A number of therapeutic proteins are used for long in clinical practice. These include for example insulin, calcitonine, growth hormone, and parathyroid hormone for the treatment of various systemic disorders, as well as protein antigens in vaccine formulations. Due to the recent developments in biochemical engineering and in the comprehension of the physiopathology of many diseases, peptides and proteins are expected to become a drug class of increasing importance. Recently, novel biological drugs have for example been developed such as monoclonal antibodies, antibody fragments, soluble receptors, and receptor agonists or antagonists. These are mainly used for the treatment of auto-immune and inflammatory diseases (asthma, rheumatoid arthritis) and for the treatment of cancers. However, a major drawback of these biomolecules is the need to use parenteral administration. This is mainly due to the harsh pH conditions that proteins undergo by oral administration, leading to various physico-chemical degradations and loss of biological activity. <p><p>Pulmonary delivery of these proteins could constitute an alternative to parenteral delivery. Due to the very high surface area of the lungs, the low thickness of the alveolar epithelium and the high level of lung vascularisation, pulmonary administration can indeed provide fast systemic absorption of drugs, while avoiding hepatic first pass metabolism. On the other hand, drugs for local treatment can also be administered directly into the lung, which allows delivering high doses while limiting systemic side effects. Nevertheless, administration of drugs to the lungs requires some challenges to be taken up. It is indeed necessary to provide the drug as very small solid or liquid microparticles (1-5 µm) in order to reach the lungs. For solid microparticles, it is also needed to overcome the very high inter-particle interactions by using appropriate formulation strategies and by including deaggregation mechanisms in the inhalation device. Other issues are more specifically related to the pulmonary administration of proteins. These can indeed undergo physico-chemical degradations during processing, administration, and/or storage. Moreover, if systemic action is required, proteins will often need addition of an absorption enhancer to cross the alveolar epithelium because of their large molecular weight and hydrophilicity. <p><p>In this work, we developed formulations for pulmonary delivery of proteins using two model proteins. Insulin (5.8 kDa) was chosen as a model of small protein. It is also an application of systemic pulmonary delivery. On the other hand, an anti-IL13 monoclonal antibody fragment (54 kDa) was used as a model of larger protein. This molecule is currently in development for the treatment of asthma and provided an application for local pulmonary delivery. The formulation strategy was to produce dry powders using a combination of micronisation techniques (high speed and high pressure homogenisations), drying techniques (spray-drying, freeze-drying), and addition of lipid excipients. These lipid excipients were added as a coating around the protein particles and were expected to prevent protein degradations during processing and/or storage, essentially by avoiding contact with water. It could also improve the aerodynamic properties of the powders by modification of the surface properties of the particles and/or limitation of the capillary forces.<p><p>First, we evaluated insulin lipid-coated formulations and formulations without excipients, produced using high pressure homogenisation and spray-drying. In the case of lipid-coated formulations, a physiological lipid composition based on a mixture of cholesterol and phospholipids was used. We were able to obtain good aerodynamic features for the different formulations tested, with fine particle fractions between 46% and 63% versus 11% for raw insulin powder. These are high FPF values in comparison with those obtained for other protein formulations for inhalation currently under development, which often have an in vitro deposition of around 30%. Insulin presented a good stability in the dry state, even when no lipid coating was added.