細胞為本生物檢測法（CBB）是指任何一種以細胞系統及其身上發生的生物反應為基礎原之直接檢測方法。在這篇文中，有關CBB 的工作大致分為個主要章節，描述如下： / 第一章節探討以可調控式納米孔為基礎的電阻脈衝感應檢測法（RPS）進人血紅細胞的毒學研究。我們成功檢測到血紅細胞在低滲環境下的體型大小變化，並以式細胞儀及激光共焦掃描顯微鏡驗證上述實驗結果。此外，我們亦使用重皂甙（PD）及四溴雙酚A（TBBPA）種化合物以進毒試驗。在此章節，我們展示以RPS 在人體細胞系統的首次應用。這種RPS 無疑成為一種創新及低成本的技術，有助快速研究與血液有關的疾病。 / 第二章節探討以細胞為本的納米毒學研究。由於納米子已被廣泛應用於生物醫學上，它的應用同時帶出有關其毒性及其帶出的健康問題。在這章節，我們主要研究種同塗層的納米條（Au-NRs），其塗層分別為十烷基三甲基溴化氨（CTAB）及聚乙二醇（PEG）。透過一在人嗜鹼性細胞KU812 的毒實驗，我們展示Au-NRs 的生物相容性取決於它的塗層。CTAB 塗層的Au-NRs 會引發KU812 細胞死亡及其過敏性反應，而PEG 塗層的Au-NRs 則會引發以上反應。 / Cell-based Bioassay (CBB) refers to any kind of assay which detection principle is based on direct monitoring of biological events in living cell systems.The work in this thesis is divided to two main chapters described as follows. / The first focus was the characterization of human erythrocytes toxicology using tunable nanopore-based resistive pulse sensing (RPS). We successfully monitored the size changes of the erythrocytes in hypotonic environment. Results were confirmed with flow cytometry and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Furthermore, drug assays were performed, in which the erythrocytes were treated with polyphyllin D (PD) or tetrabromobisphenol A (TBBPA). Here we reported the first application of the tunable nanopore-based RPS on human live cell system. This RPS system served as a novel and low-cost technique for rapid analysis of bloodrelated diseases at point-of-care. / Another focus was cell-based bioassays in nanotoxicology. As nanoparticles have been widely applied in biomedical and biological aspects, health issues have been raised and the toxicity of nanoparticles is much concerned. In this study, we investigated the cytotoxicity of CTAB- and PEG-coated gold nanorods (Au-NRs). Through a series of toxicological studies and using human basophils cell line KU812, we demonstrated the biocompatibility of coating of Au-NRs was critical to the cytotoxicity to cells. CTAB-coated Au-NRs, rather than PEG-coated Au-NRs, were able to induce cell death and allergic response in KU812 cells. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Cheung, Ka Lun. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2012. / Includes bibliographical references. / Abstracts also in Chinese. / Members of Examination Committee --- p.i / Declaration --- p.ii / Publications --- p.iii / Abstract --- p.iv / Acknowledgements --- p.viii / List of Figures --- p.xi / Table of Content --- p.xii / General Introduction --- p.1 / Chapter Chapter 1 --- Cell-based Bioassays using Resistive Pulse Sensing --- p.13 / Chapter 1.1 --- Introduction --- p.14 / Chapter 1.2 --- Materials and Methods --- p.26 / Chapter 1.2.1 --- Preparation of human erythrocytes --- p.26 / Chapter 1.2.2 --- Resistive pulse sensing (RPS) --- p.26 / Chapter 1.2.3 --- Hemolysis assay --- p.27 / Chapter 1.2.4 --- Osmolarity assay --- p.28 / Chapter 1.2.5 --- Confocal laser scanning microscopy --- p.28 / Chapter 1.2.6 --- Flow cytometry --- p.29 / Chapter 1.2.7 --- Polyphyllin D (PD) assay --- p.29 / Chapter 1.2.8 --- Tetrabromobisphenol A (TBBPA) assay --- p.30 / Chapter 1.2.9 --- Statistical analysis --- p.30 / Chapter 1.3 --- Results --- p.31 / Chapter 1.3.1 --- Measurement of human erythrocytes using RPS --- p.31 / Chapter 1.3.2 --- RPS measurement of human erythrocytes in hypotonic enviornment --- p.36 / Chapter 1.3.3 --- RPS measurement of PD-treated human erythrocytes --- p.48 / Chapter 1.3.4 --- RPS measurement of TBBPA-treated human erythrocytes --- p.55 / Chapter 1.4 --- Discussions and Conclusion --- p.64 / Chapter 1.5 --- References --- p.68 / Chapter Chapter 2 --- Cell-based Bioassays on Human Basophils --- p.71 / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.72 / Chapter 2.2 --- Materials and Methods --- p.74 / Chapter 2.2.1 --- Reagents --- p.74 / Chapter 2.2.2 --- Preparation of the CTAB-coated and PEG-coated nanorods --- p.74 / Chapter 2.2.3 --- Cell culture and preparation --- p.75 / Chapter 2.2.4 --- Alamar blue assay --- p.76 / Chapter 2.2.5 --- Calcein leakage assay and propidium iodide staining assays --- p.77 / Chapter 2.2.6 --- Histamine release assay --- p.78 / Chapter 2.2.7 --- Beta-hexosaminidase release assay --- p.79 / Chapter 2.2.8 --- Statistical analysis --- p.80 / Chapter 2.3 --- Results --- p.81 / Chapter 2.3.1 --- Physical and optical properties of the gold nanorods --- p.81 / Chapter 2.3.2 --- CTAB-, but not PEG-coated Au-NRs elicits allergic degranulation --- p.83 / Chapter 2.3.3 --- CTAB-coated Au-NRs are more cytotoxic than PEGcoated Au-NRs --- p.88 / Chapter 2.3.4 --- CTAB-, but not PEG-coated, Au-NRs cause plasma membrane permeabilization --- p.96 / Chapter 2.3.5 --- CTAB-, but not PEG-coated, Au-NRs disrupt plasma membrane asymmetry --- p.108 / Chapter 2.4 --- Discussions and Conclusion --- p.113 / Chapter 2.5 --- References --- p.116 / General Discussions and Conclusion --- p.118 / References --- p.124

Pureza é um dos principais atributos de qualidade de matérias-primas farmacêuticas, já que a identificação e determinação quantitativa de impurezas podem ajudar a controlar/minimizar o risco de efeitos adversos de medicamentos. O papel dos métodos de doseamento, tanto específicos como não específicos, em caracterizar a qualidade de matérias-primas farmacêuticas, tem sido questionado. Por outro lado, a abordagem do balanço de massas, que quantifica cada impureza orgânica bem como substâncias voláteis e cinzas, e então subtrai a soma destas impurezas de 100%, pode oferecer uma melhor maneira de determinar com exatidão se o fármaco atende aos critérios regulatórios de aceitação e de detectar com confiança mudanças não esperadas na qualidade do fármaco. O objetivo do estudo foi comparar métodos de doseamento compendiais com essa abordagem de balanço de massas na determinação do conteúdo de substância ativa e caracterização da qualidade de matérias-primas farmacêuticas. Os fármacos empregados neste estudo foram o nifedipino, o diazepam, a glibenclamida e a estavudina. A identificação e caracterização dos fármacos foram realizadas por meio de determinação do ponto de fusão e espectroscopia no infravermelho. Para a determinação quantitativa foram empregados os métodos presentes na Farmacopéia Brasileira, United States Pharmacopeia e British Pharmacopeia. O detector de aerossol carregado (CAD) foi acoplado ao sistema de cromatografia à líquido de alta eficiência para comparação das respostas com o detector ultravioleta. Os resultados demonstraram a viabilidade do método indireto, que oferece dados mais precisos que os do método direto, além de favorecer um controle de qualidade mais focado no perfil de impurezas. / Purity is one of the main attributes of quality of bulk drug materials, since the identification and quantitative determination of impurities can help to avoid or at least control/minimize the risk of their contribution to the side effects profile of drug materials. The role of assay methods, either specific or non-specific, in characterizing the quality of bulk drug materials, has been questioned. On the other hand, the mass balance approach, which quantifies every organic impurity as well as volatile substances and ashes, and then subtracts the sum of these impurities from 100%, can provide a better way to accurately determine if the drug substance meets the regulatory acceptance criteria and to reliably detect unexpected changes in the quality of the drug substance. The objective of this study was to compare compendial assay methods with a mass balance approach in the determination of the active ingredient content and characterization of the quality of bulk drug materials. The identification and characterization of the drugs were accomplished through determination of melting point and infrared spectroscopy. The methods from the Farmacopeia Brasileira, United States Pharmacopeia and British Pharmacopoeia were used for the quantitative determination of the drugs. The drug related impurities were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) equipped with an ultraviolet (UV) detector and charged aerossol detector (CAD) in tandem. The results demonstrated the feasibility of the indirect method, which offers more precise data than those from the direct method, besides it enables the quality control to be focused on the impurity profile.

