Στην παρούσα εργασία αξιολογήθηκε η χρήση των μικροδορυφορικών δεικτών για τη μελέτη της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων των φυσικών πληθυσμών της Atherina boyeri που προέρχονταν τόσο από θαλάσσιες όσο και λιμναίες/λιμνοθαλάσσιες περιοχές της Ελλάδας. Προηγούμενες μελέτες βασιζόμενες κυρίως σε μιτοχονδριακούς και RAPD δείκτες έχουν υποδείξει την πιθανή παρουσία τριών ομάδων πληθυσμών στην Atherina boyeri με τόσο υψηλές γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους που θα μπορούσαν να τις καθιστούν ακόμα και διαφορετικά είδη. Οι ομάδες αυτές είναι: οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι (μη εστιγμένοι),οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου ΙΙ (εστιγμένοι) και οι λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί. Η ανάλυση στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε με χρήση 11 μικροδορυφορικών δεικτών που σχεδιάστηκαν από τους Milana et al. (2009). Οι μικροδορυφορικοί δείκτες θεωρούνται εξαιρετικό εργαλείο μελέτης των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ πρόσφατα διαχωρισμένων ειδών δεδομένου ότι είναι άφθονοι, πυρηνικοί, διάσπαρτοι στο γονιδίωμα, υψηλά πολυμορφικοί και ταχέως εξελισσόμενοι. Τα αποτελέσματα έδειξαν πολύ υψηλό βαθμό πολυμορφισμού στους υπό ανάλυση πληθυσμούς και μεγάλη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των ελληνικών πληθυσμών του είδους όπως αυτή εκφράζεται από τις διαφορές στις συχνότητες των αλληλομόρφων των μικροδορυφορικών δεικτών. Φαίνεται επίσης να επιβεβαιώνεται η διάκριση μεταξύ των δυο θαλάσσιων τύπων της Atherina boyeri, ωστόσο οι λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί παρουσιάζουν τόσο διαφορετικό γενετικό πρότυπο που θεωρείται εξαιρετικά δύσκολο να συνιστούν μια ενιαία ομάδα πληθυσμών. Οι δείκτες αυτοί δεν ήταν δυνατό να χρησιμοποιηθούν στην ανάλυση όλων των διαθέσιμων πληθυσμών, κυρίως λόγω της παρουσίας μη ενισχυόμενων (null) αλληλομόρφων, καθώς επίσης και πολλαπλών ή/και ασθενών ζωνών, γεγονός που επίσης υποδεικνύει την ύπαρξη μεγάλων γενετικών διαφοροποιήσεων, που πιθανώς ξεπερνούν τα όρια του είδους. Προκείμενου να ξεπεραστούν τα ανωτέρω προβλήματα απαιτείται η βελτιστοποίησή τους ανά ομάδα πληθυσμών, μέσω α) αλλαγών στις συνθήκες των PCR αντιδράσεων και β) κλωνοποίησης και αλληλούχισης των δεικτών αυτών από άτομα των πληθυσμών στα οποία ήταν λειτουργικοί, ώστε να επιτευχθεί ο σχεδιασμός νέων ζευγών εκκινητών, ειδικών για επιμέρους ομάδες πληθυσμών. / The present study aims at the measure of the genetic differentiation and the resolution of the phylogenetic relationships among A.boyeri populations originating from lakes/lagoons and marine sites of Greece. Previously studies based on RAPD and mitochondrial markers suggest the existence of three forms of populations of A.boyeri which could represent three different species. These three types are: marine type I, which includes almost all marine populations (non-punctuated), excluding specimens collected from Preveza, Evoia and Kos, which form the marine type II (punctuated) and the “lagoon” type which consists of all the lagoon/lake populations. In the present study, eleven microsatellite markers designed by Milana et al. (2009), were used. Microsatellite markers are supposed to be great tools in phylogenetic studies among recently separated species because they are abundant, nuclear, dispersed around the genome, highly polymorphic and rapidly evolving. Our results showed very high degree of polymorphism in the analyzed populations and extended genetic differentiation among Greek populations of the species as expressed by differences in allele frequencies of the microsatellite markers. They also seems to confirm the distinction between the two marine types of A.boyeri, but the lagoon/lake populations present different allele paterns, pointing to the possible existence of differentiated groups among them. Some of the markers could not be used in the analysis of all the available populations. This is mainly attributed to the presence of null alleles for some of the populations and to scoring difficulties raising from the presence of multiple and/or weak amplicons. This also indicates the existence of great genetic variations, which possibly exceed species limit. To overcome the above difficulties, optimization per marker is required, including a) optimization of PCR conditions and b) cloning and sequencing of these markers from individuals of the population that were functional to achieve the design of new prime pairs, specific for each group of populations .

