The Crystal Structure of Sl Nuclease from Aspergillus oryzae S 1 nuclease from Aspergillus oryzae is a glycoprotein of 32 kDa molecular weight. The protein has two enzymatic activities: it is an endo-exonuclease with high specificity for single stranded nucleic acids, and it has an additional 3' -nucleotidase activity. S 1 nuclease is widely used in molecular biology as a single-strand specific nuclease due to its high stability and efficiency. It cleaves single-stranded regions of nucleic acids producing 5' -nucleotides without significant side-reactions. The crystal structure of S 1 nuclease has been determined to 1.7 A resolution by molecular replacement based on the known structure of PI nuclease from Penicillinum citrinum, which has 49 % sequence identity compared to S 1. The overall fold and the active site of S 1 nuclease is basically identical to that of PI nuclease, and also very similar to Phospholipase C from Bacillus cereus and alpha-toxin from Clostridium perfringens. The characteristic feature of this family of enzymes is a trinuclear zinc cluster in their active sites. A BLAST search in the sequence databases revealed several other protein sequences from bacteria, protozoa and plants possessing an approximately 30 % sequence identity compared to S 1 nuclease, but showing an almost complete conservation of structurally and functionally important residues. Soaking and co-crystallisation experiments with substrate analogues have been carried out in order to obtain an enzyme-substrate complex. These efforts have not resulted in the structure determination of any complexes under crystallisation conditions: no binding of substrate has been observed. Nevertheless, an enzyme mechanism has been proposed based on structural data of S 1 nuclease and nucleases with similar active sites. The Crystal Structure of an Sm-Related Protein from Archaeoglobus fulgidus In eukaryotes Sm and Sm-like proteins are the core components of the small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs), which are involved in a variety of functions including rRNA processing, tRNA maturation and pre-mRNA processing. The Sm proteins are 70 to 120 amino acids long and share a common bi-partite signature sequence. The spliceosome, where the transesterification reaction of splicing occurs, is assembled by several snRNPs named after their constituting snRNA: U1, U2, U4, U5 and U6. An snRNA contains a short single stranded, uridine rich sequence motif, where the Sm proteins bind, but the three-dimensional arrangement of the Sm proteins and the mode of binding is unknown. In humans there are seven different canonical Sm proteins, which according to biochemical and electron microscopic studies seem to form a seven membered ring in vitro. Recently two crystal structures of human Sm protein dimers have been published. Interestingly Sm-related protein sequences have been found in the available genomic database of various Archaebacteria based on sequence homology. In contrast with eukaryotes only one or two Sm-related protein sequences have been identified in one organism. Their function is currently unknown, since analogous pre-mRNA splicing does not occur in Archaebacteria. Two Sm-related proteins of Archaeoglobus fulgidus have been cloned and expressed as fusion proteins. One of them called AF-Sm2 has been o crystallised utilising ammonium sulphate as precipitant and solved to 1.95 A resolution by SIRAS using a single mercury derivative. AF-Sm2 crystallises in a hexagonal space group (P6) and contains one molecule per asymmetric unit. The 77 residue long protein has a very similar fold compared to the solved human Sm protein structures: a short N-terminal a-helix followed by a five stranded, strongly bent, U-shaped ~-sheet resulting in a barrel-like overall fold. Six AF-Sm2 molecules form a ring in the crystal structure mediated by extensive hydrophobic and hydrogen-bonding interactions. Gel filtration experiments have indicated a pH dependence of oligomerisation in accordance with the crystallisation experiences. Currently the target of the Sm-related proteins of Archaeoglobus fulgidus and the stochiometry of oligomerisation in vivo is completely unknown.

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FREITAS, A. C. Produção de proteases por Aspergillus em fermentação semi-sólida utilizando torta de canola. 83 f. 2009. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. / Submitted by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2016-03-21T19:12:22Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_acfreitas.pdf: 1152918 bytes, checksum: 4a33865f89d978715f9c8c42e00d1485 (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa(mmarlene@ufc.br) on 2016-03-28T17:44:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_acfreitas.pdf: 1152918 bytes, checksum: 4a33865f89d978715f9c8c42e00d1485 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-28T17:44:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_acfreitas.pdf: 1152918 bytes, checksum: 4a33865f89d978715f9c8c42e00d1485 (MD5) Previous issue date: 2009-02-19 / The proteases belong to the class of enzymes with the capacity to hydrolyze peptidic connections into protein and protein fragments, modifying the substrate by great selectivity and specification. The semi-solid fermentation is a fermentation process in which the growth of microorganisms and the formation of the products occur on the surface of the solid substrate next to the absence of free water, usually using natural raw materials as a source of carbon and energy. On this study, it was done the semi solid cultivation of filament