Autofagia é o processo catabólico que ocorre nos lisossomos, e tem por finalidade degradar os componentes celulares e proteínas que já não são mais funcionantes e, assim manter seu equilíbrio homeostático para sobreviverem adequadamente em condições estressantes. Diante das funções biológicas da autofagia identificadas até hoje, a relação entre autofagia celular e neoplasias está provavelmente entre as mais estudadas, devido ao papel duplo que a autofagia exerce sobre o desenvolvimento do câncer, podendo atuar como um mecanismo supressor de tumor ou, podendo ser um mecanismo fundamental para a sobrevivência de células neoplásicas. No entanto, em lesões potencialmente malignas não se sabe sobre o comportamento do processo autofágico. Dessa forma, nosso estudo se propôs a estudar o comportamento da autofagia em neoplasias e em lesões potencialmente malignas bucais e correlacionar com os parâmetros clínicos e a evolução dessas lesões. Para tal finalidade foi utilizado a técnica de imunoistoquímica para avaliar em amostras de mucosa normal, leucoplasias e carcinomas espinocelulares bucais, o percentual de células positivas para o marcador LC3-II. Foram avaliadas 7 amostras de mucosa bucal normal, 51 leucoplasias e 120 carcinomas espinocelulares. Para a análise de carcinomas espinocelulares foi construído um microarranjo tecidual com 2 cilindros de cada paciente. Observamos o aumento dos níveis de autofagia no carcinoma espinocelular bucal (p<0,001) em relação aos outro grupos, porém sem associação com a evolução e sobrevida desses pacientes. Entre as leucoplasias, observamos maior percentual de células positivas na camada intermediária de leucoplasias 12 displásicas (p=0,0319) e na camada basal de lesões com pior evoluação (p=0,0133). Concluimos que os níveis de autofagia aumentam durante o processo de carcinogênese bucal e estão correlacionados com o pior comportamento das leucoplasias. / Autophagy is a catabolic process to digest the cell components and proteins that are no functional anymore. Autophagy maintains the homeostasis in order to cells survive in stressful conditions. In view of the biological functions of autophagy identified to date, the relationship between cellular autophagy and neoplasia is probably among the most studied, due to the dual role that autophagy exerts on the development of cancer. Cell autophagy can act as a tumor suppressor mechanism, or as a key mechanism for the survival of neoplastic cells. However, it is not known in potentially malignant lesions how the autophagic process is controlled. Therefore, the purpose of this study is to assess the autophagic process in oral cancer and potentially malignant oral lesions and to correlate with clinical parameters and the evolution of these lesions. For this purpose, the immunohistochemical technique was used to evaluate the percentage of cells positive for the LC3-II marker in the normal mucosa, leukoplakia and oral squamous cell carcinoma samples. Seven samples of normal buccal mucosa, 51 leukoplakia and 120 squamous cell carcinomas were evaluated. For the squamous cell carcinomas analysis, a tissue microarray with 2 cylinders of each patient was constructed. We observed increased levels of autophagy in oral squamous cell carcinoma (p <0.001) in relation to the other groups, however no association with the prognosis and survival of these patients was detected. Among the leukoplakias, we observed a higher percentage of positive cells in the intermediate layer of dysplastic leukoplakias (p = 0.0319) and in the basal layer of lesions with worse prognosis (p = 0.0133). We conclude that autophagy levels increase during the process of oral carcinogenesis and are correlated with the worse behavior of leukoplakia

O câncer de pulmão é a principal causa de morte por câncer na população mundial. Muitos estudos vêm demonstrando que em determinados tipos tumorais, algumas drogas quimioterápicas estimulam uma eficiente resposta antitumoral, através da indução de uma forma de apoptose conhecida como morte celular imunogênica, sendo caracterizado por uma série de alterações que ocorrem no processo apoptótico, como a exposição pré-apoptótica da calreticulina (CRT) na superfície celular, a liberação de ATP e HMGB1 para o microambiente tumoral. Objetivo: Avaliar a possível morte celular imunogênica causada pelos principais agentes quimioterápicos combinados utilizados na prática clínica para o tratamento