<p>The presence of a lipid coating of up to 30% (w/w) did not significantly improve the aerodynamic behaviour of the powders, but the coated formulations exhibited decreased residual moisture content after 3-month storage, which should be of interest for the long-term stability of the formulations. <p><p>In a second step, two of the developed insulin formulations were evaluated in a clinical study to determine whether the formulations give high deep lung deposition in vivo, and how insulin is absorbed into the systemic blood stream. This pharmaco-scintigraphic trial was performed on twelve type 1 diabetic patients using an uncoated formulation and a formulation coated with 20% (w/w) of lipids. The two formulations showed interesting features, with pharmacokinetic profiles that mimic the natural insulin secretion pattern. Bioavailability was within the ranges of two of the three dry powder insulins that have reached phase III clinical development. However, the formulation with a lipid coating exhibited a lower lung deposition in comparison with the uncoated formulation, which was not expected from the previous in vitro results. Additional in vitro experiments indicated that this lower performance was related to a decrease in the disaggregation efficiency of the powder at a sub-optimal inhalation flow-rate. An extensive training of the patients to the inhalation procedure could therefore improve the lung deposition of the coated formulation.<p><p>Finally, we developed and evaluated dry powder formulations of the anti-IL13 antibody fragment. These were produced using, successively, freeze-drying, high pressure homogenisation (HPH), and spray-drying. The influence of different types and concentrations of stabilising excipients was evaluated for each production step. Due to its more elaborated structure, the antibody fragment was found to be more sensitive than insulin to physico-chemical degradation, particularly during the HPH process, which led to different types of degradation products. These could partly be avoided by adding 50% sucrose during freeze-drying and 10% Na glycocholate or palmitic acid in the liquid phase during HPH (dispersing agents). However, the presence of a small fraction of insoluble aggregates could not be fully avoided. Further spray-drying of the suspensions in the presence of 10% Na glycocholate or palmitic acid led to the formation of a hydrophilic or hydrophobic coating around the particles, respectively. Na glycocholate was found to be particularly effective in protecting the antibody during spray-drying, which was found to be at least partly related to its ability to inhibit sucrose recrystallisation. However, the best formulation still presented a small fraction of insoluble aggregates (6%). The aerodynamic evaluation of the formulations showed FPFs that were compatible with lung deposition, with the formulation containing Na glycocholate presenting the highest FPF (42%). The formulation coated with palmitic acid presented a slightly lower FPF (35%). The aerodynamic properties of this formulation remained unchanged at a sub-optimal inspiratory flow rate, to the contrary of what was observed for the insulin formulation coated with 20% (w/w) cholesterol and phospholipids. Palmitic acid could therefore be of interest as a hydrophobic coating material, and provide long-term stability of protein drugs. <p>The work performed with the insulin and anti-IL13 molecules provided the proof-of-concept that it was possible to obtain dry powder protein formulations with appropriate aerodynamic properties and good overall physico-chemical stability, using simple production techniques and few selected excipients. The formulation strategy presented in this work could therefore be of interest for the future development of inhaled proteins for local or systemic applications. <p> / Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

De nos jours, la voie inhalée constitue le mode d’administration optimal dans le traitement de nombreuses affections respiratoires, et suscite beaucoup d’intérêt pour la délivrance systémique de médicaments. Cependant, le poumon est un organe complexe doté de mécanismes de défense efficients qui limitent la déposition des particules inhalées et les éliminent très rapidement. Cette voie d’administration fait donc l’objet de programmes de recherche intensifs visant à améliorer l’efficacité de la délivrance et la compliance du patient. Il faut néanmoins signaler que le nombre d’excipients dont l’innocuité a été démontrée en inhalation (sous forme de poudre sèche) reste extrêmement limité à l’heure actuelle. A cet égard, l’utilisation de microparticules lipidiques solides (mPLS), constituées d’un mélange de cholestérol et de phospholipides biodégradables et caractérisés par une température de transition de phase élevée, a été envisagée. Le procédé retenu pour la préparation de ces mPLS est la technique d’atomisation à température modérée (spray-drying).