fungi, in order to produce proteases using as a substrate a cake of canola. It was evaluated, in a first study, the potential of different strains of Aspergillus for the production of proteases. The strains studied were Aspergillus niger (CNPAT 001, IOC 207, IOC 4222, IOC 4220 and IOC 3883) and Aspergillus oryzae IV. The best strain obtained for the production of protease was a strain of Aspergillus oryzae IV. Later on, it was studied the influence of the different quantities of water and coke canola added; the best production was obtained in proportion with 40 mL of water to 100 g of cake. After determination to medium of moisture, was evaluated the temperature of incubation, the best results were obtained in media incubated at 20° C. Further, studies were done to determine the best concentration of inoculum, the concentrations tested were 1 × 104, 1 × 105, 1 × 106 and 1 × 107 spores per gram of medium, being 1 × 107 to better concentration analyzed. The influence of supplementation of fermentation medium with sources of phosphorus, carbon and nitrogen was evalueted. Supplementation of the cake of canola, with 1% (w/w) monobasic sodium phosphate did not influence positively the production of proteases. Supplementation of medium with different sources of nitrogen were studied in the proportion of 1.0% (w/w) in the weight of the substrate, being the yeast extract of the best source evaluated, showing increased production of proteases. Then, it was tested the incubation period of the medium without supplementation of nutrients, between 0 and 240 hours of fermentation with samples being removed every 24 h of fermentation process. The highest production occurred at 96 h with production of 336 U.g-1 protease. After this stage, was evaluated the supplementation of medium with different carbon sources at different concentrations, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.5, 10.0, 12, 5 15.0 % (w/w) in the weight of the substrate; the increased production of proteases occurred in the medium with the addition of glucose at a concentration of 7.5 % obtaining 452 Ug-1. In the last stage, was performed the characterization of the medium during the fermentation process by of a chemical and physicochemical analytical determinations. The increased production of proteases obtained was 452 U.g-1 in 96 hours of fermentation process, in media supplemented with 7.5 % glucose, at the fermentation conditions: temperature of incubation of the medium at 20° C, damp cake with 40 mL water per 100 g of substrate and concentration of inoculum of 1 × 107 spores.g-1. / As proteases fazem parte da classe de enzimas com a capacidade de hidrolisar ligações peptídicas em proteínas e fragmentos de proteínas, modificando os substratos com grande seletividade e especificidade. A fermentação semi-sólida é um processo fermentativo no qual o crescimento do microrganismo e a formação dos produtos ocorrem na superfície do substrato sólido próximo à ausência de água livre, geralmente utilizando matéria-prima natural como fonte de carbono e energia. Realizou-se neste estudo o cultivo semi-sólido de fungos filamentosos, visando à produção de proteases utilizando como substrato a torta de canola. Avaliando-se, em um primeiro estudo, o potencial de diferentes linhagens de Aspergillus para a produção de proteases. As linhagens estudadas foram Aspergillus niger (CNPAT 001, IOC 207, IOC 4222, IOC 4220 e IOC 3883) e Aspergillus oryzae IV. A melhor linhagem obtida para a produção de protease foi a linhagem de Aspergillus oryzae IV. Em seguida, estudou-se a influência da adição de diferentes volumes de água a torta, onde a melhor produção foi obtida nos meios com proporção 40 mL de água para 100 g de torta. Determinada a melhor umidade do meio, avaliou-se a temperatura de incubação, os melhores resultados obtidos foram em meios incubados a 20°C. Na sequência, foram feitos estudos para determinação da melhor concentração de inóculo, as concentrações testas foram 1×104, 1×105, 1×106 e 1×107 esporos por grama de meio, sendo 1×107 a melhor concentração analisada. Avaliou-se a influência da suplementação do meio fermentativo com fontes de fósforo, carbono e nitrogênio. A suplementação da torta de canola, com 1% (m/m) de fosfato de sódio monobásico não influenciou positivamente na produção de proteases. A suplementação do meio com diferentes fontes de nitrogênio foram estudadas na proporção de 1,0 % (m/m) em relação ao peso do substrato, sendo o extrato de levedura a melhor fonte avaliada, apresentando maior produção de proteases. Em seguida, testou-se o período de incubação do meio sem suplementação de nutrientes, entre 0 e 240 horas de fermentação com amostras sendo retiradas a cada 24 h de processo fermentativo. A maior produção ocorreu em 96 h com produção de 336 U.g-1 de proteases. Após esta etapa, avaliou-se a suplementação do meio com diferentes fontes de carbono em diferentes concentrações, 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 15,0 % (m/m) em relação ao peso do substrato, a maior produção de proteases ocorreu no meio com adição de glicose na concentração de 7,5 % obtendo 452 U.g-1. Na última etapa, fez-se a caracterização do meio ao longo do processo fermentativo, através de determinações analíticas de ordem químicas e físico-químicas. A maior produção de proteases obtida foi de 452 U.g-1 em 96 horas de processo fermentativo, nos meios suplementados com 7,5 % de glicose, nas seguintes condições fermentativas: temperatura de incubação do meio a 20°C, torta umedecida com 40 mL de água por 100 g de substrato e concentração de inóculo de 1×107 esporos.g-1.

