Le gène GALIG, interne à celui de la GALECTINE-3, permet la production de 2 protéines, les Galigines, qui interagissent avec des protéines de l’autophagie. Décrit comme un gène pro-apoptotique, il est inhibé par l’anti-apoptotique Mcl-1. Il est sous-exprimé dans la moelle osseuse (MO) de patients atteints de Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM) M2, pathologie caractérisée par un blocage de la différenciation. Au cours de cette thèse, j’ai pu montrer que le gène GALIG pourrait être impliqué dans la différenciation myéloïde. Son expression augmente de façon croissante chez les LAM en fonction de l’état de différenciation de la cellule leucémique. De plus, bien que faible au diagnostic, l’expression du gène augmente également dans la MO et le sang après traitement de chimiothérapie. Ces observations sont renforcées par des études in vitro qui indiquent que l’expression de GALIG augmente précocement lors de la différenciation en polynucléaires et en macrophages, avant l’apparition des caractéristiques de maturation terminale. La survie de ces cellules, suite à l’activité de GALIG pendant la différenciation, pourrait être assurée grâce à l’augmentation de l’expression du gène anti-apoptotique MCL1. Dans le sang de patients infectés par le Virus de l’Immunodéficience Humaine, traités et sans charge virale, à l’inverse des LAM, il est observé une surexpression de GALIG. Ceci suggère une perturbation du système immunitaire. En plus de l’activation de GALIG, il est noté une dérégulation de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l’autophagie. Ceci pourrait conduire à une inhibition du niveau basal de l’autophagie chez ces patients, qui pourrait être à l’origine du vieillissement prématuré des cellules sanguines et qui serait liée à l’inflammation chronique observée chez ces patients. En conclusion, ces résultats nous encouragent à poursuivre les études qui visent à comprendre les mécanismes de régulation de l’expression du gène GALIG et les mécanismes d’action des Galigines. / Embedded within the GALECTIN-3 gene, GALIG gene allows the production of 2 proteins, Galigins, which interact with autophagy proteins. Described as a pro-apoptotic gene, it is inhibited by Mcl-1, an anti-apoptotic protein. It is under-expressed in the bone marrow (BM) of patients with Acute Myeloid Leukemia (AML) M2, a pathology characterized by a differentiation blocking. During my thesis, I showed that the GALIG gene could be involved in myeloid differentiation. The expression of GALIG gene gradually increases in AML with the differentiation stage of the leukemic cell. In addition, although weak at diagnosis, GALIG gene expression also increases in BM and blood after chemotherapy treatment. These observations are reinforced by in vitro studies which indicate that GALIG expression increases early during polymorphonuclear and macrophages differentiations, before the onset of terminal maturation features. Cell survival during differentiation could be ensured by the increasing expression of the MCL1 which could counteract the apoptotic function of GALIG. In the blood of treated HIV-infected patients, without viral load, the transcription rate of GALIG is higher when compared to uninfected donors. This suggests a possible dysfunction of the immune system. In addition, several autophagy genes are dysregulated which could lead to the inhibition of the basal level of autophagy in these patients, which in turn could be a cause of the premature aging of blood cells and linked to the chronic inflammation reported for efficient treated HIV patients. In conclusion, these results encourage us to pursue studies deciphering the mechanisms of regulation of the GALIG gene expression and the mechanisms of action of the Galigins.

Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive. Il s’agit d’une tumeur capable de survivre même dans des conditions d’oxygénation faible ou hypoxie. En effet, les cellules cancéreuses du GBM activent des voies de survie en réponse à cette privation de dioxygène, dont l’autophagie. Il s’agit d’un mécanisme catabolique conduisant à la dégradation des constituants cellulaires, générant ainsi des précurseurs pour l’anabolisme cellulaire ainsi que de l’ATP. Nous avons étudié l’activation de l’autophagie en réponse à l’hypoxie, dans trois lignées cellulaires de GBM humain, les U87MG, les M059K et les M059J. Une autophagie de survie est activée dans les trois lignées cellulaires, en réponse à l’hypoxie. L’inhibition du flux autophagique par la chloroquine (CQ), induit une accumulation des autophagosomes, soulignant ainsi l’efficacité du processus. L’inhibition de l’autophagie par la CQ ou par des siRNA spécifiques dirigés contre les transcrits de Beclin1 ou d’Atg5, entraîne une diminution significative de l’activité métabolique cellulaire, ainsi qu’un retard de prolifération. Toutefois, nous n’avons pas détecté de mort apoptotique dépendante des caspases. Nous avons donc étudié une deuxième voie de signalisation de survie cellulaire, la signalisation neurotrophique. Une augmentation significative des transcrits de TrkC FL et T1 (TrkC tronqué) ainsi que de leur ligand, la NT-3 a été observée dans les cellules U87MG cultivées en hypoxie. De même, le taux de production des protéines TrkC FL et T1 a significativement augmenté en hypoxie. L’augmentation de l’expression du TrkC FL était accompagnée par une