de câncer de pulmão de não-pequenas células (CPNPC). Metodologia: Células da linhagem celular de CPNPC A549, foram plaqueadas com os quimioterápicos para indução da morte celular pelo período de 48 horas. Seguido da determinação da concentração das drogas a ser utilizadas com a quantificação da taxa de apoptose inicial com a marcação de anexina V e a exposição da CRT pela citometria de fluxo. O sobrenadante foi retirado para ser analizado o ATP pelo ensaio de bioluminescência e o HMGB1 pela técnica de Dot Blot. Resultados: As porcentagens de células apoptóticas iniciais encontradas para cada tratamento com quimioterápicos foram: controle: 4 ± 1%, cisplatina 40μM+ etoposide 13,2μM: 42,1± 8,8%, carboplatina 200μM + Paclitaxel 100 nM: 20,8 ± 4,1%. Expressão da CRT: controle: 0,002 ± 0,001%; cisplatina 40μM + etoposide 13,2 μM: 60,7 ± 1,87%, carboplatina 200μM + paclitaxel 100nM: 55,5 ± 4,6%. ATP: controle: 100; cisplatina 40μM + etoposide 13,2μM: 320,4 ± 9,4 e carboplatina 200 μM + paclitaxel 100 nM: 299,6 ± 6,4. HMGB1: controle: 1; cisplatina 40μM + etoposide 13.2 μM: 2,20 ± 0,10; carboplatina 200μM + paclitaxel 100nM: 1,56 ± 0,25. Conclusão: Observamos que, ao contrário de alguns estudos ambos as combinações de quimioterápicos possuem a capacidade de expressar os principais marcadores para desencadear a morte celular imunogênica. Podendo auxiliar no desenvolvimento e melhor direcionamento, dos quimioterápicos sobre a indução da morte imunogênica para o tratamento do CPNPC.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / A fumaça de cigarro (FC) está envolvida na gênese de inúmeras doenças como o câncer, doenças pulmonares e cardiovasculares. Sabe-se que a elevada produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) está implicada nesses processos fisiopatológicos, e que pode resultar na ativação da AMPK e na diminuição da mTOR, induzindo assim a autofagia. No entanto, ainda não está bem estabelecida a alteração autofágica em condição de exposição à FC no tecido pulmonar. Este estudo objetivou avaliar os efeitos da exposição à FC em diferentes tempos, nas moléculas envolvidas no processo autofágico, e a participação de SESN2, AMPK e mTOR na regulação e modulação da via autofágica. Analisar esses efeitos com a suplementação de N-acetilcisteína (NAC) e após a cessação da exposição à FC. Os experimentos foram conduzidos em três etapas. Com o objetivo de verificar as maiores alterações moleculares para a identificação do time course, na 1ª etapa, 60 camundongos Swiss foram divididos em 6 grupos (n=10), conforme o tempo de exposição à FC, sendo: 7, 15, 30, 45 e 60 dias, que foram expostos a 4 cigarros comerciais com filtro (alcatrão 10mg; nicotina 0,8mg; monóxido de carbono 10mg) por sessão, 3 sessões/dia, todos os dias da semana, e o grupo controle (CT): sem exposição. Devido aos grupos expostos apresentarem maiores alterações das moléculas autofágicas nos 45 dias, utilizou-se este tempo para as seguintes etapas do experimento. Na 2º etapa, os animais foram suplementados com NAC por gavagem oral (60mg/Kg/dia) e divididos em 4 grupos a saber: CT, CT + NAC, FC/45 dias sem NAC e FC/45 dias + NAC. A 3º etapa consistiu da cessação à FC na qual os animais foram divididos em 6 grupos: CT, FC/45 dias e FC/45 dias de exposição + os seguintes dias de cessação: 7, 15, 30 e 45. O tecido pulmonar foi coletado para análise das espécies reativas por DCFH e a detecção da fosforilação e dos níveis proteicos das moléculas foi realizada por western blot. Os resultados da 1ª etapa demonstraram que a exposição à FC aumentou significativamente a produção de ERO, a fosforilação de AMPK e ULK1, os níveis proteicos de SESN2, ATG12 e LC3B; e diminuiu a fosforilação de mTOR, nos 30, 45 e 60 dias de exposição. Na 2º etapa com a suplementação de NAC, as alterações moleculares foram prevenidas, comprovando o envolvimento das ERO na indução da autofagia. Na 3º etapa com a cessação da exposição à FC, ocorreu uma diminuição das ERO, da fosforilação de AMPK e ULK1, das moléculas autofágicas e aumento da fosforilação de mTOR, compatível com a atenuação da autofagia. Tomado em conjunto, os resultados confirmaram que das ERO geradas pela exposição à FC induziu aumento da fosforilação de AMPK tornando-a ativa, levando à autofagia a partir da inibição da mTOR e/ou através da ativação da ULK1, e que esses eventos foram prevenidos com a suplementação de NAC e após a cessação da exposição à FC.

Orientador: Leandro Gustavo de Oliveira / Resumo: Introdução: A gestação é uma condição fisiológica que pode apresentar maior suscetibilidade ao desequilíbrio entre fatores pró e antioxidativos, evoluindo assim com dano celular e resposta inflamatória. A autofagia é um processo que elimina organelas e proteínas danificadas do citoplasma, com potente mecanismo anti-inflamatório responsável pela manutenção da homeostase celular. A autofagia pode controlar a inflamação por meio da inibição da ativação do inflamassoma, complexo essencial para a liberação de citocinas pró-inflamatórias. Assim, alterações nesses processos podem relacionar-se com disfunções celulares e doenças sistêmicas. Objetivos: Este projeto teve como objetivo avaliar se a exposição de explantes placentários a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio (H2O2) é capaz de induzir autofagia e levar a ativação do inflamassoma NLRP3. Métodos: Explantes placentários de gestantes normais obtidos após o parto foram cultivados em diferentes concentrações de H2O2 por 4 e 24 h após a avaliação da viabilidade dos mesmos nesses períodos. As enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase foram avaliadas nos sobrenadantes das culturas após 4 h. As expressões gênicas de marcadores de autofagia (LC3-II, beclin-1 e p62), do inflamassoma (NLRP3 e caspase-1) e das citocinas IL-1β, IL-10 e TNF-α foram avaliadas por RT-qPCR. Os níveis de gonadotrofina coriônica (hCG), proteína de choque térmico 70 (Hsp70) e citocinas IL-1β, IL-10 e TNF-α foram determinados por ensaio imunoenz... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Resumo: A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome clinicamente identificada por hipertensão arterial e proteinúria e está associada à produção excessiva de citocinas proinflamatórias, deficiência na produção de citocinas reguladoras e aumento nos níveis séricos de anticorpos antifosfolípides (aPLs) em pacientes com PE grave. Os aPLs são uma família de autoanticorpos que reagem com proteínas ligantes de fosfolipídios, sendo seu principal alvo a beta-2 glicoproteina I (β2GPI). Estes anticorpos são responsáveis por inibir a diferenciação do sinciciotrofoblasto e restringir a migração trofoblástica, resultando em remodelação anormal das arteríolas espiraladas, alteração característica da PE. O inflamassoma é um complexo proteico que promove a secreção das citocinas proinflamatórias interleucina-1 beta (IL-1β) e interleucina 18 (IL-18) e, também a secreção da proteína “high-mobility group box 1” (HMGB1) após ativação por patógenos e/ou produtos endógenos associados ao dano celular. A autofagia é uma via de degradação celular ou de eliminação de organelas e proteínas através de processos lisossomais que são importantes para a manutenção da homeostase celular, promovendo a sobrevivência das células em resposta ao estresse. O presente trabalho teve como objetivos: 1. Investigar as proteinas relacionadas ao inflamassoma e à autofagia em placenta de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia e de normotensas; 2. Avaliar a relação existente entre inflamassoma e autofagia em células de trofoblasto extravil... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Preeclampsia (PE) is a syndrome clinically identified by hypertension and proteinuria and is associated with excessive production of proinflammatory cytokines, deficiency in the production of regulatory cytokines, and increased serum levels of antiphospholipid antibodies (aPLs) in patients with severe forms of PE. aPLs are a family of autoantibodies that react with phospholipid binding proteins, which the main target is beta 2 glycoprotein-I (β2GPI). These antibodies are responsible for inhibiting the differentiation of syncytiotrophoblast and restrict trophoblast migration, resulting in abnormal remodeling of the spiral arterioles, characteristic alteration in PE. The inflammasome is a protein complex that promotes the secretion of the proinflammatory cytokines interleukin-1 beta (IL-1β) and interleukin 18 (IL-18), and also the secretion of high-mobility group box 1 (HMGB1) protein after activation by pathogens and/or endogenous products associated with cellular damage. Autophagy is a pathway of cell degradation or elimination of organelles and proteins by lysosomal processes that are important for the maintenance of cellular homeostasis by promoting the survival of cells in response to stress. The objectives of the present study are: 1. To investigate the proteins related to inflammasome and autophagy in placenta from pregnant women with PE and from normotensive control; 2. To evaluate the relationship between inflammasome and autophagy in human extravillous trophoblast cel... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Autofagia é o processo catabólico que ocorre nos lisossomos, e tem por finalidade degradar os componentes celulares e proteínas que já não são mais funcionantes e, assim manter seu equilíbrio homeostático para sobreviverem adequadamente em condições estressantes. Diante das funções biológicas da autofagia identificadas até hoje, a relação entre autofagia celular e neoplasias está provavelmente entre as mais estudadas, devido ao papel duplo que a autofagia exerce sobre o desenvolvimento do câncer, podendo atuar como um mecanismo supressor de tumor ou, podendo ser um mecanismo fundamental para a sobrevivência de células neoplásicas. No entanto, em lesões potencialmente malignas não se sabe sobre o comportamento do processo autofágico. Dessa forma, nosso estudo se propôs a estudar o comportamento da autofagia em neoplasias e em lesões potencialmente malignas bucais e correlacionar com os parâmetros clínicos e a evolução dessas lesões. Para tal finalidade foi utilizado a técnica de imunoistoquímica para avaliar em amostras de mucosa normal, leucoplasias e carcinomas espinocelulares bucais, o percentual de células positivas para o marcador LC3-II. Foram avaliadas 7 amostras de mucosa bucal normal, 51 leucoplasias e 120 carcinomas espinocelulares. Para a análise de carcinomas espinocelulares foi construído um microarranjo tecidual com 2 cilindros de cada paciente. Observamos o aumento dos níveis de autofagia no carcinoma espinocelular bucal (p<0,001) em relação aos outro grupos, porém sem associação com a evolução e sobrevida desses pacientes. Entre as leucoplasias, observamos maior percentual de células positivas na camada intermediária de leucoplasias 12 displásicas (p=0,0319) e na camada basal de lesões com pior evoluação (p=0,0133). Concluimos que os níveis de autofagia aumentam durante o processo de carcinogênese bucal e estão correlacionados com o pior comportamento das leucoplasias. / Autophagy is a catabolic process to digest the cell components and proteins that are no functional anymore. Autophagy maintains the homeostasis in order to cells survive in stressful conditions. In view of the biological functions of autophagy identified to date, the relationship between cellular autophagy and neoplasia is probably among the most studied, due to the dual role that autophagy exerts on the development of cancer. Cell autophagy can act as a tumor suppressor mechanism, or as a key mechanism for the survival of neoplastic cells. However, it is not known in potentially malignant lesions how the autophagic process is controlled. Therefore, the purpose of this study is to assess the autophagic process in oral cancer and potentially malignant oral lesions and to correlate with clinical parameters and the evolution of these lesions. For this purpose, the immunohistochemical technique was used to evaluate the percentage of cells positive for the LC3-II marker in the normal mucosa, leukoplakia and oral squamous cell carcinoma samples. Seven samples of normal buccal mucosa, 51 leukoplakia and 120 squamous cell carcinomas were evaluated. For the squamous cell carcinomas analysis, a tissue microarray with 2 cylinders of each patient was constructed. We observed increased levels of autophagy in oral squamous cell carcinoma (p <0.001) in relation to the other groups, however no association with the prognosis and survival of these patients was detected. Among the leukoplakias, we observed a higher percentage of positive cells in the intermediate layer of dysplastic leukoplakias (p = 0.0319) and in the basal layer of lesions with worse prognosis (p = 0.0133). We conclude that autophagy levels increase during the process of oral carcinogenesis and are correlated with the worse behavior of leukoplakia

O câncer de pulmão é a principal causa de morte por câncer na população mundial. Muitos estudos vêm demonstrando que em determinados tipos tumorais, algumas drogas quimioterápicas estimulam uma eficiente resposta antitumoral, através da indução de uma forma de apoptose conhecida como morte celular imunogênica, sendo caracterizado por uma série de alterações que ocorrem no processo apoptótico, como a exposição pré-apoptótica da calreticulina (CRT) na superfície celular, a liberação de ATP e HMGB1 para o microambiente tumoral. Objetivo: Avaliar a possível morte celular imunogênica causada pelos principais agentes quimioterápicos combinados utilizados na prática clínica para o tratamento de câncer de pulmão de não-pequenas células (CPNPC). Metodologia: Células da linhagem celular de CPNPC A549, foram plaqueadas com os quimioterápicos para indução da morte celular pelo período de 48 horas. Seguido da determinação da concentração das drogas a ser utilizadas com a quantificação da taxa de apoptose inicial com a marcação de anexina V e a exposição da CRT pela citometria de fluxo. O sobrenadante foi retirado para ser analizado o ATP pelo ensaio de bioluminescência e o HMGB1 pela técnica de Dot Blot. Resultados: As porcentagens de células apoptóticas iniciais encontradas para cada tratamento com quimioterápicos foram: controle: 4 ± 1%, cisplatina 40μM+ etoposide 13,2μM: 42,1± 8,8%, carboplatina 200μM + Paclitaxel 100 nM: 20,8 ± 4,1%. Expressão da CRT: controle: 0,002 ± 0,001%; cisplatina 40μM + etoposide 13,2 μM: 60,7 ± 1,87%, carboplatina 200μM + paclitaxel 100nM: 55,5 ± 4,6%. ATP: controle: 100; cisplatina 40μM + etoposide 13,2μM: 320,4 ± 9,4 e carboplatina 200 μM + paclitaxel 100 nM: 299,6 ± 6,4. HMGB1: controle: 1; cisplatina 40μM + etoposide 13.2 μM: 2,20 ± 0,10; carboplatina 200μM + paclitaxel 100nM: 1,56 ± 0,25. Conclusão: Observamos que, ao contrário de alguns estudos ambos as combinações de quimioterápicos possuem a capacidade de expressar os principais marcadores para desencadear a morte celular imunogênica. Podendo auxiliar no desenvolvimento e melhor direcionamento, dos quimioterápicos sobre a indução da morte imunogênica para o tratamento do CPNPC.

Uma série de três complexos de cobre(II) dinucleares, contendo ligantes nitrogenados e grupos aromáticos (compostos 2, 4 e 6), foi sintetizada e caracterizada por diversas técnicas espectroscópicas (UV/Vis, IV e EPR). Esses compostos tiveram sua atividade tirosinase avaliada à temperatura ambiente, através da oxidação de L-di-hidroxifenilalanina (L-dopa), e sua citotoxicidade investigada frente a células melanomas, comparada às de complexos análogos de cobre(II) mononucleares (compostos 1, 3 e 5). A influência da luz UVB, que estimula a melanogênese, também foi verificada. A exposição das células à radiação de intensidade (13 ± 2) mJ/cm2 aumentou os danos causados, principalmente em presença das espécies dinucleares. A citotoxicidade dos diferentes complexos foi determinada frente a duas linhagens de melanomas humanos (SKMEL-05 e SKMEL-147), após 24 e 48h de incubação. Células com maior teor de melanina foram mais sensíveis aos efeitos dos complexos. Verificou-se um aumento na porcentagem de células na fase sub-G1 do ciclo celular após tratamento por 24 ou 48h com estes complexos, ao contrário do verificado frente a queratinócitos não tumorais. Testes clonogênicos também indicaram maior atividade do composto (2) contendo dois centros de cobre em sua estrutura, com diminuição significativa no número de células sobreviventes após tratamento. Ensaios complementares mostraram a redução dos íons de cobre(II) nos compostos (1) e (2) em presença de melanina e a formação de espécies reativas de oxigênio (radicais hidroxil e ânions superóxido), através de espectroscopia EPR ou do uso de sondas fluorescentes. Adicionalmente, foi constatado um aumento no nível de vacúolos citoplasmáticos após tratamento com o complexo (2), indicando indução à autofagia, corroborada pelo monitoramento das proteínas LC3 e tubulina, implicadas neste processo de morte celular. Os resultados apontam para a ocorrência de pelo menos dois mecanismos de ação dos complexos frente aos melanomas, por processo apoptótico e autofágico. Indicam ainda que esta reatividade frente a melanomas é fortemente dependente da estrutura dos complexos de cobre, sendo mais significativa para os dinucleares / A series of dinuclear copper(II) complexes containing nitrogen ligands and aromatic groups (compounds 2, 4 and 6), were synthesized and characterized by various spectroscopic methods (UV/Vis, IR and EPR). These complexes had their tyrosinase activity evaluated at room temperature, through the oxidation of L-di-hidroxyphenylalanine (L-dopa), and its cytotoxicity toward