O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos de doses dietéticas crescentes de um produto comercial com atividade amilolítica (AmaizeTM, Alltech Inc., Nicholasville, KY, EUA) na ingestão e digestibilidade aparente total de nutrientes, índice de seleção, fermentação ruminal, produção e composição do leite, perfil metabólico, balanço de energia e nitrogênio em vacas no terço médio de lactação. Foram utilizadas vinte e quatro vacas multíparas da raça Holandesa (162,29 ± 107,96 dias em lactação e 31,60 ± 6,51 kg/d de produção de leite, no início do experimento), sendo que 8 delas possuíam cânulas ruminais, distribuídas em seis quadrados Latinos 4 × 4 contemporâneos e balanceados de acordo com a produção de leite, dias em lactação e o peso corporal dos animais. Os períodos experimentais tiveram duração de 14 dias de adaptação aos tratamentos e 7 dias de amostragem. Os tratamentos foram: dieta basal sem adição de enzima amilolítica ou controle (CON), e dieta basal com adição de 150, 300 ou 450 FAU/kg de MS da dieta (A150, A300 ou A450, respectivamente). Uma FAU (unidade de amilase fúngica) é a quantidade de enzima capaz de dextrinizar amido solúvel na taxa de 1 g/h a 30°C e pH de 4,8. A ingestão média esperada do produto comercial pelos animais foi de 7,37; 14,45; e 21,97 g/d nos tratamentos A150, A300 e A450, respectivamente. Os tratamentos não influenciaram a ingestão de MS e de nutrientes, como também o índice de seleção. Os tratamentos não influenciaram a digestibilidade do amido; porém, a inclusão de enzimas amilolíticas aumentou linearmente a digestibilidade de proteína bruta e tendeu a aumentar linearmente a digestibilidade da MS. Os tratamentos com atividade amilolítica não afetaram o pH e a concentração de amônia no fluído ruminal. A adição de enzimas amilolíticas aumentou linearmente a produção de iso-valerato no rúmen. Além disso, os tratamentos não influenciaram a produção e composição do leite, assim como a eficiência alimentar (kg leite / ingestão de MS) dos animais. A enzima amilolítica aumentou linearmente o peso corporal. Apesar de não alterar a composição do leite, a suplementação com enzima amilolítica diminuiu linearmente a excreção de nitrogênio no leite. As doses crescentes de enzima amilolítica tenderam a diminuir linearmente a eficiência de síntese de proteína microbiana. Não foram observadas diferenças nas concentrações séricas de glicose, ureia, e enzimas que indicam lesões hepáticas. A suplementação com doses crescentes enzima amilolítica não afetou a eficiência alimentar, produção de propionato e de proteína microbiana no rúmen, e perfil metabólico de vacas em lactação. No entanto, os tratamentos aumentaram linearmente a digestibilidade de proteína bruta e o peso corporal das vacas / The objective of the current study was to determine the effects of increasing dietary doses of a commercial product with amylolytic activity (AmaizeTM, Alltech Inc., Nicholasville, KY, USA) on nutrient intake and total apparent digestibility, sorting index, ruminal fermentation, milk yield and composition, serum metabolic profile, energy and nitrogen utilization of midlactating dairy cows. Twenty-four multiparous Holstein cows (162.29 ± 107.96 days in milk and 31.60 ± 6.51 kg/d milk yield, before starting the experiment), in which 8 were ruminally cannulated, were used in a replicated 4 × 4 Latin experiment design. The squares were contemporaneous and balanced for milk production, days in milk and live weight of cows. The experimental periods consisted of 14 days to treatments adaptation and 7 days for sampling. Treatments were composed of: basal diet with no enzyme or control (CON), and basal diet with addition of 150, 300 or 450 FAU/kg diet DM (A150, A300 or A450, respectively). One FAU (fungal amylase unit) is able to dextrinize soluble starch at rate of 1g/h on 30°C and pH 4.8. The expected average intake of the commercial product for treatments A150, A300 and A450 were 7.37, 14.45 and 21.97 g/d, respectively. Treatments did not influence the DM and nutrient intake, as well as the sorting index. Treatments did not alter starch digestibility; however, they linearly increased the crude protein digestibility and tended to linearly increase the DM digestibility. Treatments with amylolytic activity did not affect the pH and ammonia concentrations of ruminal fluid. The addition of amylolytic enzyme linearly increased the iso-valerate production in the rumen. In addition, treatments did not influence the milk yield and composition, as well as the milk production efficiency (kg of milk / DM intake) of animals. Treatments linearly increased the live weight and maintenance energy utilization of cows. Despite the enzyme supplementation did not alter the milk composition, it linearly decreased the milk nitrogen excretion. Treatments tended to linearly decreased the efficiency of microbial protein synthesis. No differences were observed on serum metabolic profile of animals, including concentrations of glucose, urea and enzymes which indicate hepatic damage. The supplementation with increasing doses of amylolytic enzymes did not affect the milk production efficiency, ruminal propionate production and microbial protein synthesis, and serum metabolic profile of mid-lactating dairy cows. However, treatments linearly increased the crude protein digestibility and live weight of cows