Pureza é um dos principais atributos de qualidade de matérias-primas farmacêuticas, já que a identificação e determinação quantitativa de impurezas podem ajudar a controlar/minimizar o risco de efeitos adversos de medicamentos. O papel dos métodos de doseamento, tanto específicos como não específicos, em caracterizar a qualidade de matérias-primas farmacêuticas, tem sido questionado. Por outro lado, a abordagem do balanço de massas, que quantifica cada impureza orgânica bem como substâncias voláteis e cinzas, e então subtrai a soma destas impurezas de 100%, pode oferecer uma melhor maneira de determinar com exatidão se o fármaco atende aos critérios regulatórios de aceitação e de detectar com confiança mudanças não esperadas na qualidade do fármaco. O objetivo do estudo foi comparar métodos de doseamento compendiais com essa abordagem de balanço de massas na determinação do conteúdo de substância ativa e caracterização da qualidade de matérias-primas farmacêuticas. Os fármacos empregados neste estudo foram o nifedipino, o diazepam, a glibenclamida e a estavudina. A identificação e caracterização dos fármacos foram realizadas por meio de determinação do ponto de fusão e espectroscopia no infravermelho. Para a determinação quantitativa foram empregados os métodos presentes na Farmacopéia Brasileira, United States Pharmacopeia e British Pharmacopeia. O detector de aerossol carregado (CAD) foi acoplado ao sistema de cromatografia à líquido de alta eficiência para comparação das respostas com o detector ultravioleta. Os resultados demonstraram a viabilidade do método indireto, que oferece dados mais precisos que os do método direto, além de favorecer um controle de qualidade mais focado no perfil de impurezas. / Purity is one of the main attributes of quality of bulk drug materials, since the identification and quantitative determination of impurities can help to avoid or at least control/minimize the risk of their contribution to the side effects profile of drug materials. The role of assay methods, either specific or non-specific, in characterizing the quality of bulk drug materials, has been questioned. On the other hand, the mass balance approach, which quantifies every organic impurity as well as volatile substances and ashes, and then subtracts the sum of these impurities from 100%, can provide a better way to accurately determine if the drug substance meets the regulatory acceptance criteria and to reliably detect unexpected changes in the quality of the drug substance. The objective of this study was to compare compendial assay methods with a mass balance approach in the determination of the active ingredient content and characterization of the quality of bulk drug materials. The identification and characterization of the drugs were accomplished through determination of melting point and infrared spectroscopy. The methods from the Farmacopeia Brasileira, United States Pharmacopeia and British Pharmacopoeia were used for the quantitative determination of the drugs. The drug related impurities were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) equipped with an ultraviolet (UV) detector and charged aerossol detector (CAD) in tandem. The results demonstrated the feasibility of the indirect method, which offers more precise data than those from the direct method, besides it enables the quality control to be focused on the impurity profile.