<p><p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Compte tenu de ses aspects multiples, de sa dangerosité potentielle et du taux de<p>survie considérablement bas qui lui est associé dans ses formes les plus graves, l’aspergillose<p>pulmonaire est encore à l’heure actuelle dévastatrice sur le plan clinique. L’approche<p>médicamenteuse conventionnelle consiste en l’administration par voie orale ou<p>intraveineuse (IV) d’agents antifongiques. Ces voies classiques requièrent l’administration de<p>doses très élevées qui sont nécessaires à l’obtention de concentrations systémiques<p>suffisantes pour obtenir un effet thérapeutique au niveau pulmonaire. Cependant, ces<p>concentrations systémiques sont également la cause d’effets secondaires indésirables et<p>d’interactions médicamenteuses importantes. Une alternative thérapeutique à ces voies<p>classiques serait de localiser ces antifongiques dans le poumon, en utilisant la voie inhalée.<p>Cela permettrait d’augmenter le taux de succès thérapeutique en déposant et en<p>concentrant directement la dose au niveau du site d’infection tout en minimisant les<p>concentrations systémiques.<p>Pour ce faire, nous avons choisi de développer des poudres sèches pour inhalation à<p>base d’itraconazole (ITZ), un antifongique actif à l’égard des souches d’aspergillus. Celles-ci<p>sont administrable via un inhalateur à poudre sèche pour les avantages que présente ce<p>mode d’administration comparativement aux nébuliseurs et aux inhalateurs pressurisés. Le<p>développement des formulations implique entre autres l’obtention de caractéristiques<p>aérodynamiques appropriées, c’est-à-dire, ayant, après décharge à partir d’un dispositif<p>d’inhalation, un profil de déposition pulmonaire permettant d’atteindre des doses<p>pulmonaires pharmacologiquement efficaces. Toutefois, l’ITZ présente une solubilité<p>aqueuse extrêmement faible (solubilité aqueuse à pH 7 ~ 4 ng/ml à 25°C). Or, une fois<p>déposée dans le poumon, la dose inhalée doit se solubiliser pour exercer son action<p>pharmacologique. Nous avons donc inclus dans les concepts de formulation, une stratégie<p>permettant l’amélioration du profil de dissolution et l’augmentation de la solubilité de l’ITZ.<p>Cela permettrait en effet d’en potentialiser au maximum l’action pharmacologique au sein<p>des lésions fongiques avant qu'il ne soit éliminé sous sa forme non dissoute par les<p>mécanismes de clairance non absorptifs du poumon. De plus, le poumon étant un organe ne<p>tolérant qu’un nombre limité de substances administrables par inhalation, nous nous<p>sommes focalisés sur l’utilisation d’excipients présentant un faible potentiel toxique ou bien<p>tolérés après inhalation. Enfin, nous avons gardé à l’esprit lors du développement des procédés de fabrication qu’ils pouvaient être sujets à la mise à l’échelle industrielle. Nous<p>avons donc privilégié des procédés de fabrication simples incluant des technologies<p>transposables telles que l’atomisation par la chaleur et l’homogénéisation à haute pression.<p>Une attention particulière lors de la caractérisation des poudres a été portée sur les<p>propriétés d’écoulement des formulations, toujours dans l’optique de faciliter une<p>potentielle future manutention à plus grande échelle.<p>Pour répondre à ces critères, durant la première partie de ce travail, nous avons<p>imaginé deux concepts de formulation qui ont pour but de former des microparticules de<p>mannitol dans lesquelles est dispersé l’ITZ sous forme « modifiée ».<p>Le premier concept de formulation qui a été développé consistait à former une<p>dispersion solide (DS) entre l’ITZ, si possible amorphe pour en augmenter la solubilité, et un<p>agent matriciel en utilisant le procédé d’atomisation par la chaleur d’une solution contenant<p>tous les ingrédients sous forme dissoute. Lors de tests préliminaires, nous avons évalué trois<p>types d’agents matriciels, deux agents hydrophiles (le mannitol et le lactose) et un agent<p>hydrophobe (le cholestérol). Sur base de la faisabilité, des résultats préliminaires de<p>solubilité, de dissolution et de déposition pulmonaire in vitro, le mannitol a été retenu.<p>Après une optimisation des conditions d’atomisation, les formulations ont été produites en<p>vue d’être caractérisées. Il a été observé, par diffraction de rayons X sur poudre (PXRD) et<p>par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), qu’après atomisation, l’ITZ était obtenu sous<p>forme amorphe et le mannitol sous forme cristalline. Les tests d’évaluation des propriétés<p>aérodynamiques ont été réalisés à l’aide d’un impacteur liquide multi-étages (MsLI) en<p>suivant les recommandations pratiques de la Pharmacopée européenne. Ce type de<p>compositions, atomisées dans les conditions optimales, permettait d’obtenir des poudres<p>sèches présentant les caractéristiques de taille (diamètre médian < 5 μm, mesuré par<p>diffraction laser) et les propriétés aérodynamiques appropriées à l’administration<p>pulmonaire (fraction de particules fines (FPF) déterminées lors des tests d’impaction<p>comprises entre 40 % et 70 %). La formation d’une DS avec le mannitol était nécessaire afin<p>d’augmenter la solubilité et d’accélérer