As proteases fazem parte da classe de enzimas com a capacidade de hidrolisar ligaÃÃes peptÃdicas em proteÃnas e fragmentos de proteÃnas, modificando os substratos com grande seletividade e especificidade. A fermentaÃÃo semi-sÃlida à um processo fermentativo no qual o crescimento do microrganismo e a formaÃÃo dos produtos ocorrem na superfÃcie do substrato sÃlido prÃximo à ausÃncia de Ãgua livre, geralmente utilizando matÃria-prima natural como fonte de carbono e energia. Realizou-se neste estudo o cultivo semi-sÃlido de fungos filamentosos, visando à produÃÃo de proteases utilizando como substrato a torta de canola. Avaliando-se, em um primeiro estudo, o potencial de diferentes linhagens de Aspergillus para a produÃÃo de proteases. As linhagens estudadas foram Aspergillus niger (CNPAT 001, IOC 207, IOC 4222, IOC 4220 e IOC 3883) e Aspergillus oryzae IV. A melhor linhagem obtida para a produÃÃo de protease foi a linhagem de Aspergillus oryzae IV. Em seguida, estudou-se a influÃncia da adiÃÃo de diferentes volumes de Ãgua a torta, onde a melhor produÃÃo foi obtida nos meios com proporÃÃo 40 mL de Ãgua para 100 g de torta. Determinada a melhor umidade do meio, avaliou-se a temperatura de incubaÃÃo, os melhores resultados obtidos foram em meios incubados a 20ÂC. Na sequÃncia, foram feitos estudos para determinaÃÃo da melhor concentraÃÃo de inÃculo, as concentraÃÃes testas foram 1Ã104, 1Ã105, 1Ã106 e 1Ã107 esporos por grama de meio, sendo 1Ã107 a melhor concentraÃÃo analisada. Avaliou-se a influÃncia da suplementaÃÃo do meio fermentativo com fontes de fÃsforo, carbono e nitrogÃnio. A suplementaÃÃo da torta de canola, com 1% (m/m) de fosfato de sÃdio monobÃsico nÃo influenciou positivamente na produÃÃo de proteases. A suplementaÃÃo do meio com diferentes fontes de nitrogÃnio foram estudadas na proporÃÃo de 1,0 % (m/m) em relaÃÃo ao peso do substrato, sendo o extrato de levedura a melhor fonte avaliada, apresentando maior produÃÃo de proteases. Em seguida, testou-se o perÃodo de incubaÃÃo do meio sem suplementaÃÃo de nutrientes, entre 0 e 240 horas de fermentaÃÃo com amostras sendo retiradas a cada 24 h de processo fermentativo. A maior produÃÃo ocorreu em 96 h com produÃÃo de 336 U.g-1 de proteases. ApÃs esta etapa, avaliou-se a suplementaÃÃo do meio com diferentes fontes de carbono em diferentes concentraÃÃes, 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 15,0 % (m/m) em relaÃÃo ao peso do substrato, a maior produÃÃo de proteases ocorreu no meio com adiÃÃo de glicose na concentraÃÃo de 7,5 % obtendo 452 U.g-1. Na Ãltima etapa, fez-se a caracterizaÃÃo do meio ao longo do processo fermentativo, atravÃs de determinaÃÃes analÃticas de ordem quÃmicas e fÃsico-quÃmicas. A maior produÃÃo de proteases obtida foi de 452 U.g-1 em 96 horas de processo fermentativo, nos meios suplementados com 7,5 % de glicose, nas seguintes condiÃÃes fermentativas: temperatura de incubaÃÃo do meio a 20ÂC, torta umedecida com 40 mL de Ãgua por 100 g de substrato e concentraÃÃo de inÃculo de 1Ã107 esporos.g-1. / The proteases belong to the class of enzymes with the capacity to hydrolyze peptidic connections into protein and protein fragments, modifying the substrate by great selectivity and specification. The semi-solid fermentation is a fermentation process in which the growth of microorganisms and the formation of the products occur on the surface of the solid substrate next to the absence of free water, usually using natural raw materials as a source of carbon and energy. On this study, it was done the semi solid cultivation of filament fungi, in order to produce proteases using as a substrate a cake of canola. It was evaluated, in a first study, the potential of different strains of Aspergillus for the production of proteases. The strains studied were Aspergillus niger (CNPAT 001, IOC 207, IOC 4222, IOC 4220 and IOC 3883) and Aspergillus oryzae IV. The best strain obtained for the production of protease was a strain of Aspergillus oryzae IV. Later on, it was studied the influence of the different quantities of water and coke canola added; the best production was obtained in proportion with 40 mL of water to 100 g of cake. After determination to medium of moisture, was evaluated the temperature of incubation, the best results were obtained in media incubated at 20 C. Further, studies were done to determine the best concentration of inoculum, the concentrations tested were 1 à 104, 1 à 105, 1 à 106 and 1 à 107 spores per gram of medium, being 1 à 107 to better concentration analyzed. The influence of supplementation of fermentation medium with sources of phosphorus, carbon and nitrogen was evalueted. Supplementation of the cake of canola, with 1% (w/w) monobasic sodium phosphate did not influence positively the production of proteases. Supplementation of medium with different sources of nitrogen were studied in the proportion of 1.0% (w/w) in the weight of the substrate, being the yeast extract of the best source evaluated, showing increased production of proteases. Then, it was tested the incubation period of the medium without supplementation of nutrients, between 0 and 240 hours of fermentation with samples being removed every 24 h of fermentation process. The highest production occurred at 96 h with production of 336 U.g-1 protease. After this stage, was evaluated the supplementation of medium with different carbon sources at different concentrations, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.5, 10.0, 12, 5 15.0 % (w/w) in the weight of the substrate; the increased production of proteases occurred in the medium with the addition of glucose at a concentration of 7.5 % obtaining 452 Ug-1. In the last stage, was performed the characterization of the medium during the fermentation process by of a chemical and physicochemical analytical determinations. The increased production of proteases obtained was 452 U.g-1 in 96 hours of fermentation process, in media supplemented with 7.5 % glucose, at the fermentation conditions: temperature of incubation of the medium at 20 C, damp cake with 40 mL water per 100 g of substrate and concentration of inoculum of 1 à 107 spores.g-1.