Pureza é um dos principais atributos de qualidade de matérias-primas farmacêuticas, já que a identificação e determinação quantitativa de impurezas podem ajudar a controlar/minimizar o risco de efeitos adversos de medicamentos. O papel dos métodos de doseamento, tanto específicos como não específicos, em caracterizar a qualidade de matérias-primas farmacêuticas, tem sido questionado. Por outro lado, a abordagem do balanço de massas, que quantifica cada impureza orgânica bem como substâncias voláteis e cinzas, e então subtrai a soma destas impurezas de 100%, pode oferecer uma melhor maneira de determinar com exatidão se o fármaco atende aos critérios regulatórios de aceitação e de detectar com confiança mudanças não esperadas na qualidade do fármaco. O objetivo do estudo foi comparar métodos de doseamento compendiais com essa abordagem de balanço de massas na determinação do conteúdo de substância ativa e caracterização da qualidade de matérias-primas farmacêuticas. Os fármacos empregados neste estudo foram o nifedipino, o diazepam, a glibenclamida e a estavudina. A identificação e caracterização dos fármacos foram realizadas por meio de determinação do ponto de fusão e espectroscopia no infravermelho. Para a determinação quantitativa foram empregados os métodos presentes na Farmacopéia Brasileira, United States Pharmacopeia e British Pharmacopeia. O detector de aerossol carregado (CAD) foi acoplado ao sistema de cromatografia à líquido de alta eficiência para comparação das respostas com o detector ultravioleta. Os resultados demonstraram a viabilidade do método indireto, que oferece dados mais precisos que os do método direto, além de favorecer um controle de qualidade mais focado no perfil de impurezas. / Purity is one of the main attributes of quality of bulk drug materials, since the identification and quantitative determination of impurities can help to avoid or at least control/minimize the risk of their contribution to the side effects profile of drug materials. The role of assay methods, either specific or non-specific, in characterizing the quality of bulk drug materials, has been questioned. On the other hand, the mass balance approach, which quantifies every organic impurity as well as volatile substances and ashes, and then subtracts the sum of these impurities from 100%, can provide a better way to accurately determine if the drug substance meets the regulatory acceptance criteria and to reliably detect unexpected changes in the quality of the drug substance. The objective of this study was to compare compendial assay methods with a mass balance approach in the determination of the active ingredient content and characterization of the quality of bulk drug materials. The identification and characterization of the drugs were accomplished through determination of melting point and infrared spectroscopy. The methods from the Farmacopeia Brasileira, United States Pharmacopeia and British Pharmacopoeia were used for the quantitative determination of the drugs. The drug related impurities were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) equipped with an ultraviolet (UV) detector and charged aerossol detector (CAD) in tandem. The results demonstrated the feasibility of the indirect method, which offers more precise data than those from the direct method, besides it enables the quality control to be focused on the impurity profile.

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A a-Glutathiona-S-transferase (aGST) vem sendo proposta como um marcador sensível e não-invasivo de lesão hepática em pacientes com Hepatite pelo vírus C. Avaliamos neste trabalho como a (aGST) se correlaciona com características bioquímicas e histológicas em pacientes com HCV. MATERIAL E MÉTODOS: Realizamos a determinação da concentração plasmática das aGST, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e gama-glutamyltransferase (gGT) em 114 pacientes com HCV, dos quais 97 foram submetidos à biópsia hepática em até 6 meses da realização dos testes bioquímicos. Avaliamos também os níveis de aGST em 66 doadores de sangue sadios, que