Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2003. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 152-181).

Friedreich ataxia (FRDA) is the most common inherited ataxia disorder, caused by a GAA repeat expansion mutation within the first intron of the FXN gene. The subsequent deficiency of frataxin protein leads to neurological disability, increased risk of diabetes mellitus, cardiomyopathy and premature death. The exact FRDA disease mechanism is not yet clear, despite some understanding of epigenetic, transcriptional and DNA repair system effects that lead to frataxin reduction. Previous studies have shown that mismatch repair (MMR) genes can affect other trinucleotide repeat disorders by destabilisation of the repeats. Furthermore, it has been proposed that frataxin deficiency might lead to cell malignancy by an as yet undefined mode of action. Therefore, the principle aim of this thesis was to use human and genetically altered mouse cells and tissues to understand the effects of MMR proteins on GAA repeat instability and FXN transcription, and also to identify potential changes in MMR transcription that might cause malignancy in FXN-defective human cells. Firstly, by using FXN and MMR genetically altered mice, MMR proteins were shown to be involved in both intergenerational and somatic GAA repeat instability, although their effects in the two systems were different. Thus, Msh2 or Msh3 were both found to protect against intergenerational transmission of GAA contractions, while loss of Msh2 or Msh3 reduced somatic GAA repeat expansions and increased levels of FXN transcription in brain and cerebellum tissues. Loss of Msh6 induced both intergenerational GAA repeat expansions and contractions, while the frequency of somatic GAA repeat expansions was reduced. Curiously, the level of FXN transcription was also reduced in Msh6-deficient brain and cerebellum tissues. On the other hand, Pms2 was found to protect against both intergenerational and somatic GAA repeat expansions, with loss of Pms2 causing increased GAA repeat expansions and decreased levels of FXN transcription in brain and cerebellum tissues. Finally, loss of Mlh1 led to a reduced frequency of both intergenerational and somatic GAA repeat expansions, but the level of FXN transcription was also reduced in brain and cerebellum tissues. Furthermore, upregulation of MMR mRNA expression was detected in human FRDA fibroblast cells, but downregulation was seen in FRDA cerebellum tissues, suggesting tissue-dependent control of FXN and MMR expression. In summary, these studies indicate that the MMR system can affect GAA repeat expansion instability and FXN transcription through different mechanisms of action. Furthermore, frataxin deficiency can also affect the levels of MMR mRNA expression in a tissue-dependent manner. These findings will assist future investigations aimed at identifying novel FRDA therapies.

Thesis (M.Phil.) - University of Queensland, 2006. / Includes bibliography.

Würzburg, Univ., Diss., 2002.

A presente pesquisa pretende demonstrar evidências capazes de contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na ataxia-telangiectasia, bem como oferecer dados que auxiliem na implementação de técnicas complementares ao diagnóstico desta síndrome. Desde a descoberta do gene envolvido na ataxia-telangiectasia (o gene ATM), muito conhecimento tem sido acumulado, especialmente sobre os mecanismos moleculares envolvidos na síndrome, bem como nas respectivas doenças relacionadas. Este estudo teve como objetivo avaliar o dano de DNA, a capacidade de reparo e a sensibilidade à radiação ionizante comparada à bleomicina em indivíduos com ataxiatelangiectasia e em seus pais heterozigotos, relacionando-os com um grupo controle. O trabalho foi desenvolvido através de voluntários em acompanhamento no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. As amostras foram submetidas às técnicas de micronúcleo e cometa, de maneira espontânea e com dano de DNA induzido. Os resultados demonstraram que a técnica de micronúcleo sem a indução de dano é o suficiente para a diferenciação de pacientes, pais e controles, incluindo níveis de micronúcleo (MN), pontes nucleoplasmáticas (PN) e BUDs nucleares. Não foi possível distinguir os três grupos com a técnica do cometa espontâneo, mas a monitoração da cinética de reparo de DNA através dessa técnica demonstrou que o grupo de pacientes apresenta um atraso no processo de reparo do DNA, em relação aos controles. Os achados nas duas técnicas são complementares, e a sua combinação é altamente recomendável na identificação de instabilidade cromossômica, com o objetivo de auxiliar no diagnóstico de pacientes AT.