O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos de doses dietéticas crescentes de um produto comercial com atividade amilolítica (AmaizeTM, Alltech Inc., Nicholasville, KY, EUA) na ingestão e digestibilidade aparente total de nutrientes, índice de seleção, fermentação ruminal, produção e composição do leite, perfil metabólico, balanço de energia e nitrogênio em vacas no terço médio de lactação. Foram utilizadas vinte e quatro vacas multíparas da raça Holandesa (162,29 ± 107,96 dias em lactação e 31,60 ± 6,51 kg/d de produção de leite, no início do experimento), sendo que 8 delas possuíam cânulas ruminais, distribuídas em seis quadrados Latinos 4 × 4 contemporâneos e balanceados de acordo com a produção de leite, dias em lactação e o peso corporal dos animais. Os períodos experimentais tiveram duração de 14 dias de adaptação aos tratamentos e 7 dias de amostragem. Os tratamentos foram: dieta basal sem adição de enzima amilolítica ou controle (CON), e dieta basal com adição de 150, 300 ou 450 FAU/kg de MS da dieta (A150, A300 ou A450, respectivamente). Uma FAU (unidade de amilase fúngica) é a quantidade de enzima capaz de dextrinizar amido solúvel na taxa de 1 g/h a 30°C e pH de 4,8. A ingestão média esperada do produto comercial pelos animais foi de 7,37; 14,45; e 21,97 g/d nos tratamentos A150, A300 e A450, respectivamente. Os tratamentos não influenciaram a ingestão de MS e de nutrientes, como também o índice de seleção. Os tratamentos não influenciaram a digestibilidade do amido; porém, a inclusão de enzimas amilolíticas aumentou linearmente a digestibilidade de proteína bruta e tendeu a aumentar linearmente a digestibilidade da MS. Os tratamentos com atividade amilolítica não afetaram o pH e a concentração de amônia no fluído ruminal. A adição de enzimas amilolíticas aumentou linearmente a produção de iso-valerato no rúmen. Além disso, os tratamentos não influenciaram a produção e composição do leite, assim como a eficiência alimentar (kg leite / ingestão de MS) dos animais. A enzima amilolítica aumentou linearmente o peso corporal. Apesar de não alterar a composição do leite, a suplementação com enzima amilolítica diminuiu linearmente a excreção de nitrogênio no leite. As doses crescentes de enzima amilolítica tenderam a diminuir linearmente a eficiência de síntese de proteína microbiana. Não foram observadas diferenças nas concentrações séricas de glicose, ureia, e enzimas que indicam lesões hepáticas. A suplementação com doses crescentes enzima amilolítica não afetou a eficiência alimentar, produção de propionato e de proteína microbiana no rúmen, e perfil metabólico de vacas em lactação. No entanto, os tratamentos aumentaram linearmente a digestibilidade de proteína bruta e o peso corporal das vacas / The objective of the current study was to determine the effects of increasing dietary doses of a commercial product with amylolytic activity (AmaizeTM, Alltech Inc., Nicholasville, KY, USA) on nutrient intake and total apparent digestibility, sorting index, ruminal fermentation, milk yield and composition, serum metabolic profile, energy and nitrogen utilization of midlactating dairy cows. Twenty-four multiparous Holstein cows (162.29 ± 107.96 days in milk and 31.60 ± 6.51 kg/d milk yield, before starting the experiment), in which 8 were ruminally cannulated, were used in a replicated 4 × 4 Latin experiment design. The squares were contemporaneous and balanced for milk production, days in milk and live weight of cows. The experimental periods consisted of 14 days to treatments adaptation and 7 days for sampling. Treatments were composed of: basal diet with no enzyme or control (CON), and basal diet with addition of 150, 300 or 450 FAU/kg diet DM (A150, A300 or A450, respectively). One FAU (fungal amylase unit) is able to dextrinize soluble starch at rate of 1g/h on 30°C and pH 4.8. The expected average intake of the commercial product for treatments A150, A300 and A450 were 7.37, 14.45 and 21.97 g/d, respectively. Treatments did not influence the DM and nutrient intake, as well as the sorting index. Treatments did not alter starch digestibility; however, they linearly increased the crude protein digestibility and tended to linearly increase the DM digestibility. Treatments with amylolytic activity did not affect the pH and ammonia concentrations of ruminal fluid. The addition of amylolytic enzyme linearly increased the iso-valerate production in the rumen. In addition, treatments did not influence the milk yield and composition, as well as the milk production efficiency (kg of milk / DM intake) of animals. Treatments linearly increased the live weight and maintenance energy utilization of cows. Despite the enzyme supplementation did not alter the milk composition, it linearly decreased the milk nitrogen excretion. Treatments tended to linearly decreased the efficiency of microbial protein synthesis. No differences were observed on serum metabolic profile of animals, including concentrations of glucose, urea and enzymes which indicate hepatic damage. The supplementation with increasing doses of amylolytic enzymes did not affect the milk production efficiency, ruminal propionate production and microbial protein synthesis, and serum metabolic profile of mid-lactating dairy cows. However, treatments linearly increased the crude protein digestibility and live weight of cows

Orientador: Hélia Harumi Sato / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-20T21:23:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_RuannJanserSoaresde_M.pdf: 2807315 bytes, checksum: e6965e5648d4556cb18db9b7869a58c4 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As proteases constituem um dos mais importantes grupos de enzimas produzidos comercialmente, apresentando diversas aplicações nas indústrias de alimentos e farmacêutica. A utilização de proteases na hidrólise enzimática de proteínas para obtenção de peptídeos com propriedades antioxidantes tem recebido grande notoriedade nas pesquisas científicas. Nesse contexto, o presente trabalho visou estudar a produção e caracterização bioquímica de protease de Aspergillus oryzae LBA 01 obtida por processo fermentativo em estado sólido e avaliar a aplicação desta protease e de preparações comerciais na hidrólise de proteínas para obtenção de hidrolisados com atividade antioxidante. A maior produção de protease por A. oryzae LBA 01 foi observada em meio de cultivo composto de farelo de trigo, peptona (2,0% p/p) e extrato de levedura (2,0% p/p) sob as seguintes condições: 50,0% de umidade inicial, inóculo de 107 esporos.g-1 e incubação a 23°C por 72h. A caracterização bioquímica, realizada por planejamento experimental, mostrou que a protease apresentou maior atividade na faixa de pH 5,0-5,5 e 55-60°C, e estabilidade no intervalo de pH 4,5-6,0 após 1h de tratamento na faixa de temperatura de 35-45°C. Proteína isolada de soja, soro de leite e clara de ovo apresentaram aumento expressivo nas suas propriedades antioxidantes quando hidrolisadas com diferentes proteases microbianas. A aplicação de protease comercial Flavourzyme® 500L, obtida de A. oryzae, para a hidrólise de proteína isolada de soja, resultou na obtenção de hidrolisados com maior atividade antioxidante quando comparados aos hidrolisados preparados com as proteases de A. oryzae LBA 01 e a protease comercial Alcalase® 2.4L de Bacillus licheniformis. As condições de hidrólise, definidas a partir de delineamento composto central rotacional (DCCR), foram: concentração de substrato de 90,0 mg.mL-1 e adição de 70,0 U de protease por mL de mistura reacional (U.mL-1), resultando em 775,17 e 11,83 Trolox EQ µmol.g-1, para os ensaios de ORAC e DPPH, respectivamente. Os hidrolisados de soro de leite com maior capacidade antioxidante foram obtidos com a protease de A. oryzae LBA 01. A adição de 70,0 U.mL-1 de protease a solução de soro de leite 80,0 mg.mL-1, resultou em 424,32 e 16,39 Trolox EQ µmol.g-1, para os ensaios de ORAC e DPPH, respectivamente. Na preparação de hidrolisados de proteínas de clara de ovo, a utilização de 30,0 mg.mL-1 de substrato e 20,0 U.mL-1 da protease comercial Flavourzyme® 500L de A. oryzae, resultou em 1.193,12 e 19,05 Trolox EQ µmol.g-1 para os ensaios de ORAC e DPPH, respectivamente. Os maiores valores de atividade antioxidante, para os três substratos, foram detectados entre 30 e 180 minutos de incubação, onde o grau de hidrólise variou de 40,0 a 66,0%. Os resultados obtidos mostraram que a preparação de protease de A. oryzae LBA 01 obtida por fermentação em estado sólido e posterior concentração por precipitação com sulfato de amônio, diálise e liofilização, apresentou atividade enzimática semelhante às preparações comerciais avaliadas, tendo, portanto, potencial para aplicação na hidrólise proteica. A hidrólise enzimática, nas condições de estudo avaliadas, aumentou de 2 a 23 vezes a capacidade antioxidante de proteína isolada de soja, soro de leite e clara de ovo, mostrando-se um processo eficaz para obtenção de peptídeos com atividade antioxidante / Abstract: Proteases are one of the most important groups of enzymes produced commercially, with several applications in the food and pharmaceutical industries. The use of proteases in the enzymatic hydrolysis of proteins to obtain peptides with antioxidant properties has gained great notoriety in scientific research. In this context, the main objectives of the present study were to optimize the production of the protease from Aspergillus oryzae LBA 01 by solid state fermentation, and to determine its biochemical characteristics. The application of this protease and of commercial preparations to protein hydrolysis, and the study of the antioxidant properties of the hydrolysates obtained, was evaluated. The optimum fermentation medium was composed of wheat bran, 2.0% (w/w) peptone and 2.0% (w/w) yeast extract, and the conditions for maximum protease production were an initial moisture content of 50.0%, an inoculum level of 107 spores.g-1 and incubation at 23°C for 72h. The biochemical characterization, evaluated using an experimental design, showed that the enzyme was most active in the pH range 5.0-5.5 and 55-60°C. The enzyme was stable from pH 4.5 to 6.0 after 1h incubation at 35-45°C. Soy protein isolate, bovine whey protein and egg white protein exhibited increases in antioxidant activity when hydrolyzed with the different microbial proteases. For the hydrolysis of soy