la cinétique de dissolution de l’ITZ comparativement<p>à son homologue micronisé sous forme cristalline ou encore à sa forme amorphe atomisée<p>sans mannitol. Par exemple, dans sa configuration amorphe atomisée sans excipient ou sous<p>sa forme cristalline initiale, l’ITZ présentait une solubilité à saturation (mesurée dans un tampon phosphate contenant 0,02% de dipalmytoyl phosphatidyl choline) inférieure à 10<p>ng/ml. Après formation d’une DS avec le mannitol suivant notre procédé de formulation,<p>nous sommes parvenus à des valeurs de solubilité atteignant 450 ng/ml. Il s’est avéré que<p>l’ajout à la composition d’un surfactant, le tocopherol polyethylène glycol 1000 succinate<p>(TPGS), permettait d’accélérer la cinétique de dissolution du principe actif. Toutefois,<p>l’utilisation du TPGS induisait une diminution des performances aérodynamiques des<p>formulations. Etant donné que cette augmentation de la cinétique de dissolution pouvait<p>être un avantage après administration pulmonaire, nous avons considéré un autre type de<p>surfactant, les phospholipides (PL). L’utilisation de la lécithine de soja hydrogéné s’est<p>révélée être très efficace. Les performances aérodynamiques des formulations ont été<p>préservées et même améliorées. Leur incorporation à la DS permettait également d’obtenir<p>une accélération du profil de dissolution de l’ITZ. De plus, l’augmentation de la quantité de<p>PL dans nos formulations, dans la gamme des concentrations utilisées, était corrélée avec<p>une amélioration d’autant plus marquée du profil de dissolution de l’ITZ. En outre, les<p>solubilités de l’ITZ en présence de PL furent considérablement améliorées avec, par<p>exemple, des concentrations mesurées de 870 ng/ml et 1342 ng/ml pour les formulations<p>contenant respectivement 10 % (m/mpoudre) et 35 % (m/mpoudre) d’ITZ, ainsi que 10 % de PL<p>exprimés par rapport à la quantité d’ITZ.<p>Le deuxième concept de formulation développé consistait à produire des<p>microparticules de mannitol dans lesquelles étaient dispersées des nanoparticules (NP)<p>cristallines d’ITZ. Le procédé de fabrication était le suivant. Une suspension de nanocristaux<p>d’ITZ produite par homogénéisation à haute pression (HPH) était re-suspendue dans une<p>solution de mannitol qui était par la suite atomisée pour obtenir les microparticules de<p>poudres sèches. Après optimisation des conditions d’homogénéisation, nous sommes<p>parvenus à produire des nanosuspensions d’ITZ dont les particules présentaient un diamètre<p>médian inférieur à 250 nm. Nous avons alors évalué l’influence qu’avait l’ajout du mannitol<p>et du taurocholate sodique sur l’état d’agrégation des NP avant l’étape d’atomisation et sur<p>les performances des formulations sous forme sèche. Il a été observé que l’ajout de<p>mannitol était nécessaire à la production de solutions sursaturées en ITZ avec une solubilité<p>maximale d’ITZ mesurées à 96 ng/ml dans le tampon phosphate précédemment cité. L’ajout<p>de mannitol s’est avéré nécessaire afin de minimiser le phénomène d’agrégation des NP durant l’étape d’atomisation. De plus, l’ajout de taurocholate de sodium permettait<p>également d’inhiber leur agrégation. La cristallinité des NP d’ITZ a été confirmée par PXRD et<p>DSC. Ce type de formulation présentait des tailles et des performances aérodynamiques<p>compatibles à l’administration pulmonaire (tailles des particules < 5 μm et FPF entre 35 % et<p>46 %). Néanmoins, comparativement aux DS précédemment décrites, ces formulations à<p>base de NP s’avèrent sensiblement moins performantes. En effet, au niveau des<p>caractéristiques aérodynamiques, les formulations à base de NP présentent des FPF<p>nettement inférieures à celles obtenues pour les DS (FPF de ~40 % pour les formulations<p>nanoparticulaires contre ~70 % pour les DS d’ITZ amorphe). De plus, à partir des<p>formulations à bases de NP, les taux de sursaturation en ITZ atteints étaient nettement<p>inférieurs à ceux obtenus avec les DS (~100 ng/ml Vs > 1000 ng/ml pour les meilleurs DS). En<p>outre, la production des nanosuspensions nécessitait l’étape supplémentaire d’un minimum<p>de 300 cycles d’homogénéisation, ce qui représente un désavantage considérable en termes<p>de rendement économique en cas de transposition à échelle industrielle comparativement à<p>l’étape unique nécessaire pour la fabrication des DS. Pour ces raisons, seules les DS ont été<p>évaluées in vivo.