serviram como controles. Comparamos os níveis de aGST com as demais provas bioquímicas e a histologia hepática. RESULTADOS: A aGST estava elevada em 85.96% dos pacientes com HCV e mostrou associação com a elevação das aminotransferases (p<0.01). O valor de 4mg/dL mostrou as melhores sensibilidade (85,96%) e especificidade (92,42%) para determinar a normalidade do teste aGST. aGST ³ 8mg/dL mostrou a melhor especificidade para determinar lesão histológica hepática mais agressiva e o melhor valor preditivo positivo e razão de verossimilhança positiva para inflamação portal e atividade parenquimatosa mais agressiva nos pacientes com HCV. CONCLUSÕES: A aGST está relacionada à lesão hepática na infecção pelo HCV (valor de corte = 4mg/dL) e lesões histológicas hepáticas mais agressivas (valor de corte = 8mg/dL). Neste contexto, a aGST poderia ser utilizada em pacientes com Hepatite pelo HCV com ALT elevada, como um indicador complementar de lesão histopatológica mais agressiva. Entretanto, seu valor preditivo positivo não é suficientemente elevado para evitar a necessidade de realizar a biópsia hepática, mesmo quando está acima de 8mg/dL. / BACKGROUND/AIMS: a-Glutathione-S-transferase (aGST) has been proposed as a sensitive non-invasive indicator of hepatocellular injury due to Hepatitis C virus (HCV) infection. In this work, we evaluate how alpha-GST concentration correlates with biochemical and histological features in HCV patients. METHODS: We assayed plasma aGST, alanine aminotransferase (ALT), spartate aminotransferase (AST) and gama-glutamyl-transferase (gGT) in 114 HCV+ patients, among whom liver biopsy was performed in 97, within 6 months of the biochemical evaluation. We also assessed aGST levels in 66 health blood donors, aimed to serve as control. We compared aGST levels with other biochemical tests and liver histology. RESULTS: In 85.96% of HCV patients aGST was elevated and showed association with serum aminotransferases (p<0.01). The value of 4mg/dL (or lower) showed the best sensitivity (85.96%) and specificity (92.42%) to determine normality on the aGST test. aGST levels 8mg/dL and higher showed the best specificity to determine the presence of more aggressive liver histological damage among HCV patients and the best predictive positive value and positive likelihood for more aggressive portal inflammation and lobular activity. CONCLUSION: aGST is related to HCV infection (cut-off = 4mg/dL) and more aggressive liver histological damage (cut-off = 8mg/dL). In this sense, aGST could be used in HCV patients with altered ALT levels as an indicator of more aggressive hystopathological damage. However, its positive predictive value (PPV) is not high enough to preclude the decision of performing hepatic biopsy, even when it is above 8mg/dL.

A macroprolactinemia é condição freqüente na hiperprolactinemia e em geral, sem impacto clínico. Os dados sobre a atividade biológica da macroprolactina (bbPRL) são controversos e baseados em bioensaio heterólogo com células de rato Nb2. A atividade biológica da bbPRL é observada in vitro e não in vivo, provavelmente porque seu alto peso molecular evita sua passagem pelos capilares. A bioatividade da bbPRL talvez varie de acordo com a especificidade do receptor de prolactina (PRLR). Avaliamos a bioatividade da bbPRL de indivíduos macroprolactinêmicos (Grupo I, n = 18) e da PRL monomérica (mPRL) de pacientes hiperprolactinêmicos sem bbPRL (Grupo II, n = 5) em Nb2 e em células Ba/F-LLP, transfectadas com o PRLR humano. Enquanto ambos ensaios apresentam resultados similares para a atividade de mPRL, nossos resultados indicam que a atividade da bbPRL é presente em ensaio heterólogo e não em ensaio homólogo. O ensaio Ba/F-LLP é sensível e apresenta melhor correlação com a atividade in vivo da bbPRL / Macroprolactinemia is a frequent finding in hyperprolactinemic individuals, usually without clinical impact. Data on biological activity of macroprolactin (bbPRL) is mostly based on a heterologous bioassay (Nb2 cell). Biological activity of bbPRL observed in vitro but not in vivo maybe due to its high molecular