Στην εργασία αυτή μελετήθηκε η γενετική δομή και οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ έξι πληθυσμών της Atherina boyeri που προέρχονταν από τις περιοχές της Μυτιλήνης, της Νισύρου, της Κάσου, της Κύμης, και των λιμνών της Βιστωνίδας και Iznik (στην Τουρκία). Συγκεκριμένα, έγινε μελέτη των περιοριστικών θραυσμάτων ποικίλου μήκους (RFLP analysis) των τμημάτων 12S rRNA, 16S rRNA και του βρόγχου εκτόπισης (D-loop) του μιτοχονδριακού DNA. Τα αποτελέσματα αυτά συνδυάστηκαν με τα αποτελέσματα άλλων μελετών που αφορούσαν εννέα διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας (Κάλυμνο, Κεφαλλονιά, Αμβρακικός, Κως, Λήμνος, Εύβοια, Ζάκυνθος, Λευκάδα και Κουρνά-Κρήτη) και είχαν γίνει στο εργαστήριο. Από την RFLP ανάλυση αποκαλύφθηκαν 23 διαφορετικοί σύνθετοι απλότυποι. Βάσει των αποτελεσμάτων γίνεται σαφής διαχωρισμός μεταξύ «λιμναίου» και «θαλάσσιου» τύπου πληθυσμών. Οι πληθυσμοί από τις λίμνες/λιμνοθάλασσες (Βιστωνίδα, Κουρνά, Κούταβος/Κεφαλλονιά, Αμβρακικός, Iznik/Τουρκία ), καθώς και από περιοχές που επικρατούν παρόμοιες συνθήκες (Κύμη, Βαθύ Καλύμνου), έχουν τους απλότυπους 1-6, ενώ οι «θαλάσσιου» τύπου πληθυσμοί (Κως, Λήμνος, Εύβοια, Μυτιλήνη, Νίσυρος, Κάσος, Ζάκυνθος, Λευκάδα) έχουν τους απλότυπους 7-23. Διαπιστώθηκε επίσης η ύπαρξη πέντε διαγνωστικών προτύπων μεταξύ «λιμναίων» και «θαλάσσιων» πληθυσμών. Επιπλέον, παρατηρήθηκε η ύπαρξη ενός διαγνωστικού προτύπου για τους πληθυσμούς από την Κω, τη Λήμνο και τη Νίσυρο, βάσει του οποίου μπορούμε να διαχωρίσουμε τους πληθυσμούς αυτούς από τους υπόλοιπους θαλάσσιους πληθυσμούς που μελετήθηκαν, καθώς και ένα διαγνωστικό πρότυπο βάσει του οποίου μπορούμε να διακρίνουμε τον πληθυσμό της Νισύρου από τους υπόλοιπους επτά πληθυσμούς «θαλάσσιου» τύπου. Με βάση τα δεδομένα αυτά υπολογίστηκε η καθαρή νουκλεοτιδική απόκλιση μεταξύ των πληθυσμών και βρέθηκε να είναι αρκετά υψηλή σε ορισμένες περιπτώσεις. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώνονται και από τα δύο φυλογενετικά δένδρα που κατασκευάστηκαν με τις μεθόδους UPGMA και Μέγιστης Φειδωλότητας. Βάσει της τιμής του Nst (50%) που υπολογίστηκε μόνο η μισή από την ολική γενετική ποικιλότητα που παρατηρήθηκε οφείλεται σε διαφορές ανάμεσα στους πληθυσμούς, ενώ η υπόλοιπη οφείλεται σε ενδοπληθυσμιακές διαφορές. / Τhe genetic differentiation and the phylogenetic relationships of six greek populations of Atherina boyeri were investigated at the mitochondrial level. The samples originated from the marine sites of Lesvos, Nisyros, Kasos, Kymi and the lakes Vistonida and Iznik (Turkey). RFLP analysis of three mtDNA segments (12S rRNA, 16S rRNA and D-loop) amplified by PCR were used. These results were combined with others available in the laboratory, concerning nine more greek populations (Kalymnos, Kefallonia, Amvrakikos, Kos, Limnos, Evvoia, Zakynthos, Leukada, Kourna/Crete). Twenty-three composite haplotypes where revealed from the RFLP analysis. There is a clear distinction between “marine” and “lagoon” type populations. In particular, the populations from the lakes/lagoons (Vistonida, Kourna, Kefallonia, Amvrakikos, Iznik), as well as the populations from sites with similar environmental conditions to the lakes/lagoons (Kymi, Kalymnos) have the haplotypes 1-6, while the “marine” type populations (Kos, Limnos, Evvoia, Lesvos, Nisyros, Kasos, Zakynthos, Leukada) have the haplotypes 7-23. Five specific restriction patterns were also revealed, which can be used to distinguish the “marine” from the “lagoon” type populations. Moreover, one diagnostic pattern, with which we can distinguish the populations from Kos, Limnos and Nisyros from the rest “marine” type populations studied, was revealed, as well as it was revealed one diagnostic pattern, with which we can distinguish the population of Nisyros