melanoma cells investigated, in comparison with the toxicity of the corresponding mononuclear complexes (compounds 1, 3 and 5). The influence of UVB light, that stimulates melanogenesis, was also verified. The exposition of the cells to radiation of intensity (13 ± 2) mJ/cm2, increased the caused damage, especially in the presence of dinuclear species. The cytotoxicity of the different complexes was determined toward two cell lines of human melanomas (SKMEL-05 e SKMEL-147), after 24 and 48h incubation. Cells containing higher leveis of melanin were more sensitive to the effects of the complexes. An increasing in the percentage of cells in the sub-G1 phase of cellular cycle was verified after treatment for 24 or 48h with these complexes. On the contrary, this effect was not observed with non-tumor keratinocytes. Clonogenic tests also indicated higher activity of compound 2 containing two copper centers in its structure, with a significant decrease in the number of survival cells after the treatment. Complementary assays show the reduction of copper(II) ions in complexes (1) and (2), in the presence of melanin, as well as the formation of reactive oxygen species (hydroxyl radicais and superoxide anions) via EPR spectroscopy or the use of fluorescent labels. Further, an increase in the levei of cytoplasmatic vacuoles was verified after treatment with complex (2), indicating induction to autophagy, which was corroborated by monitoring the proteins LC3 and tubulin, implicated in this process of cell death. The results pointed to the occurrence of at least two mechanisms of action of these complexes toward melanomas, apoptotic and autophagic processes. Also, they indicated that the reactivity of the studied compounds is strongly dependent on its structural features, being more remarkable to the dinuclear ones.

A desnutrição pode induzir lesão celular, comprometendo os mecanismos envolvidos de proliferação, diferenciação e morte celular. Estudos de nosso laboratório tem demonstrado, em modelo murino de desnutrição protéica e protéico-energética, hipoplasia medular com evidências histológicas de alteração da matriz extra celular. Nosso objetivo foi avaliar a eventual participação dos processos de apoptose, necrose e autofagia no desenvolvimento da hipoplasia medular observada nesse modelo. Para isso foram utilizados dois grupos de camundongos C57BL/6J machos, adultos, mantidos em gaioleiros metabólicos. O grupo controle (C) recebeu ração normoproteíca contendo 12% de proteína e o grupo desnutrido (D), alimentado com ração hipoprotéica contendo 2% de proteína. A fonte protéica utilizada foi a caseína. O período de indução da desnutrição foi cerca de cinco semanas, definido pela perda de 20 a 25 % de peso corpóreo por parte dos animais do grupo desnutrido. Após esse período, os animais de ambos os grupos foram anestesiados e realizada a coleta das amostras biológicas para avaliação nutricional e hematológica e coletadas células da medula óssea para avaliação da apoptose, necrose e autofagia. Para avaliação da apoptose e necrose as células foram duplamente marcadas com Annexina V, PI e caspase 3 que foram analisadas por citometria de fluxo . A expressão da protéina BCL-2 foi quantificada pela técnica de Western Blotting. A análise não demonstrou diferença estatística entre os grupos para esses parâmetros. Para avaliação da autofagia extraiu-se proteínas das células da medula óssea e avaliou-se a expressão das proteínas Akt e mTOR total e fosforilado , os complexos de mTor (Raptor, Rictor e G&#946;l) , Beclin-1 e LC3II. Os resultados demonstraram aumento significativo de mTOR total ,Raptor , Beclin-1 e LC3II e diminuição na fosforilação de mTOR nas células oriundas de animais desnutridos em relação ao grupo controle. A desnutrição não modificou a expressão de Akt total, porém houve diminuição da fosforilação de Akt e diminuição na expressão das proteínas Rictor e G&#946;l nas células analisadas. Como os processos apoptóticos e autofágicos podem ser de difícil detecção in vivo, também refizemos os experimentos in vitro, estimulando as células com compostos pró-apoptóticos (campotecina) e pró-autofágicos (tamoxifeno). Nesses experimentos observamos que, apenas quando estimulamos as células de animais desnutridos com camptotecina, as mesmas, no período de 12 horas apresentaram maior percentagem de apoptose inicial em relação a 0 horas , sugerindo que há um