weight preventing its passage through capillary barrier. Alternatively, bbPRL bioactivity may differ depending on the PRL receptor species specificity. BbPRL from macroprolactinemic individuals and monomeric PRL (mPRL) from hyperprolactinemic patients without macroprolactinemia were tested in two bioassays: Nb2 and in Ba/F-LLP, which expresses human prolactin receptor. While both bioassays achieve similar results considering mPRL activity, our results indicate that bbPRL displays activity in a heterologous but not in a homologous bioassay, consistently with the apparent absence of bbPRL bioactivity in vivo

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A a-Glutathiona-S-transferase (aGST) vem sendo proposta como um marcador sensível e não-invasivo de lesão hepática em pacientes com Hepatite pelo vírus C. Avaliamos neste trabalho como a (aGST) se correlaciona com características bioquímicas e histológicas em pacientes com HCV. MATERIAL E MÉTODOS: Realizamos a determinação da concentração plasmática das aGST, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e gama-glutamyltransferase (gGT) em 114 pacientes com HCV, dos quais 97 foram submetidos à biópsia hepática em até 6 meses da realização dos testes bioquímicos. Avaliamos também os níveis de aGST em 66 doadores de sangue sadios, que serviram como controles. Comparamos os níveis de aGST com as demais provas bioquímicas e a histologia hepática. RESULTADOS: A aGST estava elevada em 85.96% dos pacientes com HCV e mostrou associação com a elevação das aminotransferases (p<0.01). O valor de 4mg/dL mostrou as melhores sensibilidade (85,96%) e especificidade (92,42%) para determinar a normalidade do teste aGST. aGST ³ 8mg/dL mostrou a melhor especificidade para determinar lesão histológica hepática mais agressiva e o melhor valor preditivo positivo e razão de verossimilhança positiva para inflamação portal e atividade parenquimatosa mais agressiva nos pacientes com HCV. CONCLUSÕES: A aGST está relacionada à lesão hepática na infecção pelo HCV (valor de corte = 4mg/dL) e lesões histológicas hepáticas mais agressivas (valor de corte = 8mg/dL). Neste contexto, a aGST poderia ser utilizada em pacientes com Hepatite pelo HCV com ALT elevada, como um indicador complementar de lesão histopatológica mais agressiva. Entretanto, seu valor preditivo positivo não é suficientemente elevado para evitar a necessidade de realizar a biópsia hepática, mesmo quando está acima de 8mg/dL. / BACKGROUND/AIMS: a-Glutathione-S-transferase (aGST) has been proposed as a sensitive non-invasive indicator of hepatocellular injury due to Hepatitis C virus (HCV) infection. In this work, we evaluate how alpha-GST concentration correlates with biochemical and histological features in HCV patients. METHODS: We assayed plasma aGST, alanine aminotransferase (ALT), spartate aminotransferase (AST) and gama-glutamyl-transferase (gGT) in 114 HCV+ patients, among whom liver biopsy was performed in 97, within 6 months of the biochemical evaluation. We also assessed aGST levels in 66 health blood donors, aimed to serve as control. We compared aGST levels with other biochemical tests and liver histology. RESULTS: In 85.96% of HCV patients aGST was elevated and showed association with serum aminotransferases (p<0.01). The value of 4mg/dL (or lower) showed the best sensitivity (85.96%) and specificity (92.42%) to determine normality on the aGST test. aGST levels 8mg/dL and higher showed the best specificity to determine the presence of more aggressive liver histological damage among HCV patients and the best predictive positive value and positive likelihood for more aggressive portal inflammation and lobular activity. CONCLUSION: aGST is related to HCV infection (cut-off = 4mg/dL) and more aggressive liver histological damage (cut-off = 8mg/dL). In this sense, aGST could be used in HCV patients with altered ALT levels as an indicator of more aggressive hystopathological damage. However, its positive predictive value (PPV) is not high enough to preclude the decision of performing hepatic biopsy, even when it is above 8mg/dL.