from the rest “marine” type populations. The genetic divergence values estimated among “lagoon” and “marine” type populations were high, with the populations from Evvoia and Kourna to show the greatest divergence (10.450%) and the populations from Amvrakikos and Nisyros the lowest (5.549%). The above results were also confirmed and by the two phylogenetic trees that were conducted using the UPGMA and the Maximum Parsimony methods. The trees consist of two main clades, which contain the “marine” and “lagoon” populations respectively. Our results show that distinct “lagoon” populations (such as from Vistonida and Kourna) have similar genetic structure, a situation that is not true for the “marine” populations, since there are populations with completely different genetic structure. Finally, the Nst value (50%) indicates that half of the overall genetic diversity detected was between populations.

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η γενετική δομή και οι φυλογενετικές σχέσεις είκοσι τριών πληθυσμών της A.boyeri που προέρχονταν από λίμνες/λιμνοθάλασσες και θαλάσσιες περιοχές του ελλαδικού χώρου, καθώς και ενός πληθυσμού από τη λίμνη Iznik της Τουρκίας. Πιο συγκεκριμένα, προσδιορίστηκε μέρος της αλληλουχίας των μιτοχονδριακών γενετικών τόπων της υπομονάδας I της κυτοχρωματικής οξειδάσης (COI), του βρόγχου εκτόπισης (D-loop) και του κυτοχρώματος b (Cytb). Επιπλέον, προσδιορίστηκε η αλληλουχία ενός πυρηνικού γενετικού τόπου, της ροδοψίνης (Rh). Πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση των αλληλουχιών και κατασκευάστηκαν φυλογενετικά δένδρα με τις μεθόδους της Σύνδεσης Γειτόνων (NJ), Μέγιστης Φειδωλότητας (ΜΡ) και Μπεϊσιανής Συμπερασματολογίας (ΒΙ). Παρά τη διαφορετική τοπολογία των δένδρων που προέκυψαν, γεγονός που δεν κατέστησε εφικτό τον προσδιορισμό των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των υπό μελέτη πληθυσμών, η ύπαρξη τριών διαφορετικών τύπων πληθυσμών διαπιστώθηκε τόσο από την ανεξάρτητη όσο και από τη συνδυασμένη ανάλυση των αλληλουχιών. Ο πρώτος τύπος πληθυσμού, ο «λιμναίος», περιελάμβανε τους πληθυσμούς από τις λίμνες/λιμνοθάλασσες καθώς και τους πληθυσμούς από τις θαλάσσιες περιοχές της Καλύμνου, της Κύμης και των Ν. Μουδανιών. Ο δεύτερος τύπος περιελάμβανε όλους τους θαλάσσιους πληθυσμούς (πρώτος «θαλάσσιος» τύπος), με εξαίρεση του πληθυσμούς από την Πρέβεζα, την Εύβοια και την Κω που συνιστούσαν τον τρίτο τύπο πληθυσμού (δεύτερος «θαλάσσιος» τύπος). Επισημαίνεται ιδιαίτερα ότι ο πυρηνικός μοριακός δείκτης που χρησιμοποιήθηκε έφερε αρκετή ποικιλότητα ώστε να επιβεβαιώσει τα παραπάνω αποτελέσματα. Οι «λιμναίοι» πληθυσμοί εμφάνισαν σαφές φυλογεωγραφικό πρότυπο, διακρίνοντας τους πληθυσμούς του Αιγαίου και της Τουρκίας από τους λιμναίους/λιμνοθαλάσσιους του Ιονίου Πελάγους. Επιπλέον, διαπιστώθηκε πως ο πληθυσμός από τον Αμβρακικό διαφοροποιείται αρκετά από τους υπόλοιπους «λιμναίους» πληθυσμούς, ενώ αξιοσημείωτη είναι και η συσχέτιση που βρέθηκε ανάμεσα σε αυτόν τον πληθυσμό και πληθυσμών από την Αδριατική. Όσον αφορά τους θαλάσσιους πληθυσμούς, κανένας από τους δύο τύπους δεν εμφάνισε συγκεκριμένο φυλογεωγραφικό πρότυπο. Επιπλέον, διαπιστώθηκε πως οι πληθυσμοί από την Πρέβεζα, την Εύβοια και την Κω αντιστοιχούν στον εστιγμένο (punctuated) τύπο πληθυσμού, όπως έχει περιγραφεί, ο οποίος δεν έχει έως σήμερα αναφερθεί στην ανατολική Μεσόγειο. Ωστόσο, σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας, τα μαύρα στίγματα κάτω από την πλευρική γραμμή δεν μπορούν να αποτελέσουν διαγνωστικό στοιχείο για τη διάκριση των δύο τύπων θαλάσσιων πληθυσμών (punctuated, nonpunctuated), καθώς στον τύπο αυτό εντάσσονται άτομα που είτε φέρουν μαύρα στίγματα είτε όχι, και το αντίστροφο. Από τον πολλαπλασιασμό με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) του μιτοχονδριακού τμήματος Cytb και τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του, διαπιστώθηκε η ύπαρξη μίας ένθεσης ανάμεσα στο tRNA του γλουταμινικού οξέος και το Cytb. Η ένθεση αυτή είχε μέγεθος περίπου 200bp στα «λιμναία» άτομα και λίγο μικρότερο (~150bp) στα άτομα που εμφάνισαν το πρότυπο punctuated (εστιγμένα) (Πρέβεζα, Εύβοια, Κως), ενώ απουσίαζε από τους υπόλοιπους θαλάσσιους πληθυσμούς. Βάσει των παρόντων αποτελεσμάτων και σε συνδυασμό με αντίστοιχα αποτελέσματα προηγούμενων μελετών επιβεβαιώνεται η άποψη σύμφωνα με την οποία η παρουσία ή απουσία της συγκεκριμένης ένθεσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικός χαρακτήρας για τη διάκριση των τριών διαφορετικών τύπων πληθυσμών της A.boyeri. / The genetic differentiation and the phylogenetic relationships of twenty three Atherina boyeri populations originating from lakes/lagoons and marine sites of Greece, as well as from a population from lake Iznik in Turkey were investigated. More specifically, the partial sequence of the mitochondrial genes cytochrome oxidase I (COI), cytochrome b (cytb) and control region were determined. The partial sequence of the nuclear proteincoding gene rhodopsin (Rh) was determined, as well. Phylogenetic analysis of the sequences was conducted using the methods: Neighbor-Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) and Bayesian Inference (BI). Even though trees presented different topologies, and thus the phylogenetic relationships among populations were not able to be resolved, the presence of three main population forms was observed both from the separate and combined analyses of datasets. The first population type (‘lagoon’ type) contains all the lagoon/lake populations, as well as three populations (Kymi, Kalymnos and Nea Moudania) originating from marine environment. The second type includes nearly all marine populations (first ‘marine’ type), excluding specimens collected from three geographical distant areas (Preveza, Evvoia and Kos), which form the third A. boyeri population type (second ‘marine’ type). It is worth mentioning that the nuclear marker used was proved to carry sufficient diversity in order to confirm the above results. The ‘lagoon’ type populations presented a clear phylogeographic pattern, with the populations from Aegean Sea and Turkey forming a distinct group from the populations from the Ionian Sea. Moreover, the population from Amvrakikos appeared to be distinct from the rest ‘lagoon’ type populations and a remarkable correlation of this population and populations from Adriatic Sea was found. On the other hand, none of the two ‘marine’ type populations presented a specific phylogeographic pattern. Additionally, it was found that the populations from Preveza, Evvoia and Kos correspond to the ‘punctuated’ marine type, as has been described, which was not previously reported in eastern Mediterranean Sea. However, the fact that in the present study a population (Evvoia) without black spots on the flanks is clustered with the punctuated form and vice versa (specimens from Limnos presented black spots but was clustered with the non-punctuated ‘marine’ type populations), suggests that differences in color pattern do not seem to be a sufficient marker for discriminating the two marine types. From the PCR amplification of cytb and determination of its sequence the presence of approximately 200bp intergenic spacer between tRNA glutamic acid (tRNAGlu) and cyt b genes was observed among the ‘lagoon’ type specimens and a smaller one among the specimens from Preveza, Evvoia and Kos. The intergenic spacer was absent from the rest marine populations. Thus, our results support the suggestion that this character is conserved and capable to be used for distinguishing the different forms.