período em que as células desnutridas são sinalizadas para via apoptótica sendo mais susceptível ao estimulo. As células de animal desnutrido estimulado apresentaram após 12 horas aumento significativo da apoptose tardia em relação ao controle estimulado , indicando que nesse período há um aumento da apoptose tanto em processo inicial , tanto em processo tardio. Avaliamos a autofagia em uma cinética de 0, 2, 6, 18 e 24 horas in vitro e observamos aumento significativo da autofagia em células da medula óssea de animais desnutridos em 0 horas e após 18 horas de estímulo com tamoxifeno (20 &#181;M) em relação ao respectivo controle, demonstrando que nesse período a autofagia começa a ser induzida através do estimulo mais facilmente do que o controle. Autofagia é um dos principais contribuintes para o metabolismo celular, fornecendo nutrientes quando os mesmos estão indisponíveis, e, portanto, no nosso modelo de desnutrição protéica a hipoplasia medular estaria em processo autofágico como mecanismo de reparo e sobrevivência. / Malnutrition can induce cell damage, compromising the mechanisms involved in proliferation, differentiation and cell death. Studies from our laboratory have demonstrated, in a murine model of protein malnutrition and protein-energy, marrow hypoplasia with histologic evidence of alteration of the extracellular matrix. Our objective was to evaluate the possible involvement of the processes of apoptosis, necrosis and autophagy in the development of bone marrow hypoplasia observed in this model. For this we used two groups of C57BL/6J adult male kept in metabolic gaioleiro. The control group (C) received normal protein diet containing 12% protein and undernourished group (D), fed low protein diet containing 2% protein. The protein source used was casein. The induction period of undernutrition was approximately five weeks, as defined by loss of 20 to 25% of body weight per part of group malnourished. After this period, the animals of both groups were anesthetized and held the collection of biological samples for nutritional assessment and hematology and bone marrow cells collected for evaluation of apoptosis, necrosis and autophagy. For assessment of apoptosis and necrosis of the cells were double labeled with Annexina V and PI caspase 3 were analyzed by flow cytometry. The expression of Bcl-2 was quantified by Western Blotting technique. The analysis revealed no statistical difference between the groups for these parameters. For evaluation of autophagy proteins extracted from bone marrow cells and evaluated the expression of proteins Akt and phosphorylated and total mTOR, complexes of mTOR (Raptor, and Rictor G&#946;l), Beclin-1 and LC3II. The results showed significant increase in overall mTOR, Raptor, and LC3II Beclin-1 and decreased phosphorylation of mTOR in cells derived from malnourished animals compared to the control group. Malnutrition did not modify the expression of Akt total, but decreased phosphorylation of Akt and decreased expression of the protein Rictor and G&#946;l cells analyzed. As apoptotic and autophagic processes can be difficult to detect in vivo, also redid the experiments in vitro, stimulating the cells with pro-apoptotic compounds (campotecina) and pro-autophagic (tamoxifen). In these experiments we observed that, when only stimulate cells with camptothecin malnourished, the same at 12 hours had a higher percentage of initial apoptosis compared to 0 hours, suggesting that there is a period in which cells are signaled to via malnourished being more susceptible to apoptotic stimuli. The animals starved cells stimulated after 12 h showed significant increase in apoptosis compared to control late stimulated, indicating that at that time there is an increase in apoptosis both in the initial process, both late process. Autophagy evaluated in kinetics of 0, 2, 6, 18 and 24 hours in vitro and observed a significant increase in autophagy in bone marrow cells of malnourished at 0 hours and after 18 hours stimulation with tamoxifen (20 microM) than the respective control, demonstrating that this period autophagy begins to be induced by stimulating more easily than the control. Autophagy is a major contributor to cellular metabolism, providing nutrients when they are unavailable, and therefore in our model of protein malnutrition in the marrow hypoplasia would autophagic process as a mechanism for survival and repair.

