A superfamília PII de proteínas de transdução de sinal é conhecida por conter as proteínas sinalizadoras mais amplamente distribuídas na natureza, sendo ubíquas entre bactérias. Elas desempenham um papel chave na coordenação da regulação de processos metabólicos centrais, especialmente aqueles relacionados ao metabolismo de nitrogênio. As proteínas PII atuam por interação direta com uma variedade de alvos celulares, tais como fatores transcricionais, enzimas e transportadores, resultando na modulação da atividade desses receptores. A sinalização realizada por PII apresenta o potencial de responder a três sinais metabólicos: o sinal de energia ATP, o sinal de carbono 2- oxoglutarato e o sinal de nitrogênio glutamina. Os dois primeiros são transmitidos diretamente pela ligação das moléculas efetoras, enquanto que os níveis de nitrogênio são refletidos pela uridilação reversível de PII pela enzima GlnD, em condições de deficiência de nitrogênio. Em microrganismos diazotróficos, o papel das proteínas PII é estendido para o controle do processo de fixação de nitrogênio. O gênero Azospirillum é composto de diazotróficos de vida livre capazes de se associar de forma benéfica com diversas gramíneas, como por exemplo, cana-de-açúcar e arroz. Com o objetivo de analisar os sistemas regulatórios do metabolismo e da fixação de nitrogênio no modelo de estudo Azospirillum amazonense, foi proposta uma investigação da função das proteínas PII nessas vias. Os alvos celulares dos parálogos de PII presentes em A. amazonense – chamados de GlnB e GlnK – foram investigados utilizando experimentos de pull-down. Dois extratos de A. amazonense foram testados, referindo-se a condições de crescimento em abundância e limitação de nitrogênio. Ao todo, 42 prováveis proteínas de interação das formas não modificadas das duas proteínas PII foram identificadas por espectrometria de massas em tandem, no entanto as interações mapeadas devem ser confirmadas por métodos alternativos. Entre as proteínas isoladas, destaca-se a presença de 10 fatores transcricionais. Esses podem representar pontos de conexão com outros sistemas regulatórios, tais como o sistema de controle do conteúdo celular de exopolissacarídeos e o sistema de controle redox de processos energéticos. Além desses reguladores, nossos resultados incluem 2 proteínas envolvidas no metabolismo de metais, 2 transportadores, 12 enzimas metabólicas, 7 proteínas de funções basais e 9 proteínas de função desconhecida. / The PII superfamily of signal transduction proteins is known to contain the most widely distributed signaling proteins in nature, being ubiquitous among bacteria. They play a major role in coordinating the regulation of central metabolic processes, especially those related to nitrogen metabolism. PII proteins act by direct interaction with a variety of cellular targets, such as transcription factors, enzymes and transporters, resulting in modulation of receptor activities. PII signaling has the potential to respond to three central metabolic signals: the energy signal ATP, the carbon signal 2- oxoglutarate and the nitrogen signal glutamine. The first two are sensed directly by the binding of the effector molecules. The nitrogen levels are reflected by reversible uridylation of the PII by the glutamine-sensor enzyme GlnD, under nitrogen deficiency conditions. Thus, PII proteins serve as the central processing unit for the integration of antagonistic signals of carbon and nitrogen status, and use this information to control nitrogen assimilation. In diazotrophic microorganisms, PII proteins role is extended to the control of the nitrogen fixation process. The genus Azospirillum is composed of free-living diazotrophs capable of beneficial association with a variety of Graminae plants, such as sugarcane and rice. In order to appraise the regulatory systems of nitrogen fixation and metabolism in the model organism Azospirillum amazonense, an investigation of the PII proteins functions in these networks was proposed. The cellular targets of each of the PII paralogues found in A. amazonense – named GlnB and GlnK – were investigated by pull-down assays. Two protein extracts of A. amazonense were tested, referring to growth conditions of nitrogen limitation and sufficiency. Altogether, 42 potential interacting partners of the unmodified form of the two PII proteins were identified by LC-MS/MS, and these interactions are to be further confirmed by alternative methods. It is noteworthy that 10 transcriptional factors were isolated in our experiments. These factors may represent linking points for the cross-talk between nitrogen regulation and other regulatory systems, such as the control of exopolysaccharide biosynthesis and the redox control of energetic processes. Besides these transcriptional regulators, our results comprise 2 proteins related to heavy metals metabolism, 2 transporters, 12 metabolic enzymes, 7 housekeeping function proteins and 9 unknown function proteins.