A macroprolactinemia é condição freqüente na hiperprolactinemia e em geral, sem impacto clínico. Os dados sobre a atividade biológica da macroprolactina (bbPRL) são controversos e baseados em bioensaio heterólogo com células de rato Nb2. A atividade biológica da bbPRL é observada in vitro e não in vivo, provavelmente porque seu alto peso molecular evita sua passagem pelos capilares. A bioatividade da bbPRL talvez varie de acordo com a especificidade do receptor de prolactina (PRLR). Avaliamos a bioatividade da bbPRL de indivíduos macroprolactinêmicos (Grupo I, n = 18) e da PRL monomérica (mPRL) de pacientes hiperprolactinêmicos sem bbPRL (Grupo II, n = 5) em Nb2 e em células Ba/F-LLP, transfectadas com o PRLR humano. Enquanto ambos ensaios apresentam resultados similares para a atividade de mPRL, nossos resultados indicam que a atividade da bbPRL é presente em ensaio heterólogo e não em ensaio homólogo. O ensaio Ba/F-LLP é sensível e apresenta melhor correlação com a atividade in vivo da bbPRL / Macroprolactinemia is a frequent finding in hyperprolactinemic individuals, usually without clinical impact. Data on biological activity of macroprolactin (bbPRL) is mostly based on a heterologous bioassay (Nb2 cell). Biological activity of bbPRL observed in vitro but not in vivo maybe due to its high molecular weight preventing its passage through capillary barrier. Alternatively, bbPRL bioactivity may differ depending on the PRL receptor species specificity. BbPRL from macroprolactinemic individuals and monomeric PRL (mPRL) from hyperprolactinemic patients without macroprolactinemia were tested in two bioassays: Nb2 and in Ba/F-LLP, which expresses human prolactin receptor. While both bioassays achieve similar results considering mPRL activity, our results indicate that bbPRL displays activity in a heterologous but not in a homologous bioassay, consistently with the apparent absence of bbPRL bioactivity in vivo

A tuberculose é uma doença crônica granulomatosa caracterizada por um déficit de imunidade antígeno específica do hospedeiro, cuja resposta imune é ativamente regulada por citocinas. No Brasil há mais de 50 milhões de habitantes infectados pelo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo foi avaliar a linfoproliferação e a produção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas por quatro diferentes antígenos do M. tuberculosis, um complexo, o antígeno sonicado, e três purificados, ESAT-6, antígeno 85B e antígeno HBHA, eventuais candidatos à vacina anti-tuberculose. Para avaliação da produção de IFN-g e IL-10 foram utilizados dois métodos: Elispot e Elisa à partir de sobrenadante de cultura de PBMC. Para essas avaliações, os pacientes com tuberculose ativa (TB-A) foram comparados a dois subgrupos de indivíduos controles. O primeiro subgrupo foi constituído por indivíduos saudáveis PPD+ e o segundo por indivíduos curados de um episódio de tuberculose (TB-C). Nossos resultados de linfoproliferação e de Elisa revelaram diminuição da resposta linfoproliferativa e da produção de IFN-g dos pacientes em comparação com os indivíduos PPD+, enquanto os indivíduos TB-C apresentaram em geral resultados intermediários. Observou-se também que as respostas à PHA não diferiam significativamente entre os grupos, ressaltando a natureza antígeno específica da hiporreatividade na tuberculose. Adicionalmente, verificamos maior reatividade ao antígeno complexo, sonicado, que aos antígenos purificados, e entre estes, a reatividade foi maior para ESAT-6 e 85B que para HBHA, A resposta ao HBHA pode ter sido eventualmente subestimada por razões técnicas, como utilização de dose sub-ótima ou perda da atividade biológica. Em relação ao Elispot para IFN-g, não pudemos observar diferenças entre os grupos, tanto quando se considerou o número total de spots, como quando se contou apenas spots com diâmetro > 65 mm, apresentando portanto uma sensibilidade aparentemente menor comparado aos outros 2 métodos. A comparação entre os métodos revelou pouca correlação entre seus resultados, que pode ser eventualmente explicado pela diferente contribuição das populações celulares (T CD4+ e T CD8+) para cada uma das provas munológicas. Finalmente, a análise da produção de IL-10 medida por Elisa no sobrenadante de cultura e por spots de IL10, também não revelou diferenças entre os grupos. Convém notar que o Elisa detectou baixas concentrações de IL-10 nos sobrenadantes, porém o Elispot demonstrou número elevado de spots e boa correlação