augmentation de sa phosphorylation et de celle de la p38 MAPK. L’inhibition de cette dernière par siRNA induit un clivage de la PARP, qui est d’autant plus important suite à l’ajout de la CQ. Ces effets étaient plus marqués au niveau des cellules cultivées en hypoxie. L’inhibition de l’autophagie par la CQ, augmente l’expression de TrkC FL et la phosphorylation de la p38, ce qui suggère qu’en absence de l’autophagie, les cellules s’adapteraient en augmentant la signalisation du TrkC.La recherche des zones hypoxiques et autophagiques sur des coupes de tumeurs issues de patients atteints de GBM, confirme le caractère hypoxique de cette tumeur, et montre une induction du processus autophagique. En comparaison avec le cavernome (tumeur cérébrale bénigne), les patients atteints de GBM montrent une augmentation significative de l’expression de TrkC et de NT-3, ce qui renforce l’importance de la signalisation neurotrophique dans la survie des cellules de GBM. / Glioblastoma multiform (GBM), a primary brain tumor that is the most common and the most aggressive. It’s characterized by a high degree of hypoxia and a resistance to therapy because of its adaptation capacities including autophagy. This degradation process allows recycling of cellular components to produce precursors for anabolism and ATP. We have studied the hypoxia-induced autophagy in three human GBM cell lines, the U87MG, M059K and M059J. We have found a survival hypoxia-induced autophagy that was efficient in all cell lines. Indeed, we observed an accumulation of autophagosomes when we inhibited the autophagic flux with chloroquine (CQ). Treatment with CQ or interference of Beclin1 or Atg5 expression by specific siRNA in GBM cells significantly decreased their metabolic activity and growth. However, we did not detect PARP cleavage by western blotting. Thus, we verified the neurotrophic signaling as another survival pathway by which GBM cells resist to hypoxia. After hypoxia, the transcription level of TrkC FL (full length), TrkC-T1 (truncated TrkC) and the NT-3 (the TrkC ligand) significantly increases in the U87MG cell lines, as far as the translation level of TrkC FL and TrkC-T1. When we explored the TrkC FL signaling pathway, there was an increase in the phosphorylation level of p38. After inhibition of this MAPK, we observed PARP cleavage, which was particularly important in hypoxia conditions. This cleavage was further enhanced upon CQ treatment. The autophagy inhibition using either CQ, siBeclin1 or siAtg5, increases TrkC FL and T1 expression, suggesting that in the absence of autophagy, cells would adapt by increasing TrkC signaling.Finally, we have verified for hypoxic (BNIP3) and autophagic (LC3) markers on tumor sections from patients with GBM. We confirmed the hypoxic character of GBM, and showed important autophagy activation, after autophagosomes quantification. In comparison with cavernoma (benign brain tumor), patients with GBM showed a significant increase in TrkC and NT-3 expression, highlighting the importance of neurotrophic signaling in GBM tumor cell survival.

Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez l’homme de plus de 50 ans dans les pays industrialisés. L’importance accordée à la qualité de vie des patients conduit la recherche médicale à développer des méthodes de thérapie focale afin de traiter ce type de cancer de manière conservatrice et non plus de manière radicale. Dans cette optique, la photothérapie dynamique (PDT) repose sur l’utilisation de photosensibilisateurs (PS) capables de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses et qui, une fois activés par la lumière, vont induire la mort de ces cellules. Sur la base de la chimie verte, le Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles (LCSN) de Limoges a développé une stratégie de couplage de la protoporphyrine IX (PpIX), un PS largement étudié, avec des polyamines (PA). Les effets de ces nouveaux PS [la protoporphyrine IX dispermidinée (PpIX-dSd) et la protoporphyrine IX disperminée (PpIX-dSm)] ont été étudiés sur les cellules cancéreuses prostatiques humaines PC-3, DU 145 et LNCaP. Ce travail a permis de démontrer que ces deux PS répondent aux critères attendus d’un PS : une composition pure, une absence de toxicité en absence de lumière et une sélectivité vis-à-vis des cellules tumorales. De plus, ces PS induisent l’apoptose de ces cellules via la voie intrinsèque. Aussi les voies de résistance à l’apoptose ont été étudiées : les PS induisent une inhibition d’Akt, de Bcl-2, de NF-κB et de la voie autophagique et activent la voie p38/COX-2/PGE2 qui ne semble pas être impliquée dans un mécanisme de résistance à l’apoptose dans ce modèle d’étude. Enfin, l’efficacité de ces PS, et notamment de la PpIX-dSd, a été mise en évidence in vivo, à l’aide de xénogreffes sous-cutanées de cellules PC-3 effectuées sur des souris nudes. Ainsi, ces dérivés de PpIX-PA apparaissent comme de bons candidats dans le cadre du traitement du cancer de la prostate par PDT. / Prostate cancer is the most frequently diagnosed cancer among men aged 50 years and older in industrialized countries. Medical research developed methods of focal therapy to treat this type of cancer conservatively and not radically in order to improve the patients quality of life. With this in mind, photodynamic therapy (PDT) is based on the use of photosensitizers (PS) able to specifically target cancer cells and, once activated by light, induce cell death. Based on Green Chemistry, the Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles (LCSN) from Limoges developed new PS: protoporphyrin IX, a PS widely studied, vectorized with polyamines (PA). The effects of spermidine-linked protoporphyrin IX (PpIX-dSd) and spermine-linked protoporphyrin IX (PpIX-dSm) were studied on human prostate cancer cells PC-3, DU145 and LNCaP. This study demonstrated that both PS have the expected ideal properties: a pure composition, no toxicity in dark and ability to specifically target tumor cells. Moreover, PpIX-PA induced apoptotic intrinsic pathway. In addition, pathways involved in apoptosis resistance were studied: PS inhibited Bcl-2, Akt, NF-¦ÊB and autophagy but activated p38/COX-2/PGE2 pathway which was not involved in apoptosis resistance in our model. Finally, in vivo experiments showed PpIX-PA efficiency using subcutaneous xenograft of PC-3 cells performed on nude mice. Thus, these derivatives of PpIX-PA appear to be good candidates in prostate cancer treatment by PDT.

La sclérose tubéreuse complexe (TSC) est une maladie génétique caractérisée par une croissance des hamartomes dans différents organes y compris le cerveau, les reins, les poumons, la peau et le cœur. Ces lésions sont des sources de morbidité et de mortalité chez les patients TSC, car ils peuvent provoquerl’ épilepsie, l’autisme, le retard de développement et l’insuffisance rénale et pulmonaire. Les causes connues de TSC sont la perte de la fonction et les mutations des gènes TSC1 et TSC2. La majorité des lésions TSC contient plusieurs types cellulaires de la lignée mésenchymateuse, comme dans le cas des angiomyolipomes, l’lymphangioleiomyomatose et les angiofibromes. Un type unique de cellules épithélioïdes périvasculaires nommé (PEC) est constamment présent dans les lésions de TSC mésenchymateuses, comme angiomyolipomes et lymphangioleiomyomatose, basant sur les caractérisations morphologiques et l'expression des marqueurs communs mélanocytaires et myogéniques. Par conséquent, ces lésions sont officiellement classées, ainsi que d'autres tumeurs, comme PEComes. Leur origine cellulaire et les mécanismes moléculaires impliqués dans la pathologie restent à élucider. Ici, nous avons généré un modèle souris mosaïque TSC1 knockout qui développe des lésions rénales mésenchymateuses récapitulant périvasculaire épithélioïde cellules tumorales humaines (Pecoma) observés chez les patients TSC. Nous avons identifié YAP, le co-activateur transcriptionnel de la voie Hippo, a été régulée d'une manière mTOR-dépendante dans les lésions rénales de notre TSC1 knockout souris et les échantillons de l’angiomyolipome humaines. L'inhibition de YAP avec des outils génétiques ou pharmacologiques atténue considérablement la prolifération et la survie des cellules nulles TSC1 in vivo et in vitro. En outre, l’accumulation de YAP dans les cellules déficientes TSC1 / TSC2 pourra être dû à la dégradation de la protéine altéré par le système de l’autophagosome / lysosome. Ainsi, la régulation de YAP par mTOR et l'autophagie est un nouveau mécanisme de contrôle de la croissance, l'activité de YAP correspondant à la disponibilité des éléments nutritifs dans les conditions de croissance permissives. Il pourra servir comme une cible thérapeutique potentielle pour TSC et d'autres maladies avec une activité de mTOR dérégulée. / The Tuberous Sclerosis Complex (TSC) is a genetic disease characterized by growth of hamartomas in different organs including brain, kidney, lung, skin, and heart. These lesions are sources of morbidity and mortality in patients with TSC, as they may cause intractable epilepsy, autism, developmental delay, renal and pulmonary failure. Known causes of TSC are loss of function mutations in TSC1 and TSC2 genes. The majority of TSC lesions contain multiple cell types of the mesenchymal lineage, as in the case of angiomyolipomas, lymphangioleiomyomatosis and angiofibromas. A unique cell type named perivascular epithelioid cell (PEC) is constantly present in mesenchymal TSC lesions, such as angiomyolipomas and lymphangioleiomyomatosis, basing on morphological features and the common expression of melanocytic and myogenic markers. Therefore, these lesions are officially classified, along with other tumors, as PEComas. Their cell of origin and the molecular mechanisms underlying their pathogenesis remain poorly defined. Here we generated a novel mosaic Tsc1 knockout mouse model which develop renal mesenchymal lesions recapitulating human Perivascular Epithelioid Cell tumor (PEComa) observed in TSC patients. We identified YAP, the transcriptional coactivator of Hippo pathway, was upregulated in both renal lesions of TSC mouse model and human angiomyolipoma samples in a mTOR-dependent manner. Inhibition of YAP with genetic or pharmacological tools greatly attenuates the proliferation and survival of Tsc1 null cells in vivo and in vitro. Futhermore, we found YAP accumulation in TSC1/TSC2 deficient cells is due to impaired degradation of the protein through the autophagosome/lysosome system. Thus the regulation of YAP by mTOR and autophagy is a novel mechanism of growth control, matching YAP activity with nutrient availability under growth permissive conditions. It may serve as a potential therapeutical target for TSC and other diseases with dysregulated mTOR activity.