<p>Après la mise au point des formulations, la seconde partie de ce projet consistait à<p>évaluer les DS développés dans un système biologique complet, la souris. Nous avons en<p>premier lieu réalisé une pharmacocinétique (PK) après administration pulmonaire pour<p>déterminer l’effet de l’augmentation de la solubilité observée in vitro et de l’ajout de PL dans<p>la formulation. Ensuite, nous avons entrepris une étude d’activité sur un modèle murin<p>d’aspergillose pulmonaire invasive (API) permettant de comparer l’efficacité thérapeutique<p>ou prophylactique de nos formulations comparativement à une thérapie standard par voie<p>orale. Pour effectuer ces deux études, nous avons préalablement validé une méthode<p>d’administration des poudres sèches chez la souris à l’aide d’un insufflateur (DP-4M®, Penn<p>Century, Wyndmoor, USA) en utilisant la voie endotrachéale. Le premier point de cette<p>investigation avait pour objet de déterminer si l’intervalle de taille particulaire généré lors de<p>la décharge de nos formulations au sortir de l’insufflateur permettait une répartition<p>homogène dans les poumons ainsi qu’une pénétration profonde des particules jusqu’aux<p>alvéoles pulmonaires. Le deuxième point sur lequel nous nous sommes également attardés était la reproductibilité des doses pulmonaires générées après insufflation, facteur<p>déterminant lors de la réalisation d’une étude PK.<p>Sur base des observations constatées durant la validation du dispositif<p>d’administration, nous avons entrepris une étude PK après administration pulmonaire d’une<p>dose de 0,5 mg/kg d’ITZ, représentant une quantité inhalable par l’homme et pouvant<p>garantir des taux pulmonaires en antifongiques théoriquement adéquats. Cette étude a<p>permis de comparer les concentrations pulmonaires et plasmatiques en ITZ après<p>l’administration de poudres sèches à base d’une DS de mannitol et d’ITZ qui était soit<p>cristallin soit amorphe, avec ou sans PL. Après administration de la DS à base d’ITZ sous sa<p>forme amorphe, une augmentation de la quantité d’ITZ absorbée vers le compartiment<p>systémique a été observée. En effet, il a été observé une augmentation d’un facteur 2,7 de<p>l’aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en ITZ de 0 à 24 heures (AUC0-24h)<p>comparativement à celle obtenue après administration de la DS à base d’ITZ sous sa forme<p>cristalline. Le temps pour atteindre la concentration plasmatique maximale (tmax) était<p>également plus court pour la formulation à base ITZ sous sa forme amorphe (tmax de 10 min<p>vs 30 min pour la formulation cristalline). De plus, dans cette configuration amorphe, les<p>temps de rétention pulmonaire en ITZ étaient considérablement plus élevés (t1/2<p>d’élimination de 6,5 h pour l'ITZ cristallin vs 14 ,7 h pour l’ITZ amorphe) permettant de<p>maintenir une concentration pulmonaire en ITZ supérieure à la CMI de la souche<p>d’aspergillus la plus fréquente (A. fumigatus ;2 μg/gpoumon) pendant plus de 24h. L’ajout de<p>PL dans un rapport ITZ:PL:mannitol (1:3:97) dans la DS influençait le profil PK de l’ITZ<p>amorphe en accentuant et accélérant d’avantage la phase d’absorption initiale de l’ITZ<p>observée (Cmax et tmax plasmatique supérieur et inférieur à ceux obtenus pour l’ITZ amorphe,<p>respectivement). Toutefois, cette formulation a été éliminée plus rapidement des poumons<p>(t1/2 d’élimination pulmonaire de l’ITZ de 4,1h pour les formulations avec PL vs 14,7h sans<p>PL). Pour cette raison, nous avons décidé d’évaluer l’efficacité des formulations à base d’ITZ<p>sous forme amorphe sans phospholipides dans un modèle murin d’aspergillose pulmonaire<p>invasive (API) que nous avons développé.<p>Nous ne sommes pas parvenus à mettre en évidence un effet thérapeutique de<p>l’administration des poudres sèches administrées dans ce modèle murin neutropénique<p>d’API. Nous justifions ce manque d’activité par une agressivité du modèle trop prononcée et par l’impossibilité de pouvoir administrer de manière plus fréquente le traitement par<p>inhalation en raison de l’anesthésie nécessaire pour la procédure d’administration<p>endotrachéale. Toutefois, des essais complémentaires vont être envisagés (modification de<p>la charge fongique, administration des poudres par une tour d’inhalation, optimisation du<p>dosage et de la fréquence d’administration). En revanche, il a été mis en évidence que<p>l’administration prophylactique (début des administrations 2 jours avant l’infection) d’une<p>dose de 5 mg/kg/48h d’une DS d’ITZ amorphe augmentait significativement le taux de survie<p>de 12 jours après l’infection par A. fumigatus comparativement aux animaux non traités<p>(taux de survivants :50 % vs 0 %). A titre de comparaison, le pourcentage de survie obtenu<p>après prophylaxie quotidienne d’une dose de 12,5 mg/kg/12h de solution orale de VCZ (la<p>thérapie recommandée pour l’API) n’était que de 25 %.<p>En conclusion, les DS d’ITZ destinées à être administrées par inhalation constituent<p>une approche thérapeutique prometteuse dans le cadre de la prévention et du traitement<p>de l’aspergillose pulmonaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished