A partir de amostras de campo de diferentes regiões do país, o TCoV foi identificado em aves de 13-84 dias, em órgãos como intestino, rins e traqueia, por uma reação em cadeia pela polimerase para a região 3\' UTR e o gene 3. A presença deste coronavírus nesses diferentes órgãos, que não o intestino, sugere a presença de uma diferente estirpe, com características fenotípicas mais próximas em relação ao vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG), o IBV. Ao mesmo tempo, um perfil considerando a idade das aves positivas foi desenhado por um teste T de duas amostras, que mostrou maior positividade em aves mais jovens. Com a finalidade de desenvolver um novo ensaio de PCR, várias sequências do TCoV disponíveis no GenBank foram alinhadas, um segmento gênico foi desenhado e submetido a diferentes condições de reação. Um fragmento de 436 pb foi obtido, sequenciado e apresentou 100% de identidade quando sua sequência foi comparada a sequência completa do TCoV. A reação mostrou boa repetibilidade, bem como boa reprodutibilidade, e algumas amostras de campo não se apresentaram positivas. / TCOV was identified from field samples of birds with 13-84 days, from different regions of the country, and from organs such as intestine, kidneys and trachea, by polymerase chain reaction for 3\' UTR region and gene 3. The presence of this coronavirus in these different organs, not intestine, suggest a different strain, with similar phenotype observed in Infectious Bronchitis Virus (IBV). At the same time, a profile considering age of positive birds was designed by a Two sample T-test, which showed higher positivity in younger poults. Several TCOV sequences obtained from GenBank were aligned, and a genic segment was designed and submitted to different conditions in reaction in pursuit to develop a new PCR assay. A 436bp fragment was obtained, sequenced and presented 100% ID when compared to a TCOV complete sequence. The reaction featured good repetition, and reproduction as well, and some field samples did not turn out on positive results.

A partir de amostras de campo de diferentes regiões do país, o TCoV foi identificado em aves de 13-84 dias, em órgãos como intestino, rins e traqueia, por uma reação em cadeia pela polimerase para a região 3\' UTR e o gene 3. A presença deste coronavírus nesses diferentes órgãos, que não o intestino, sugere a presença de uma diferente estirpe, com características fenotípicas mais próximas em relação ao vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG), o IBV. Ao mesmo tempo, um perfil considerando a idade das aves positivas foi desenhado por um teste T de duas amostras, que mostrou maior positividade em aves mais jovens. Com a finalidade de desenvolver um novo ensaio de PCR, várias sequências do TCoV disponíveis no GenBank foram alinhadas, um segmento gênico foi desenhado e submetido a diferentes condições de reação. Um fragmento de 436 pb foi obtido, sequenciado e apresentou 100% de identidade quando sua sequência foi comparada a sequência completa do TCoV. A reação mostrou boa repetibilidade, bem como boa reprodutibilidade, e algumas amostras de campo não se apresentaram positivas. / TCOV was identified from field samples of birds with 13-84 days, from different regions of the country, and from organs such as intestine, kidneys and trachea, by polymerase chain reaction for 3\' UTR region and gene 3. The presence of this coronavirus in these different organs, not intestine, suggest a different strain, with similar phenotype observed in Infectious Bronchitis Virus (IBV). At the same time, a profile considering age of positive birds was designed by a Two sample T-test, which showed higher positivity in younger poults. Several TCOV sequences obtained from GenBank were aligned, and a genic segment was designed and submitted to different conditions in reaction in pursuit to develop a new PCR assay. A 436bp fragment was obtained, sequenced and presented 100% ID when compared to a TCOV complete sequence. The reaction featured good repetition, and reproduction as well, and some field samples did not turn out on positive results.

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Clarice Weins Arns / Banca: Adolorata Aparecida Bianco Carvalho / Resumo: A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença infecciosa que está amplamente disseminada entre as criações avícolas brasileiras e é uma das enfermidades virais que mais têm causado perdas econômicas na atualidade. Portanto, a rápida detecção e identificação do agente causal são imprescindíveis para que medidas eficazes de controle sejam prontamente tomadas. Para tanto, é necessário que os métodos de diagnóstico empregados sejam sensíveis, específicos, rápidos e também de baixo custo. Nesse contexto, a técnica de RTPCR em tempo real abordada no presente estudo permitiu a amplificação de duas regiões de hipervariabilidade do gene S1 de 17 estirpes diferentes do vírus da BIG (VBI), que foram testadas, mas não foi capaz de amplificar nenhum dos RNAvírus heterólogos analisados (vírus da doença de Newcastle, pneumovírus aviário e vírus da doença de Gumboro). Com essa mesma técnica foi possível fazer a diferenciação em grupos geneticamente distintos, de estirpes do VBI através de análises das curvas de dissociação de fragmentos amplificados a partir das regiões de hipervariabilidade gênica I e II do gene S1. A RT-PCR em tempo real desenvolvida apresentou maior sensibilidade na detecção do VBI em amostras teciduais, quando comparada à técnica padrão de Isolamento Viral em ovos embrionados de galinha... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The avian infectious bronchitis virus (IBV) is an infectious disease widely spread in Brazilian commercial poultries where causes significant economical losses. Rapid and accurate diagnosis of the IBV strain involved in a field outbreak is necessary to establish an effective control of this disease. The real-time RT-PCR performed in this study to amplify two hypervariable regions of S1 gene, was able to detect 17 IBV strains, e.g., nine reference strains (including Massachussets, Connecticut, JMK, SE 17 and Iowa serotypes) and eight Brazilian field isolates, whilst non-related avian viral pathogens such as Newcastle disease virus, Avian Pneumovirus and Gumboro disease virus were not detected. The differentiation between IBV strains was accomplished using the melting curve analysis of the amplified fragments corresponding to the hypervariable regions I and II of S1 gene. The real-time RT-PCR developed here showed a higher rate of IBV detection in tissue samples of experimentally infected chickens, when compared to the goldstandard technique of Viral Isolation in embryonated chicken eggs, and the same rate of detection was found for the conventional RT-PCR... (Complete abstract, click electronic access below) / Mestre