Notre laboratoire a caractérisé TP53INP1 comme un gène clé de réponse au stress cellulaire. Cible de p53, TP53INP1 est ubiquitairement exprimé et fortement induit lors de différents stress in vivo et in vitro. Sa surexpression ectopique induit un arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire. Nous avons montré que l’expression de TP53INP1 est perdue dans plusieurs cancers chez l’homme et que sa réexpression dans les cellules cancéreuses inhibe la croissance tumorale. De plus, les souris TP53INP1-déficientes sont très susceptibles au développement de tumeurs induites et présentent un stress oxydatif permanent caractérisé par une augmentation du taux de ROS. L’ensemble de ces résultats indique que TP53INP1 possède une fonction suppressive de tumeur probablement en lien avec son implication dans la régulation du statut redox cellulaire. Le but de mon travail de thèse est de décrypter cette fonction an niveau cellulaire et moléculaire en exploitant le modèle des souris déficientes. Mes travaux montrent que l’absence de TP53INP1 affecte tous les processus biologiques dérégulés lors de la tumorigenèse. En effet, la perte de TP53INP1 se caractérise par une augmentation de la prolifération cellulaire, de la migration cellulaire, de l’angiogenèse et de l’instabilité génétique. De façon paradoxale, les cellules déficientes pour TP53INP1 présentent une sensibilité accrue à l’apoptose induite par un stress indépendant ou non de p53. Cette sensibilité se base probablement sur un fort défaut de l’autophagie dans ces cellules. Nous observons également une diminution du taux des petites molécules antioxydantes liée au stress oxydatif constitutif observé dans ces souris. Les défauts observés en absence de TP53INP1 sont corrigés par un traitement avec un antioxydant, le N-Acetylcystéine, ce qui démontre le lien entre le rôle suppresseur de tumeur de TP53INP1 et son implication dans le contrôle du stress oxydatif. Ce travail a permis de mieux comprendre le rôle antioxydant TP53INP1 en lien avec sa fonction de suppresseur de tumeur. / Our laboratory has characterized TP53INP1 as a key gene in cell stress response. Target of p53, TP53INP1 is ubiquitously expressed and strongly induced during various stress-inducing treatments in vivo and in vitro. Its ectopic overexpression induces cell cycle arrest and cell death. We have shown that the expression of TP53INP1 is lost in many human cancers and that its re-expression in cancer cells inhibits tumor growth. In addition, TP53INP1-deficient mice are highly susceptible to induced tumors and show a permanent oxidative stress characterized by increased ROS levels. Taken together, these results indicate that TP53INP1 has a tumor suppressor function likely related to its involvement in the regulation of cellular redox status. The purpose of my PhD is to decipher the cellular and molecular function of TP53INP1 by exploiting the model of deficient mice. My work shows that the absence of TP53INP1 affects all biological processes deregulated in tumorigenesis. Indeed, the loss of TP53INP1 is characterized by an increase in cell proliferation, cell migration, angiogenesis and genetic instability. Paradoxically, TP53INP1-deficient cells have increased susceptibility to stress-induced apoptosis, independently or not of p53. This sensitivity is probably based on a strong impairment of autophagy in these cells. We also observed a decrease in the rate of small antioxidant molecules related to constitutive oxidative stress in these mice. The defects observed in the absence of TP53INP1 are corrected by treatment with an antioxidant, N-acetylcysteine, demonstrating the link between the role of TP53INP1 in tumor suppression and its involvement in redox control. This work has led to a better understanding of the antioxidant role of TP53INP1 linked to its function as a tumor suppressor.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif lié à l’acquisition d’une anomalie chromosomique t(9;22) conduisant à l’expression d’une protéine de fusion p210 Bcr-Abl dont l’activité tyrosine kinase dérégulée est nécessaire et suffisante pour engendrer la maladie.Cette pathologie bénéficie depuis 2002 d’une avancée thérapeutique : les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK). Cette thérapeutique dite ciblée, dont le chef de file est l’imatinib, est très efficace puisque 80% des patients entre en rémission. Malheureusement, 20% des patients traités développent des résistances primaires ou secondaires, dépendantes ou non de l’oncogène Bcr-Abl dont certaines ont été caractérisées. A ce titre, la LMC est devenue un modèle d’étude à la fois des mécanismes oncogéniques mais aussi des résistances.La résistance aux ITK dans la LMC peut être considérée sur deux plans. D’une part la résistance qui permet à la cellule leucémique d’échapper à la pression thérapeutique des ITK et d’autre part la résistance « intrinsèque » de la cellule souche leucémique par des mécanismes certainement multiples. Ce second niveau de résistance est à l’origine de la récurrence de la LMC lors de l’arrêt du traitement.Cette thèse a consisté à déterminer comment pouvait