Cells respond to the induction of DNA damage with activation of the DNA damage response (DDR), a complex signalling network which orchestrates cell cycle arrest and DNA repair in order to maintain genomic stability and cell viability. Activation of these signalling pathways enables cancer cells to survive DNA damaging chemo- or radiotherapy and contributes to the development of therapy resistance. Therefore, components of the DDR have become attractive targets for chemo- or radiosensitisation. Furthermore, cancer cells frequently exhibit defects in certain DDR components and may, as a consequence, become highly dependent on remaining DDR pathways to survive DNA damage. Two apical mediators of the DDR are the serine/threonine protein kinases ATM and ATR. ATM is frequently mutated in non-small cell lung cancer (NSCLC), and defects in ATM may render the tumour cells dependent on ATR signalling for survival. In this study, we characterised the functional consequences of ATM mutations in NSCLC cell lines and established an immunohistochemistry-based assay to identify patients with loss of ATM expression. As a single agent, pharmacological ATR inhibition (ATRi) was selectively cytotoxic for cells deficient in both ATM and p53. Furthermore, ATRi in combination with either ATM or PARP inhibition selectively killed tumour cells with mutant p53. We show that following ATR inhibition, ATM and p53 perform critical cell cycle checkpoint functions, independently of each other. Our results suggest that while retained function in any of these pathways is sufficient to maintain cell viability, functional loss of ATM, ATR and p53 results in premature mitotic entry, chromosome fragmentation and mitotic catastrophe. We conclude that in NSCLC the functional status of both ATM and p53 determines the cellular response to ATR inhibition, and propose that a combination of ATR inhibition with ATM or PARP inhibition may have broad utility for the treatment of p53-mutated NSCLC.

Orientadora : Profª. Drª. Cristiane Benincá / Coorientador : Prof. Dr. Ricardo L. R. Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 29/09/2017 / Inclui referências : f. 40-44 / Resumo: As doenças neurodegenerativas de início na infância podem ser de difícil diagnóstico, já que é comum apresentarem heterogeneidade de sintomas, quadro clinico com evolução tardia e bioquímica inconsistente. Uma das ferramentas moleculares que auxilia no diagnóstico dessas doenças é o sequenciamento completo do exoma, capaz de investigar e identificar mutações pontuais, pequenas inserções e deleções em genes codificadores de proteínas que possam estar envolvidas nas patologias pesquisadas. Resultados negativos em exomas nem sempre se devem à ausência de alterações patológicas no DNA. Desta forma, a reanálise é fundamental em casos em que exista uma desconfiança para certa patologia de origem genética. O caso clínico apresentado neste estudo não possui um diagnóstico definido e o exoma foi realizado na tentativa de esclarecer a causa dos sintomas e buscar um tratamento adequado. Durante a reanálise do exoma algumas mutações pontuais foram encontradas e destas, duas alterações no gene SQSTM1 (rs201239306 e rs370874635), responsável por codificar a proteína p62, foram selecionadas para uma investigação mais aprofundada, haja visto que ambas mutações apresentam baixa frequência populacional e poderiam alterar a função proteica. A proteína p62 atua em diversos processos celulares, entre eles a autofagia. Esta é responsável pela remoção de proteínas e organelas em processo de envelhecimento ou disfunção. Erros nesta via de degradação são fontes de uma grande variedade de doenças, incluindo as neurodegenerativas. A análise da variante rs201239306 (A426V), de herança paterna, demonstra uma grande possibilidade de causar deficiências na sua via de sinalização, uma vez que se encontra em domínio conservado em diversas espécies biológicas (UBA) e várias linhas de análise bioinformática suportam essa hipótese. A quantificação da proteína p62 revelou, em primeira análise, uma pequena diminuição da sua expressão na amostra da paciente, o que poderia indicar uma redução na sua tradução devido a alteração estar localizada na região 5'UTR. A quantificação de LC3 demonstrou, inicialmente, que a paciente possui um acúmulo desta proteína, indicando que a via autofágica está sendo afetada de alguma maneira. São necessários alguns testes complementares para concluir a base genética do caso clínico apresentado. Podemos sugerir, não obstante, segundo as análises apresentadas, uma disfunção na via de p62 como a causa da síndrome estudada. Palavras-chave: autofagia, exoma, sequestosome1, neurodegeneração, p62 / Abstract: Early childhood neurodegenerative diseases may be difficult to diagnose, as they can present heterogeneity of symptoms, late evolution on clinical picture and inconsistent biochemistry. Exome sequencing is one of the available molecular tools to help in the diagnosis of these diseases as it is capable to identify point mutations, small insertions and deletions in genes encoding for proteins that may be involved in the pathologies under research. Negative results in exomes are not always due to the absence of pathological changes in DNA. Therefore, the reanalysis is fundamental in cases where there is a suspicion for a certain pathology of genetic origin. The clinical case presented in this study lacks a welldefined diagnosis and the exome was conducted to clarify the cause of the symptoms and search for an appropriate treatment. During this re-analysis, some specific mutations were found and two point mutations in the SQSTM1 gene (rs201239306 e rs370874635), that encodes the p62 protein, were selected for further investigation since they both present low allelic frequency and also can alter the protein function. p62 protein acts on several cellular processes including autophagy. Autophagy is the cellular process responsible for the removal of dysfunctional proteins and organelles in normal homeostasis or during aging. Errors in this pathway of degradation are sources of a wide variety of diseases including neurodegenerative diseases. The analysis of the variant rs201239306 (A426V) presented with a paternal inheritance, showed possibilities of causing deficiencies in its signaling pathway, as it changes a well conserved aminoacid in several biological species (UBA domain). The bioinformatics analysis supported this hypothesis either. The quantification of p62 protein levels showed, a small decrease in the first analysis, and could indicate a decrease in its translation due to the alteration in the 5'UTR region. LC3 quantification initially demonstrated that the patient has an accumulation of this protein, indicating that the autophagic pathway is being affected in some way. Complementary tests are needed to conclude the genetic basis of this clinical case. We can suggest, however, according to the reported analysis, a dysfunction in the p62 pathway as the cause of the studied syndrome. Key-words: autophagy, exome, sequestosome1, neurodegeneration, p62