entre as resposta aos antígenos. Em conclusão, nossos resultados sugerem que métodos \'clássicos\', e já estabelecidos, como linfoproliferação e Elisa, persistem válidos para se avaliar a imunidade celular, e que em nossas condições laboratoriais, a técnica de Elispot não representou, até o momento, uma melhora na qualidade da avaliação imunológica. / Tuberculosis is a chronic granulomatous disease characterized by a deficit of the antigen-specific immunity of the host, whose immune response is actively regulated by cytokines. In Brazil there are 50 million people infected with Mycobacterium tuberculosis. The objective of the present work was to evaluate the lymphoproliferative response e the IFN-g response by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) indiced with 4 different antigens isolated from Mycobacterium tuberculosis: a complex, crude, the sonicate antigen, and 3 other, purified ones, Esat-6, 85B, and HBHA, the last 3 eventual candidates to the design of a vaccine against tuberculosis. We used 2 methods to evaluate the IFN-g and IL-10 productions, namely Elispot and Elisa of supernatant of PBMC cultures. We studied a group of active tuberculosis patients (TB-A), and compared them with controls individuals comprising 2 groups, one made of healthy PPD+ individuals and the second one of individuals who have been cured from an episode of tuberculosis in the past (TB-C). Our results of lymphoproliferation and Elisa revealed decrease in the lymphoproliferative and IFN-g responses by patients\' PBMC as compared to the PPD+ group, with the TB-C group in general presenting intermediate results. We also observed that the responses to the mitogen PHA were not statisically different among the groups, denoting the antigen-specific nature of the immune deficit in tuberculosis. In addition, we verified that stronger reactivity to the complex antigen than with the purified antigens, and, among the latter, the reactivity was stronger with Esat-6 and 85B as compared to HBHA, Reactivity to HBHA may have been understimated due to technical reasons, such as loss of .the biological activity of the molecule or use of a sub-optimal dose. By using the Elispot for IFN-g we were not able to detect differences among the groups, even when we counted all spots formed or spots with more than > 65 mm in diameter. Thus our Elispot for IFN-g apparently showed lower sensitivity than the other 2 methods. Furthermore, comparisons between the methods revealed low correlation between their results, a finding that may be explained by the differning contribution of different subpopulations (T CD4+ and T CD8+) to each of the results. Finally, analysis of the production of IL-10 as measured by Elisa in the culture supernatants as well as by Elispot revealed no differences among the groups. It is noteworthy that the levels of IL-10 detected by Elisa were low, but the Elispot revealed high number of spots and a good correlation between the antigen responses. In conclusion, we may say that our well standardized \'classical\' methods Elisa and lymphoproliferation persist useful to evaluate cellular immunity responses, and that the Elispot technique, up to now and in our laboratorial conditions, did not represent an improvement in the quality of the immunological evaluation.

O objetivo deste estudo foi aumentar o banco de dados em relação a resíduos (cake) e efluentes (licor) industriais e o seu nível de clastogenicidade. Este estudo contribuiu para mostrar: a) que o bioensaio com Tradescantia pallida foi sensível para a avaliação da clastogenicidade em mistura complexa de resíduos catalíticos industriais, nunca testados anteriormente. b) a tendência de uma dose resposta para ambos os resíduos catalíticos c)a pasta (cake) apresenta maior clastogenicidade que o licor nas concentrações estudadas. Provavelmente isto se deve a menor concentração de Ti e Al no licor do que no cake. / The aim of this study was to increase data concerning liquid effluent (liquor) and solid waste (cake) and their level of clastogenicity using TradMCN. This study contributed to show a) bioassay Trad-MCN with Tradescantia pallida was sensitive to evaluate the clastogenicity in a complex waste mixture, never tested before b) a tendency of a dose response for both catalytic wastes. c) higher clastogenicity of cake comparing to liquor effluent in concentrations evaluated. Probably this is due to the much lower Ti and Al concentrations in the liquor than in the cake