mourir les cellules de LMC en réponse aux ITK pour mettre en évidence les morts induites et les régulations qui existent entre-elles. De plus, cela a permis d’utiliser les morts non-apoptotiques pour contourner les mécanismes de résistance aux ITK.Nous avons montré pour la première fois en utilisant différents modèles cellulaires de LMC (cellules K562, Lama-84 et AR-230), que l’imatinib (ainsi que les autres ITK nilotinib et dasatinib) induit de la sénescence en plus d’une réponse apoptotique. En absence d’apoptose, par inhibition de cette dernière, la réponse sénescente devient une réponse majeure des cellules de LMC suggérant que l’apoptose a un rôle de « frein » sur la sénescence. L’autophagie activée par les ITK régule négativement la réponse apoptotique alors qu’elle est nécessaire pour une réponse sénescente majeure. Nous avons pu mettre en évidence deux types de sénescences induites par l’imatinib : une sénescence dépendante et une indépendante de l’autophagie. L’autophagie semble donc au cœur de la régulation des morts cellulaires. Puisque les cellules de LMC peuvent mourir par des morts non-apoptotiques, nous avons cherché à éliminer les cellules résistantes par des morts non-apoptotiques. Pour cela différentes molécules ont été utilisées telles que l’acide mycophénolique (MPA), un immunosuppresseur déjà utilisé en clinique. Le MPA en inhibant la synthèse de GTP permet d’induire des dommages à l’ADN et une réponse apoptotique et/ou sénescente. Dans ce contexte, l’autophagie protège la cellule de la réponse apoptotique mais ne protège pas la cellule de la sénescence. Le MPA est au contraire un puissant inducteur d’apoptose sur les cellules primaires. En effet, il induit une apoptose massive des cellules primaires résistantes aux ITK quelque soit le mécanisme impliqué (surexpression de tyrosine kinase, mutation de Bcr-Abl). Le MPA est l’exemple parfait des molécules qu’il nous faut rechercher pour éliminer les cellules résistantes de LMC notamment dans le cas où les patients sont en crise blastique et donc résistants aux thérapeutiques.Ces résultats suggèrent que la sénescence est une des morts qui peut être induite pour dépasser la résistance des cellules cancéreuses. / Chronic Myeloid Leukemia is a myeloproliferative syndrome connected to the acquisition of a chromosomal abnormality t(9;22) leading to the expression of a fusion protein p210 Bcr-Abl of whom the tyrosine kinase activity deregulated is necessary and sufficient to engender the disease.This pathology benefits since 2002 of a therapeutic advance: the tyrosine kinase inhibitors (TKI). This targeted therapeutics, from which imatinib is the front-line, is very effective because 80 % of patients enters in remission. However, 20 % of the treated patients develop primary or secondary resistances which can be dependent or not to the Bcr-Abl oncogene among which some have been characterized. Indeed, CML is now a model to study both oncogenic and resistances mechanisms.Resistance to TKI in CML can be considered on two sides. On one hand the resistance allowing the leukemic cell to escape the therapeutic pressure of TKI and on a second hand the “intrinsic” resistance of Leukemic stem cells by multiple mechanisms. This second level of resistance is at the origin of the CML recurrence.This thesis consisted in determining how could die the CML cells in response to TKI to bring to light cell deaths induced and the regulations existing between them. Furthermore, it allowed exploring the use of non-apoptotic cell deaths to overcome resistance to TKI.We showed for the first time by using CML cell lines (K562, Lama-84 and AR-230), that imatinib (as well as nilotinib and dasatinib) induced senescence besides an apoptotic response. In absence of apoptosis, by its inhibition, senescence becomes a major response of CML cells suggesting that apoptosis is limiting senescence. Autophagy activated by TKI negatively regulates apoptosis while it is necessary for a major senescent response. We were able to bring to light two types of senescence in response to TKI : a senescence dependent and a senescence independent of autophagy suggesting it plays a critical role in cell death regulation.Because CML cells can die by non-apoptotic cell deaths, we used them to eliminate TKI resistant cells. Mycophenolic acid (MPA), an immonusuppressor already used in therapeutic as an immunosuppressive agent has been extensively used. MPA by inhibiting the synthesis of GTP induces DNA damage and apoptotic and\or senescent response. In this context, autophagy protects the cells from apoptotic response but do not from senescence. Conversely, MPA is a powerful inductor of apoptosis on hematopoietic primary cells. Indeed, it induces apoptosis of TKI resistant primary cells whatever the mechanism involved (overexpression of tyrosine kinases or mutation of Bcr-Abl). MPA illustrates the need to look for new molecules to eliminate TKI resistant CML cells, particularly when patients are in the evolved blastic phase of the disease.These results suggest that senescence is one of the deaths which can be used to overcome resistance of cancer cells.