A presente pesquisa pretende demonstrar evidências capazes de contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na ataxia-telangiectasia, bem como oferecer dados que auxiliem na implementação de técnicas complementares ao diagnóstico desta síndrome. Desde a descoberta do gene envolvido na ataxia-telangiectasia (o gene ATM), muito conhecimento tem sido acumulado, especialmente sobre os mecanismos moleculares envolvidos na síndrome, bem como nas respectivas doenças relacionadas. Este estudo teve como objetivo avaliar o dano de DNA, a capacidade de reparo e a sensibilidade à radiação ionizante comparada à bleomicina em indivíduos com ataxiatelangiectasia e em seus pais heterozigotos, relacionando-os com um grupo controle. O trabalho foi desenvolvido através de voluntários em acompanhamento no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. As amostras foram submetidas às técnicas de micronúcleo e cometa, de maneira espontânea e com dano de DNA induzido. Os resultados demonstraram que a técnica de micronúcleo sem a indução de dano é o suficiente para a diferenciação de pacientes, pais e controles, incluindo níveis de micronúcleo (MN), pontes nucleoplasmáticas (PN) e BUDs nucleares. Não foi possível distinguir os três grupos com a técnica do cometa espontâneo, mas a monitoração da cinética de reparo de DNA através dessa técnica demonstrou que o grupo de pacientes apresenta um atraso no processo de reparo do DNA, em relação aos controles. Os achados nas duas técnicas são complementares, e a sua combinação é altamente recomendável na identificação de instabilidade cromossômica, com o objetivo de auxiliar no diagnóstico de pacientes AT.

A presente pesquisa pretende demonstrar evidências capazes de contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na ataxia-telangiectasia, bem como oferecer dados que auxiliem na implementação de técnicas complementares ao diagnóstico desta síndrome. Desde a descoberta do gene envolvido na ataxia-telangiectasia (o gene ATM), muito conhecimento tem sido acumulado, especialmente sobre os mecanismos moleculares envolvidos na síndrome, bem como nas respectivas doenças relacionadas. Este estudo teve como objetivo avaliar o dano de DNA, a capacidade de reparo e a sensibilidade à radiação ionizante comparada à bleomicina em indivíduos com ataxiatelangiectasia e em seus pais heterozigotos, relacionando-os com um grupo controle. O trabalho foi desenvolvido através de voluntários em acompanhamento no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. As amostras foram submetidas às técnicas de micronúcleo e cometa, de maneira espontânea e com dano de DNA induzido. Os resultados demonstraram que a técnica de micronúcleo sem a indução de dano é o suficiente para a diferenciação de pacientes, pais e controles, incluindo níveis de micronúcleo (MN), pontes nucleoplasmáticas (PN) e BUDs nucleares. Não foi possível distinguir os três grupos com a técnica do cometa espontâneo, mas a monitoração da cinética de reparo de DNA através dessa técnica demonstrou que o grupo de pacientes apresenta um atraso no processo de reparo do DNA, em relação aos controles. Os achados nas duas técnicas são complementares, e a sua combinação é altamente recomendável na identificação de instabilidade cromossômica, com o objetivo de auxiliar no diagnóstico de pacientes AT.