protein isolate, application of the commercial protease Flavourzyme® 500L from A. oryzae resulted in hydrolysates with greater antioxidant activity as compared to hydrolysates prepared with the protease from A. oryzae LBA 01 and the commercial protease Alcalase® 2.4L from Bacillus licheniformis. The hydrolysis conditions, as defined by a central composite rotational design (CCRD), were: 90.0 mg.mL-1 substrate concentration plus 70.0 U of protease per mL of reaction mixture (U.mL-1), which resulted in 775.17 and 11.83 Trolox EQ µmol.g-1 as determined by the ORAC and DPPH assays, respectively. For the whey protein hydrolysates, the greatest antioxidant activity was obtained with the protease from A. oryzae LBA 01. According to the CCRD, the use of 80.0 mg.mL-1 of bovine whey protein and 70.0 U.mL-1 of protease resulted in 424.32 and 16.39 Trolox EQ µmol.g-1, respectively, as determined by the ORAC and DPPH assays. For the egg white protein, hydrolysis with 20.0 U.mL-1 of Flavourzyme® 500L from A. oryzae with 30.0 mg.mL-1 substrate concentration, resulted in 19.05 and 1,193.12 Trolox EQ µmol.g-1, respectively, as determined by the ORAC and DPPH assays. The maximum antioxidant activities were obtained in the range from 30 to 180 min of hydrolysis, with a degree of hydrolysis of about 40.0-66.0%. The results showed that the protease preparation from A. oryzae LBA 01 obtained by solid state fermentation produced enzymatic activity similar to that of the commercial preparations, and was an attractive enzyme to apply in protein hydrolysis. Under the conditions evaluated in this study, enzymatic hydrolysis resulted in a 2.0- to 23.0-fold increases in antioxidant activity for the soy protein isolate, bovine whey protein and egg white protein, being an effective process to obtain peptides with antioxidant activity / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

Xylanase was purified from the crude culture of Aspergillus oryzae DSM1863 by sephadex G200 and DEAE – cellulose ion exchange chromatography. The molecular mass of the purified xylanase determined by SDS–PAGE was 21 kDa with a specific activity of 6768 U/mg towards 1% (w/v) of birch wood xylan. The optimum temperature was observed at 60°C. The enzyme was thermostable in the temperature range of 37-50°C with a high residual activity of 62-74% (650.6- 775.9 U/mg protein). / Enzyme xylanase được tinh sạch từ dịch lên men của chủng Aspergillus oryzae DSM1863 sau khi qua cột sắc ký lọc gel sephadex G200 và sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose. Khối lượng phân tử của enzyme xylanase tinh sạch được xác định bằng điên di đồ SDS- PAGE. Xylanase tinh sạch có kích thước là 21 kDa với hoạt tính đặc hiệu đạt 6768 U/mg sau khi được xác định với nồng độ cơ chất là 1% birch wood xylan. Nhiệt độ tối ưu để enzyme hoạt động mạnh nhất là 60°C. Enzyme xylanase khá bền nhiệt. Hoạt tính của enzyme vẫn còn duy trì 62-74% (hoạt tính đặc hiệu đạt 650.6-775.9 U/mg protein) sau khi 8 giờ ủ ở 37-50°C.

Os frutooligossacarídeos (FOS) são oligômeros de frutose, cujas unidades frutosil estão ligadas na posição β-(2→1) na molécula de sacarose. Esses açúcares, de baixa caloria, são classificados com prebióticos, não são cariogênicos, podem ser usados por diabéticos, são de 0,4 a 0,6 vezes menos doce que a sacarose, sendo amplamente utilizados pelas indústrias farmacêutica e de alimentos como açúcares funcionais. Apesar dos FOS serem produzidos naturalmente por enzimas presentes em diversos vegetais, são disponibilizados comercialmente por meio da produção sintética, utilizando enzimas de origem microbiana como as frutosiltransferases (FTases, E.C.2.4.1.9) e sacarose como principal substrato. Diante deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo a produção de FTases extracelular e micelial de Aspergillus oryzae IPT-301 por fermentação submersa aeróbia utilizando meio de cultura sintético, assim como a caracterização e estudos cinéticos das enzimas produzidas. Também foram investigados os efeitos da temperatura e pH do meio reacional nas atividades enzimáticas mediante técnica de planejamento experimental. Para a produção de FTases foi necessário o cultivo do micro-organismo em meio de cultura estéril e a fermentação foi conduzida em agitador orbital do tipo shaker. Com o caldo de fermentação filtrado e o micélio úmido foi possível determinar as atividades de transfrutosilação (quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol de FOS por minuto nas condições experimentais) e hidrolítica (quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de frutose por minuto nas condições experimentais) extracelular e micelial, respectivamente, para as diferentes condições experimentais avaliadas. A concentração máxima de biomassa celular obtida foi de 9,35 ± 1,26 g.L-1 em 48 h de fermentação, sendo que em 76 h, houve a produção de 7,51 ± 1,57 g.L-1, período em que ocorreu a acidificação do caldo fermentado (pH 4,82). As condições nas quais a enzima extracelular obteve maior atividade de transfrutosilação foi aquela produzida em 64 h de fermentação, incubada na faixa de pH 4,5-6,0, temperatura reacional de 50 °C, concentração de sacarose a partir de 296,0 g.L-1, apresentando estabilidade