En médecine humaine et vétérinaire, les agents pathogènes représentent la cause de mortalité principale à travers la planète. Les méthodes de diagnostic de ces pathogènes ont considérablement changé et évolué particulièrement depuis l’apparition du séquençage haut débit. Les nouvelles méthodes de séquençage massif ont considérablement diminué le prix d’une séquence permettant de rendre accessible cette technologie révolutionnaire. Dans le cadre de mes travaux de thèse, nous avons mis en place un protocole pour l’utilisation du séquençage Illumina® (avec le séquenceur MiSeq) comme méthode de diagnostic lors de différents cas pathologiques aviaires. L’utilisation de cette méthode nous a permis dans un premier temps d’identifier l’agent étiologique de la maladie foudroyante de la pintade. Cette étude nous a permis de valider l’utilisation de ce genre de méthode pour des cas ciblés, ici lors d’un épisode clinique particulier n’impliquant vraisemblablement qu’un seul candidat pathogène. Ce nouveau coronavirus a fait l’objet d’études complémentaires afin de le caractériser. Nous avons élargis les cibles recherchées en analysant dans un deuxième temps l’ensemble des virus ARN chez le canard lors d’épisodes cliniques respiratoires et/ou de chute de ponte. L’analyse des données a mis en évidence une importante diversité virale et a permis d’identifier des candidats responsables potentiels. L’ensemble des résultats obtenus nous permet de valider l’utilisation du séquençage à haut débit comme un outil puissant de diagnostic. / Infectious diseases are considered the most prevalent cause of mortality in humans as well as other animals worldwide. Since the advent of high throughput sequencing technologies, diagnostic methods for these conditions have quickly changed and evolved, as the continuously decreasing cost of mass sequencing is making this tool available to larger numbers of people. As part of my thesis project, an Illumina®-based sequencing method (on a MiSeq machine) was designed for diagnostic purposes in clinical cases in poultry. We first used this method to identify the causative agent of the fulminating disease of guinea fowl. This validated the use of our protocol to identify the pathogenic infectious agent behind a specific condition. This newly identified Coronavirus was further analysed and characterised. In a second study we used an unbiased mass sequencing approach to describe the RNA virus populations present in the duck respiratory tract during clinical episodes (respiratory illness or egg drops). Data showed an important viral diversity and we identified some candidate pathogens. Taken together, these results validate the use of high throughput sequencing as a powerful diagnostic tool.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:57:05Z : No. of bitstreams: 1 okino_ch_me_jabo.pdf: 1181305 bytes, checksum: cf91a5205aface873e536d06ccd0eb78 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença infecciosa que está amplamente disseminada entre as criações avícolas brasileiras e é uma das enfermidades virais que mais têm causado perdas econômicas na atualidade. Portanto, a rápida detecção e identificação do agente causal são imprescindíveis para que medidas eficazes de controle sejam prontamente tomadas. Para tanto, é necessário que os métodos de diagnóstico empregados sejam sensíveis, específicos, rápidos e também de baixo custo. Nesse contexto, a técnica de RTPCR em tempo real abordada no presente estudo permitiu a amplificação de duas regiões de hipervariabilidade do gene S1 de 17 estirpes diferentes do vírus da BIG (VBI), que foram testadas, mas não foi capaz de amplificar nenhum dos RNAvírus heterólogos analisados (vírus da doença de Newcastle, pneumovírus aviário e vírus da doença de Gumboro). Com essa mesma técnica foi possível fazer a diferenciação em grupos geneticamente distintos, de estirpes do VBI através de análises das curvas de dissociação de fragmentos amplificados a partir das regiões de hipervariabilidade gênica I e II do gene S1. A RT-PCR em tempo real desenvolvida apresentou maior sensibilidade na detecção do VBI em amostras teciduais, quando comparada à técnica padrão de Isolamento Viral em ovos embrionados de galinha... / The avian infectious bronchitis virus (IBV) is an infectious disease widely spread in Brazilian commercial poultries where causes significant economical losses. Rapid and accurate diagnosis of the IBV strain involved in a field outbreak is necessary to establish an effective control of this disease. The real-time RT-PCR performed in this study to amplify two hypervariable regions of S1 gene, was able to detect 17 IBV strains, e.g., nine reference strains (including Massachussets, Connecticut, JMK, SE 17 and Iowa serotypes) and eight Brazilian field isolates, whilst non-related avian viral pathogens such as Newcastle disease virus, Avian Pneumovirus and Gumboro disease virus were not detected. The differentiation between IBV strains was accomplished using the melting curve analysis of the amplified fragments corresponding to the hypervariable regions I and II of S1 gene. The real-time RT-PCR developed here showed a higher rate of IBV detection in tissue samples of experimentally infected chickens, when compared to the goldstandard technique of Viral Isolation in embryonated chicken eggs, and the same rate of detection was found for the conventional RT-PCR... (Complete abstract, click electronic access below)