Le virus influenza a (via) est responsable d'epidemies annuelles et de pandemies sporadiques. un element clef, impactant a la fois la replication du virus et les symptomes de l'hote, est la reponse immunitaire innee. le via perturbe les voies metaboliques des cellules infectees, notamment la macroautophagie. la macroautophagie, par la suite appelee simplement autophagie, est une voie du catabolisme cellulaire. l'autophagie est constitutive dans les cellules nucleees et participe au maintien de l'homeostasie cellulaire. en reponse a un stress cellulaire, l'autophagie peut etre stimulee. un grand nombre de virus perturbe l'autophagie, soit en la stimulant, soit en l'inhibant. le via induit l'autophagie mais inhibe sa phase finale, un mecanisme impliquant sa proteine de matrice 2 (m2). les impacts de cette perturbation de l'autophagie sur la replication virale et sur la reponse de la cellule hote sont encore peu compris. au cours de ma these, j'ai developpe des modeles cellulaires dans lesquels la capacite d'autophagie peut etre specifiquement restauree dans des lignees cellulaires autrement incapables d'autophagie. l'utilisation de ces modeles m'a permis de montrer que l'autophagie ne change ni l'infectiosite du virus ni si capacite de replication intracellulaire mais inhibe l'induction de l'interferon-β et des genes induits par celui-ci. j'ai mis en evidence que m2 n'inhibe la phase finale de l'autophagie que dans le cadre de l'infection et de l'activation de l'apoptose. une meilleure comprehension des perturbations de l'autophagie pourrait permettre de developper des molecules antivirales et de nouveau virus attenues induisant une plus forte reponse immunitaire. / Influenza a virus (iav) is responsible for yearly epidemics and sporadic pandemics. understanding the mechanism by which the inflammatory response is mounted and controlled is key to manage the disease. iav perturbs a variety of metabolic pathways including macroautophagy. macroautophagy, hereafter referred to as autophagy, is a catabolic pathway that is active in all nucleated cells. in stress condition, autophagic activity can be increased. a variety of viruses perturb autophagy. iav has been described to both induce autophagy and block its completion mainly through its matrix protein 2 (m2). however, the impact of such perturbation on viral replication and host cell response to infection is still unknown. i developed cellular models in which autophagy capacity can be specifically restored in cell lines that are otherwise autophagy-incompetent. using these models, i showed that autophagy does not impact iav infection and replication but inhibits interferon-β induction at early stages post infection, leading to dampened induction of interferon-stimulated genes. i showed that m2 does not prevent autophagy completion by itself but only in the context of iav in a caspase-activation dependent fashion. in summary, my thesis work, using these novel autophagy models, revealed that early autophagy induction post-iav infection inhibits ifn-β, leading to a global decrease in interferon stimulated gene expression. indeed, sustained autophagy perturbation through m2 may allow iav to limit the ifn-β response throughout its life cycle. preventing m2-mediated autophagy perturbation may allow us to develop new antiviral strategies as well as new live attenuated iav vaccines.