entre 30 e 35 ºC e em pH 6,0. Por outro lado, a FTase micelial mostrou sua máxima atividade quando produzida em 72 h de fermentação, incubada na faixa de pH 4,5-6,0, temperatura reacional entre 45-55 °C, concentração de substrato igual a 470,6 g.L-1, indicando estabilidade para faixas de pH entre 6,0-8,0 e temperatura entre 30-40 ºC. A FTase extracelular apresentou cinética michaeliana em relação à concentração de substrato, exibindo valores de Vmax igual a 16,23 U.mL-1 e Km de 50,41 g.L-1 , enquanto a FTase micelial ajustou-se satisfatoriamente ao Modelo de Hill, cujos valores dos parâmetros Vmax, K0,5 e n foram iguais a 342,23 U.g-1 e 234,73 g.L-1 e 1,41, respectivamente. O estudo da influência do tempo e da temperatura reacional na síntese de FOS mostrou que a FTase extracelular produziu maior concentração de FOS a 50 °C, enquanto a FTase micelial a 40°C. A otimização do processo para a obtenção de FOS comprovou que a zona ótima da FTase extracelular (em que elevada atividade de transfrutosilação e baixa atividade hidrolítica são esperadas) ocorreu nas faixas de temperatura entre 45-50 °C e de pH entre 5,5-6,75. Para a FTase micelial, apenas a atividade de transfrutosilação ajustou-se satisfatoriamente ao modelo quadrático com interação, cuja zona ótima ocorreu em temperaturas superiores a 46 °C e valores de pH abaixo de 6,5. Os resultados obtidos atestaram que o fungo se destacou como fonte produtora de FTases e, estas, por sua vez, mostraram-se promissoras para a obtenção de FOS em escala laboratorial. / Fructooligosaccharides (FOS) are fructose oligomers in which the fructosyl units are bound in β-(2→1) position of sucrose molecule. These sugars, that present properties such as low caloric value and non-cariogenicity, are classified as prebiotics and can be used in diabetic products; they are 0.4 to 0.6 times less sweet than sucrose, being widely applied in the pharmaceutical and food industries as functional sugars. Despite the natural production of FOS by enzymes present in various vegetables, they are commercially available by synthetic production, using microbial enzymes such as fructosyltransferases (FTases, E.C.2.4.1.9) and sucrose as main substrate. In face of this context, the objective of the present study was the production of extracellular and mycelium FTases by Aspergillus oryzae IPT-301 from aerobic submerged fermentation using synthetic growth media, as well as the characterization of the enzymes produced and the conduction of kinetic studies. It was also investigated the temperature and pH effects of the growth media in the enzymatic activities through experimental planning. For FTases production was necessary the use of sterile growth media, and the fermentation was carried out in rotary shaker. With the filtered broth and the humid mycelium it was possible to determine the transfructosylation and hydrolytic activities of the extracellular and mycelium enzymes in different experimental conditions; the transfructosylation activity was defined as the amount of enzyme necessary to produce 1 µmol of FOS per minute under the experimental conditions, while the hydrolytic activity was defined as the amount of enzyme necessary to release 1 µmol of fructose per minute under the experimental conditions. The maximum biomass concentration (9.35 ± 1.26 g.L-1) was obtained in 48 h of fermentation; in 76 h there was a biomass production of 7.51 ± 1.57 g.L-1 and the acidification of the fermented broth (pH 4.82). The conditions in which was observed the maximum transfructosylation activity of the extracellular enzyme were 64 h of fermentation, pH range of 4.5 to 6.0, reactional temperature of 50 °C and sucrose concentration from 296.0 g.L-1; the thermal stability was between 30 and 35 °C and pH 6.0. On the other hand, mycelium FTase had its optimum in 72 h of fermentation, pH range of 4.5 to 6.0, reactional temperature between 45-55 °C and substrate concentration of 470.6 g.L-1; the thermal stability was between 30 and 40 °C and pH range 6.0 to 8.0. Extracellular FTase presented michaelian kinetic according to substrate concentration, showing Vmax and Km values of 16.23 U.mL-1 and 50.41 g.L-1, while micelial FTase fitted to Hill Model, whose Vmax, K0,5 e n values was 342.23 U.g-1 e 234.73 g.L-1 and 1.41, respectively. The study of reaction’s time and temperature showed that extracellular FTase produced a maximum concentration of FOS at 50 °C, while the micelial one at 40 °C. The process optimization for FOS production verified that the optimum zone for extracellular FTase, in which are expected high transfructosylation and low hydrolytic activities, occurred in temperature range of 45 - 50 °C and pH range of 5.5 - 6.75. For mycelium FTase, only the transfructosylation activity presented a satisfactory adjustment to the quadratic model with interaction, in which the optimum zone occurred in temperatures above 46 °C and pH values below 6.5. The results obtained showed that the fungus stood out as source of FTase, and these enzymes presented themselves as promising sources for FOS production in laboratorial scale. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

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