fumigatti in only 2 patients (4.2%). Other fungi included H. capsulatum (n=1) and S. apiospermum (n=1). Aspergillus precipitins were positive for three patients, at low titers (<1:2). IgE levels ranged from 2 to >3,000 IU/ml (median 74 IU/ml). All serum GM indexes were <0.5 and respiratory samples, GM indexes of >0.5, >1.0 and >1.5 were observed in 74.5%, 40.5%, and 21.3%, respectively. Myconostica PCR was positive in 10 patients, while Nanogen PCR detected only one patient. Overall mortality was 53.2%. This prospective multicenter study showed a low incidence (4.2%) of IA in critically ill patients with COPD. High optical indices were observed when GM was tested in respiratory samples (50% of the results showed indices of >1.3). Therefore, the test did not discriminate IA and a a higher cutoff would be needed to exclude false-positive results. The combination of PCR and GM for the diagnosis of IA in respiratory samples deserves further investigation due to the low diagnostic sensitivity of the classical mycology methods.

Surfactant proteins, SP-A and SP-D, are collagen-containing calcium-dependent (C-type) lectins, called, collectins. Their primary structure has four regions: a cysteine-linked N- terminal region involved in multimerization, a collagen region composed of Gly-X-Y repeats, coiled-coil neck region, and the C-terminal carbohydrate recognition domains (CRD) or C-type lectin domain. SP-A looks like a bouquet, while SP-D is a cruciform- like structure, with four arms of equal length. SP-A and SP-D have been shown to act as innate immune molecules at pulmonary as well as extra-pulmonary sites by binding to pathogens, allergens and apoptotic/necrotic cells via their CRD region. SP-A and SP-D can induce pathogen neutralization and enhanced phagocytosis. In addition, SP-A and SP-D can interact via CRDs with allergens and dampen allergic reaction in vitro and in vivo. This thesis examines in vitro interaction of a recombinant fragment of human SP-D containing neck and CRD regions (rhSP-D) with IAV and Aspergillus fumigatus, in addition to characterizing a dichotomy of the effects of SP-A and SP-D on dendritic cells in an attempt to explain how SP-A and SP-D modulate DC functions differentially. Experiments involving interaction of rhSP-D with IAV pandemic strain show that it can be a restrictive factor against the virus, in addition to modulating immune response by a macrophage cell line. The rhSP-D can have anti-A. fumigatus effect directly and indirectly in the context of pathogen as well as allergen. A comparison has been made between two recombinant fragments of SP-D that have been expressed with and without 8 Gly-X-Y repeats for their fungistatic properties. The effects of SP-A and SP-D on cultured DC maturation, and effector cytokine and proliferative response of co-cultured cells have also been examined in vitro.

Descrição: Bola fúngica é definida como uma macrocolônia composta por emaranhado de hifas, células inflamatórias, fibrina, muco e fragmentos de tecidos. Aspergillus fumigatus é o agente etiológico mais frequente, responsável por cerca de 90% dos casos, seguido de A niger e A flavus, respectivamente. O antecedente mais comum para o desenvolvimento da bola fúngica é cavidade secundária à tuberculose e a manifestação clínica mais presente e causadora de óbitos nesses pacientes é a hemoptise. Objetivos: Investigar as espécies de Aspergillus causadoras de bola fúngica pulmonar, determinar as condições predisponentes e/ou associadas e a comprovação laboratorial para o diagnóstico etiológico e observar a resposta as diferentes medidas terapêuticas dos pacientes com bola fúngica pulmonar. Delineamento: Foram analisados retrospectivamente, prontuários de pacientes para a caracterização da bola fúngica pulmonar por Aspergillus. Local do estudo: Laboratório de Micologia da Santa Casa Complexo Hospitalar, no período de 1980 a 2009. Pacientes e métodos: Foram incluídos neste estudo todos os pacientes com diagnóstico de bola fúngica pulmonar aspergilar de uma população de 750 casos de aspergilose, de 1980 a 2009. Os critérios para o diagnóstico foram os seguintes: isolamento da espécie de Aspergillus proveniente do material de cavidade pulmonar associado à imagem radiográfica compatível; isolamento da espécie de Aspergillus em outros materiais do trato respiratório, excluindo material da cavidade, associado ou não ao exame direto positivo; imunodifusão radial dupla positiva para Aspergillus associada ao exame de imagem compatível. Resultados: Foram incluídos 391 pacientes com bola fúngica pulmonar aspergilar, a idade variou de 18-78 anos, sendo 67,3% do gênero masculino. O diagnóstico foi baseado nos achados clínicos, radiológicos e laboratoriais. Em