Orientadores: Fernando Cendes, Iscia Lopes Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-29T05:39:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Etchebehere_ElbaCristinaSadeCamargo_D.pdf: 22865104 bytes, checksum: e4a95fbe4b8de8ba158cebe76e656bd6 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A doença de Machado-Joseph (DMJ) é a ataxia espinocerebelar autossômica dominante mais freqüente no Brasil e na maior parte do mundo ocidental. Não há relatos sobre o uso do SPECT cerebral com HMPAO_99mTce da ressonância magnética (RM) para avaliação de pacientes com o diagnóstico molecular da mutação responsável pela DMJ (DMJ/AEC3). Os objetivos deste trabalho foram utilizar o SPECT cerebral e a RM para avaliar a função e estrutura do sistema nervoso central em pacientes com DMJ/AEC3; determinar se existe correlação entre a magnitude das anormalidades metabólicas e estruturais encontradas nos pacientes com DMJ/AEC3 e a duração da doenç~ os sinais esintomas, e características moleculares da mutação para DMJ/AEC3 -tamanho da repetição CAG. Foram estudados 12 pacientes com DMJ/AEC3, sendo 8 masculinos e 4 femininos, idades variando de 22 a 67 anos, média 39 anos. Os pacientes foram submetidos ao SPECT cerebral e RM no mesmo dia. O grupo controle do SPECT cerebral foi constituído de 42 voluntários normais, 22 femininos e 20 masculinos, com idades variando de 22 a 66 anos, média 32,6 anos. O grupo controle da RM foi constituído de 17 voluntários normais, 13 femininos e 4 masculinos, com idades variando de 21 a 62 anos, média 32,2 anos. O SPECT cerebral foi realizado injetando-se HMPAO_99mTcem repouso e as imagens adquiridas em uma câmara de cintilação computadorizada. As imagens nos planos transversal, coronal e sagital foram submetidas às análises visual e semiquantitativa. Para esta última, foram utilizados os tálamos como referênc~ com a colocação de áreas de interesse nos córtices cerebral e cerebelar. As imagens de RM foram obtidas em um sistema de 2 Tesla com aquisições nos planos coronal, sagital e transversal e 3D (volumétrica). Determinou-se o volume dos hemisférios cerebelares e vérmis. Houve correlação entre as alterações perfusionais identificadas à análise visual no SPECT cerebral nos lobos parietais e vérmis com as alterações estruturais na RM. O SPECT cerebral identificou, na análise visual, maior número de alterações nas porções inferiores dos lobos frontais, nas porções mesial e lateral dos lobos temporais, núcleos da base e hemisférios cerebelares. A RM identificou mais alterações na ponte e nas porções superiores dos lobos frontais. Atrofia das olivas foi evidenciada à RM. Na análise semiquantitativ~ observou-se uma diferença significativa da perfusão nas porções inferiores e superiores dos lobos frontais, porções laterais dos lobos temporais, lobos parietais, núcleos da base esquerdos, hemisférios cerebeIares e vérmis quando comparados com o grupo controle. Houve uma diferença significativa entre os volumes do vérmis e dos hemisférios cerebelares dos pacientes em relação ao grupo controle, na RM. Não houve correlação entre o grau de ataxia ou o tipo clínico com alterações perfusionais ou de volume nos pacientes com DMJ/AEC3. Não se observou correlação significativa entre as alterações da perfusão do vérmis e o volume dos hemisférios cerebeIares dos pacientes e a duração da doença, porém houve uma tendência de relação inversa entre as alterações da perfusão dos hemisférios cerebeIares e o volumedo vérmis dos pacientes e a duração da doença. Observou-se correlação significativaentre a presença de síndrome extra-piramidal e a perfusão do lobo parietal esquerdo. Não houve correlação entre o tamanho da repetição CAG e a perfusão dos córtices cerebral e cerebeIar e o volume do vérmis, entretanto houve uma tendência de relação inversa entre as alterações do volume dos hemisférios cerebeIares com o tamanho da repetição CAG. O SPECT cerebral e a RM foram capazes de demonstrar alterações perfusionais e estruturais nos córtices cerebral e cerebeIar dos pacientes com DMJ/AEC3. O SPECT cerebral e a RM são métodos não invasivos capazes de identificar alterações sub-clínicasnestes pacientes / Abstract: Machado-Joseph disease (MJD) is the most frequently encountered autossomal dominant spinocerebellar ataxia in Brazil and in most parts of the eastem world. There are no reports on brain SPECT imaging with 99mTc-HMPAOand magnetic resonance imaging (MRI) in patients with genetically proven MJD (MJD/SCA3). Objectives : The purpose of this report was to perform brain SPECT imaging with 99mTc-HMPAOand 1 / Doutorado / Medicina Interna / Doutor em Ciências Médicas