Os éteres difenílicos polibromados (PBDEs) são compostos amplamente utilizados como retardantes de chamas que foram introduzidos por volta da década de 1970, em uma gama de produtos industrializados, especialmente em aparelhos eletrônicos. No entanto, em contrapartida ao seu papel benéfico como dispositivo de segurança, esses compostos apresentam uma estrutura química que proporciona ao homem preocupantes efeitos tóxicos que, de acordo com vários estudos, são responsáveis por desencadearem problemas neurotóxicos e hormonais, assim como influenciarem no desenvolvimento de algumas doenças. Além disso, suas características físico-químicas permitem que eles sejam bioacumulados e persistentes no meio ambiente. Diante desses fatores, tornam-se importantes estudos que melhor caracterizem o mecanismo de ação desses compostos e, portanto, a proposta do projeto foi analisar os efeitos do congênere 2, 2\' ,3, 3\' ,4, 4\' ,5, 5\' ,6, 6\' decabromodifenil éter (BDE-209) em células de hepatocarcinoma humano do tipo HepG2, aplicando como método de análise os ensaios de citotoxicidade durante indução autofágica. Os resultados obtidos mostraram que o BDE-209, como observados em outros estudos do nosso laboratório, não apresentou toxicidade acentuada em comparação aos outros congêneres, pois mostrou resultados significativos apenas nas maiores concentrações. A indução autofágica, por sua vez, não proporcionou efeitos protetivos contra a citotoxicidade do BDE, pelo contrário, ela foi capaz de perturbar ainda mais a homeostasia celular e de causar necrose na presença de 25 µmol.L-1 do congênere. Suplementariamente, foram coletadas amostras de sedimentos provenientes de uma lagoa pertencente à área de recarga do aquífero Guaraní no município de Ribeirão Preto para a quantificação de PBDEs com o objetivo de determinar o nível de contaminação desse ambiente. Estas amostras foram analisadas por cromatografia gasosa com detector por captura de elétrons (CG-ECD), após um processo de extração, clean up e pré-concentração. Os resultados obtidos mostraram a presença de seis BDEs com somatórias de suas concentrações nos valores de 4,03 ng.g-1 e 5,38 ng.g-1 em duas amostras coletas, tendo como congênere em destaque o 2, 2\', 4, 4\' tetrabromodifenil éter (BDE-47). / The polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are compounds widely used as flame retardants, introduced around 1970, in a diversity of industrial products especially electronics. However, in contrast to its beneficial role as a safety device, these compounds have a chemical structure, which provides to humans worrisome toxic effects, because according to several studies, they are responsible for triggering neurotoxic and hormonal problems, as well as influence in the development of some diseases. Moreover, its chemical composition allows them to be bioaccumulated, which gives potential effects, since they are persistent in the environment. Given these factors, studies that can better describe these compounds action mechanism are important. Therefore, the proposal of this project was to analyze the effect of 2, 2\' ,3, 3\' ,4, 4\' ,5, 5\' ,6, 6\'-decabromodiphenyl ether (BDE-209) using as model the human hepatocellular carcinoma cells, HepG2, applying cytotoxicity assays during autophagic induction. The results showed that BDE-209, as observed in other studies of our group, induced no severe toxicity like other congeners as it showed significant results only in higher concentrations. The autophagic induction had no protective effects against the BDEs cytotoxicity, on the contrary, it was able to affect cells homeostasis and cause necrosis in the presence of 25 mol.L-1 of the congener. Additionally, sediment samples were collected from a recharge point of Guaraní aquifer in Ribeirão Preto for quantification of these compounds to determine the level of contamination in this environment. These samples were analyzed by gas chromatography with electron capture detector (CG-ECD) after a process of extraction, clean up and preconcentration. The results showed the presence of six BDEs with total concentration of 4.03 ng.g-1 and 5.38 ng.g-1 in two samples collected, which the main congener was 2, 2\', 4, 4\' tetrabromodiphenyl ether (BDE-47).