todos os pacientes foram detectados achados característicos de bola fúngica tanto no radiograma quanto na tomografia de tórax e bola fúngica complexa foi detectado em 97,4% da casuística. Tuberculose curada foi a principal condição predisponente (89%). Hemoptise foi manifestação clínica mais frequente (89%). A espécie A. fumigatus foi o agente etiológico mais isolado, 89,3% dos casos, seguido de A niger 7,1% e menos frequente A flavus 3,3%. A positividade no cultivo foi de 84,7% nos espécimes clínicos e a imunodifusão radial dupla de 81,6% dos pacientes. A principal medida terapêutica foi ressecção cirúrgica apresentando desfecho favorável em 88,3%. A eliminação da bola fúngica por lise espontânea ocorreu em 2,3% dos casos. Mortalidade foi atribuída à cirurgia e a hemoptise em 32,3 e 13,8%, respectivamente. Conclusões: Tuberculose curada e hemoptise é a primeira hipótese diagnóstica de bola fúngica pulmonar. O sinal radiológico indicativo de bola fúngica é cavidade contendo produto patológico com densidade de partes moles, espessamento da parede da cavidade e da pleura circunjacente. A detecção de anticorpos séricos por imunodifusão radial dupla, e o cultivo de espécimes do trato respiratório inferior determinaram A. fumigatus como o principal agente etiológico da bola fúngica pulmonar. A medida terapêutica mais utilizada nos pacientes do presente estudo foi ressecção cirúrgica, e a metade da ocorrência de óbito esteve presente nestes casos. / Background: Pulmonary fungus ball is defined as a conglomeration, within a cavity of intertwined Aspergillus hyphae, inflammatory cells, fibrin, mucus and cellular debris. Aspergillus fumigatus is the most frequent etiologic agent, about 90% of cases, followed by A niger and A flavus, respectively. The most common condiction to develop fungus ball is residual cavities of healed tuberculosis, and the most prevalent clinical manifestation and cause of death is hemoptysis in these patients. Objectives: To investigate the species of Aspergillus causing pulmonary fungus ball, we compared underlying conditions, laboratory evidence to the etiological diagnosis, and response of the different therapy, and outcome of patients with pulmonary fungus ball. Design: We analyzed retrospectively the medical records of patients for the characterization of pulmonary Aspergillus fungus ball. Settings: A university-based tertiary care hospital in Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil. Patients and methods: The study included patients diagnosed with pulmonary Aspergillus fungus ball in a population of 750 cases of aspergillosis, from 1980 to 2009. The criteria for the diagnosis were: isolation of Aspergillus species from the material of the pulmonary cavity associated with the compatible radiographic image; isolation of Aspergillus species from other materials of the respiratory tract, excluding cavity material, with or without direct examination positive; double immunodiffusion positive for Aspergillus associated with compatible image. Results: We included 391 patients with pulmonary Aspergillus fungus ball, age ranged from 18 to 78 years, 67.3% were male. The diagnosis was based on clinical, radiological, and laboratory findings. In all patients we detected the characteristic findings of fungal ball, on X-ray and tomography; and complex fungal ball, on their radiological appearance, was detected in 97.4% of cases. Healed tuberculosis was the commonest pre-existing disease (89%). Hemoptysis was the major symptoms (89%). The species A. fumigatus was the most common etiologic agent, 89.3% of cases, followed by 7.1% A niger and A flavus less frequent in 3.3%. Culture was positive in 84.7% specimes, and immunodiffusion in 81.6% patients. The main treatment was surgical resection in 88.3% that had a favorable outcome. Spontaneous lysis was obtained in 2.3% of cases. Mortality was attributed to the surgery and hemoptysis in 32.3 and 13.8%, respectively. Conclusions: Patient with healed tuberculosis and hemoptysis is the first hypothesis diagnostic fungus ball. The most frequent radiological signs were rounded dense opacity surrounded with a halo of air in a thick cavity wall and thickening of the pleura over cavity. The detection of serum antibodies by double immunodiffusion, and the cultive of the lower respiratory tract specimens determined A. fumigatus as the main agent of pulmonary fungal ball. The detection of serum antibodies by double immunodiffusion, and the cultivation of the lower respiratory tract specimens determined A. fumigatus as the main agent of pulmonary fungal ball. The measure most commonly used therapy in patients of this study was to surgical resection, and half of the patients who died were in these cases.