L’autophagie est un mécanisme de l’immunité innée contre le VIH-1 déclenché très rapidement dans les cellules T CD4 par les protéines d’enveloppe du virus (Env). Dans les cellules T CD4 appelées « bystander », c’est-à-dire où l’infection est abortive, l’autophagie entraine l’apoptose. Dans les cellules T CD4 infectées de façon productive, l’autophagie est inhibée, empêchant ainsi à la fois la dégradation du virus et/ou des protéines virales et l’apoptose médiée par Env. Le but de cette étude de doctorat est de comprendre comment l’autophagie est bloquée dans les cellules T CD4 infectées par le VIH-1. Durant la première année de ma thèse, j’ai contribué au travail montrant que Vif nouvellement synthétisé bloque l’autophagie dans les lymphocytes T CD4 infectés. Les données ont été publiées en Janvier 2015 dans AIDS sous le titre «HIV-1 viral infectivity factor interacts with microtubule-associated protein light chain 3 and inhibits autophagy». Ensuite, j’ai montré que Vpr contribue aussi à l’inhibition de l’autophagie. En effet, Vpr ectopique diminue grandement le nombre des autophagosomes présents dans les cellules T CD4 quand l’autophagie est induite par un inhibiteur de mTOR. De même, Vpr incorporé dans les virions diminue le nombre des autophagosomes présents dans les cellules T CD4 très rapidement après leur infection productive (4h et 8h). Dans le but de définir le mécanisme par lequel la protéine Vpr entraine ce blocage, j’ai fait des expériences de GST pull-down et j’ai identifié que Vpr interagit avec BNIP3, une protéine pro-autophagique. De plus, le niveau d’expression de BNIP3 est augmenté dans les cellules T CD4 après le contact avec Env, suggérant que BNIP3 pourrait être impliqué dans l’induction de l’autophagie médiée par l’Env. Vpr co-localise avec BNIP3 et Vpr incorporé dans les virions induit une diminution drastique du niveau d’expression de BNIP3 après 8 heures d’infection. En conclusion, j’ai montré qu’au moins deux protéines du VIH-1 sont séquentiellement impliquées dans l’inhibition de l’autophagie dans les cellules T CD4 infectées par le VIH-1, Vpr qui contrôle l’autophagie durant la phase précoce de l’infection, et Vif néo-synthétisé qui inhibe l’autophagie après la transcription du génome viral. La compréhension complète des mécanismes par lesquels le VIH-1 inhibe l’autophagie devrait à terme permettre l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce virus. / Autophagy is a potent anti-HIV-1 mechanism. It is triggered in CD4 T cells by the viral envelope (Env) upon HIV-1 entry. In bystander CD4 T cells, autophagy leads to apoptosis. In productively infected CD4 T cells, autophagy is inhibited, preventing thus HIV-1 virophagy and Env-mediated apoptosis. The aim of my PhD study was to understand how autophagy is blocked in the HIV-1-infected CD4 T cells. During the first year of my thesis, I contributed to the work demonstrating that Vif neosynthesized blocks autophagy in the infected CD4 T lymphocytes. The data were published in January 2015 in AIDS under the title “HIV-1 viral infectivity factor interacts with microtubule-associated protein light chain 3 and inhibits autophagy”. Then, I demonstrated that Vpr contributes also to the inhibition of autophagy. Indeed, both ectopic expression of Vpr and Vpr incorporated into the virions decrease the number of autophagosomes in CD4 T cells when autophagy is induced by an inhibitor of mTOR and Env, respectively. To define the mechanism by which HIV-1 Vpr inhibits autophagy, I performed GST pull-down experiments and identified that Vpr interacts with BNIP3, a pro-autophagic protein. Importantly, BNIP3 expression level is increased in CD4 T cells upon Env contact, suggesting that BNIP3 could be responsible for the Env-mediated induction of autophagy. Furthermore, Vpr co-localizes with BNIP3 and viral incorporated Vpr decreases BNIP3 levels after 8 hours of infection. In conclusion, I demonstrated that at least two HIV-1 proteins are sequentially involved in the inhibition of autophagy in HIV-1-infected CD4 T cells, Vpr that controls autophagy during the early phase of infection, and then neo-synthesized Vif that inhibits autophagy after HIV-1 genome transcription. The complete understanding of the mechanisms by which HIV-1 inhibits autophagy should lead to the rising of new molecular strategies to fight against this virus.

Leishmania est un protozoaire parasite de l’ordre de Kinétoplastida de la famille des Trypanosomatidés, agent pathogène des leishmanioses. Au cours de cette thèse nous nous sommes intéressés à l’apoptose chez L. major. Bien que ce processus soit phénotypiquement identique à l’apoptose des mammifères, les protéines clés et les voies métaboliques impliquées restent largement inconnues. L’autophagie étant paradoxalement étroitement liée à l’apoptose, nous nous sommes également intéressés à ce processus de survie cellulaire. La première partie de ce travail a permis de décrire le phénotype autophagique et de montrer qu’apoptose et autophagie sont deux processus distincts mais également en lien étroit. Dans la deuxième partie, nous nous sommes focalisés sur la métacaspase de L. major LmjMCA. Nous avons observé un rôle de LmjMCA similaire à celui des caspases humaines au cours de l’apoptose, en lien avec son domaine catalytique. Nous avons montré que la surexpression de LmjMCA induit l’entrée en autophagie des cellules. Enfin, la troisième partie de ce travail s’est concentrée sur l’étude du cytosquelette. Nous avons ainsi pu établir un lien entre (dé)glutamylation, apoptose et autophagie. Nous avons mis en évidence que la polyglutamylation du cytosquelette, entraîne l’entrée en apoptose des cellules tandis que la déglutamylation du cytosquelette est associée au processus de survie cellulaire. Ce travail a permis de mieux caractériser les processus d’autophagie et d’apoptose chez Leishmania. Ces résultats permettent d’ouvrir des perspectives dans le développement de nouveaux outils thérapeutiques. / Leishmania is a protozoan parasite of the Kinetoplastida order and the Trypansomatid family and is the causative agent of leishmaniasis. In this thesis we focused on apoptosis in L. major. Although this process is phenotypically similar to mammal apoptosis, key proteins and metabolic pathways involved remain largely unknown. Autophagy being paradoxically closely linked to apoptosis, we were also interested in this cell survival process and its relationship with programmed cell death. The first part of this thesis has described the phenotypical changes during autophagy and shown that apoptosis and autophagy are two separate processes, but there is also a close relationship between these two mechanisms. In the second part of this thesis, we have demonstrated that LmjMCA has a role similar to the one of human caspases during apoptosis, through its catalytic domain. In addition, we have shown that LmjMCA overexpression induces autophagy entry after nutrient deprivation via its C-terminal domain.The third part of this work has focused on the study of the cytoskeleton. We could establish a link between (de)glutamylation, apoptosis and autophagy. Indeed, we have shown that cytoskeleton polyglutamylation induces cell death while cytoskeleton deglutamylation is associated with the cell survival process autophagy. This thesis allowed us to better characterize the autophagy and apoptosis processes in Leishmania and to identify the metacaspase as involved in the corresponding pathways. These results open perspectives in the development of new therapeutic tools.

L'obésité se caractérise par une accumulation excessive de masse grasse ainsi qu'un état inflammatoire chronique évoluant à bas bruit. Parmi les processus biologiques susceptibles de contribuer aux altérations méta-inflammatoires caractéristiques de l'obésité, nous étudions l'autophagie. Les données, relatives à la première étude, indiquent une diminution de l'activité autophagique adipocytaire des sujets obèses comparée aux sujets non-obèses. Les analyses transcriptomiques du laboratoire indiquent une forte diminution de l'expression du gène codant la Death Associated Protein Kinase 2 (DAPK2), chez les sujets obèses. De façon intéressante, l'inhibition de cette kinase induit une diminution de l'activité autophagique tandis qu'une surexpression augmente le processus dans des lignées adipocytaires. Nous observons également une restauration partielle et concomitante de l'activité autophagique et de l'expression génique de DAPK2 après perte de poids induite par chirurgie bariatrique chez les sujets obèses. L'ensemble de ces données montre un lien entre l'expression de DAPK2 et l'activité autophagique dans les adipocytes. La seconde étude est focalisée sur la lipase lysosomale (LIPA).. L'analyse de la topologie de son expression au cours de l'obésité n'indique pas de modulation d'expression génique. Néanmoins, une corrélation inverse entre l'adiposité et l'expression de la lipase lyosomale a été mise en évidence, suggérant un lien avec le stockage de lipides dans un contexte physiopathologique. Globalement, nos travaux indiquent des altérations adipocytaires du système lysosomal-autophagique, au cours de l'obésité. / Obesity is characterized by excessive accumulation of body fat and a chronic inflammatory condition evolving low noise. In this context, storage and nutritional metabolic sensing represent a real challenge to systemic and cellular level. Among the biological processes that may contribute to alterations meta-inflammatory characteristics of obesity, we are studying autophagy. This lysosomal process, related to nutritional flow as well as the regulation of pro-inflammatory signaling, allows the degradation dysfunctional organelles.The data relating to the first study indicate a decrease in adipocyte autophagic activity in obese subjects compared to non-obese subjects, and an inverse correlation between adipocyte hypertrophy and autophagic activity, suggesting a link with the lipid storage. The laboratory transcriptomic analyzes indicate a strong decrease in the expression of the gene encoding the Death Associated Protein Kinase 2 (DAPK2), in obese subjects. Interestingly, inhibition of this kinase induces a reduction of autophagic activity while overexpression increases the process of adipocyte cell lines. We also observe a partial and concomitant restoration of autophagic activity and gene expression after DAPK2 weight loss induced by bariatric surgery in obese subjects, strengthening the role of this kinase in regulating autophagy and adipocyte homeostasis. All these data show a link between the expression of DAPK2 and autophagic activity in adipocytes, suggesting that a lack of regulation of this kinase activity could help adipocyte dysfunction observed in obesity . The second study focused on the lysosomal lipase (LIPA). This protein, located at the interface of the immunological and metabolic regulation, participates in the catabolism of lipids. The analysis of the topology of its expression during obesity does not indicate a modulation of gene expression. However, an inverse correlation between adiposity and the expression of lyosomale lipase was demonstrated, suggesting a link with the storage of lipids in a pathophysiologic context. Overall, our work indicates adipocyte alterations of lysosomal-autophagic system during obesity. This type of alteration is present in several tissues, pharmacological approach could thus be envisaged in a systemic therapeutic context.