A superfamília PII de proteínas de transdução de sinal é conhecida por conter as proteínas sinalizadoras mais amplamente distribuídas na natureza, sendo ubíquas entre bactérias. Elas desempenham um papel chave na coordenação da regulação de processos metabólicos centrais, especialmente aqueles relacionados ao metabolismo de nitrogênio. As proteínas PII atuam por interação direta com uma variedade de alvos celulares, tais como fatores transcricionais, enzimas e transportadores, resultando na modulação da atividade desses receptores. A sinalização realizada por PII apresenta o potencial de responder a três sinais metabólicos: o sinal de energia ATP, o sinal de carbono 2- oxoglutarato e o sinal de nitrogênio glutamina. Os dois primeiros são transmitidos diretamente pela ligação das moléculas efetoras, enquanto que os níveis de nitrogênio são refletidos pela uridilação reversível de PII pela enzima GlnD, em condições de deficiência de nitrogênio. Em microrganismos diazotróficos, o papel das proteínas PII é estendido para o controle do processo de fixação de nitrogênio. O gênero Azospirillum é composto de diazotróficos de vida livre capazes de se associar de forma benéfica com diversas gramíneas, como por exemplo, cana-de-açúcar e arroz. Com o objetivo de analisar os sistemas regulatórios do metabolismo e da fixação de nitrogênio no modelo de estudo Azospirillum amazonense, foi proposta uma investigação da função das proteínas PII nessas vias. Os alvos celulares dos parálogos de PII presentes em A. amazonense – chamados de GlnB e GlnK – foram investigados utilizando experimentos de pull-down. Dois extratos de A. amazonense foram testados, referindo-se a condições de crescimento em abundância e limitação de nitrogênio. Ao todo, 42 prováveis proteínas de interação das formas não modificadas das duas proteínas PII foram identificadas por espectrometria de massas em tandem, no entanto as interações mapeadas devem ser confirmadas por métodos alternativos. Entre as proteínas isoladas, destaca-se a presença de 10 fatores transcricionais. Esses podem representar pontos de conexão com outros sistemas regulatórios, tais como o sistema de controle do conteúdo celular de exopolissacarídeos e o sistema de controle redox de processos energéticos. Além desses reguladores, nossos resultados incluem 2 proteínas envolvidas no metabolismo de metais, 2 transportadores, 12 enzimas metabólicas, 7 proteínas de funções basais e 9 proteínas de função desconhecida. / The PII superfamily of signal transduction proteins is known to contain the most widely distributed signaling proteins in nature, being ubiquitous among bacteria. They play a major role in coordinating the regulation of central metabolic processes, especially those related to nitrogen metabolism. PII proteins act by direct interaction with a variety of cellular targets, such as transcription factors, enzymes and transporters, resulting in modulation of receptor activities. PII signaling has the potential to respond to three central metabolic signals: the energy signal ATP, the carbon signal 2- oxoglutarate and the nitrogen signal glutamine. The first two are sensed directly by the binding of the effector molecules. The nitrogen levels are reflected by reversible uridylation of the PII by the glutamine-sensor enzyme GlnD, under nitrogen deficiency conditions. Thus, PII proteins serve as the central processing unit for the integration of antagonistic signals of carbon and nitrogen status, and use this information to control nitrogen assimilation. In diazotrophic microorganisms, PII proteins role is extended to the control of the nitrogen fixation process. The genus Azospirillum is composed of free-living diazotrophs capable of beneficial association with a variety of Graminae plants, such as sugarcane and rice. In order to appraise the regulatory systems of nitrogen fixation and metabolism in the model organism Azospirillum amazonense, an investigation of the PII proteins functions in these networks was proposed. The cellular targets of each of the PII paralogues found in A. amazonense – named GlnB and GlnK – were investigated by pull-down assays. Two protein extracts of A. amazonense were tested, referring to growth conditions of nitrogen limitation and sufficiency. Altogether, 42 potential interacting partners of the unmodified form of the two PII proteins were identified by LC-MS/MS, and these interactions are to be further confirmed by alternative methods. It is noteworthy that 10 transcriptional factors were isolated in our experiments. These factors may represent linking points for the cross-talk between nitrogen regulation and other regulatory systems, such as the control of exopolysaccharide biosynthesis and the redox control of energetic processes. Besides these transcriptional regulators, our results comprise 2 proteins related to heavy metals metabolism, 2 transporters, 12 metabolic enzymes, 7 housekeeping function proteins and 9 unknown function proteins.

Orientador: Paulo Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T05:34:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jasmin_JanieMendes_M.pdf: 2910162 bytes, checksum: f576fb58dfccd764de6d4a05fd175d23 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: A fixação biológica de nitrogênio em gramíneas tem merecido atenção especial nos últimos anos e muitos estudos têm sido desenvolvidos visando uma melhor compreensão dos fatores que influenciam a relação planta-bactéria. No presente trabalho foram isoladas estirpes de Azospirillum brasilense e de Azospirillum lipoferum de raizes de teosinte e de milho. Foram identificadas 23 estirpes das duas espécies bacterianas. Essas estirpes foram caracterizadas quanto a sua resistência a antibióticos e produção de ácido indol-acético (AIA). Foi observada uma grande variabilidade, para ambas as caracteristicas, entre as diferentes estirpes analisadas. Os principais componentes indólicos encontrados em sobrenadantes de culturas de Azospirillun brasilense, crescidas em presença de 0.1 mg de triptofano por ml quando avaliados por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espectrometria de massa (MS) foram: indol-etanol (IEt), indol-metanol (IM) e icido indol-láctico (ILA). A análise dos indóis presentes em raízes de plântulas de milho, inoculadas e não inoculadas com Azospirillum, revelou como seus principais componentes indólicos o ácido indol-acético (AIA) e o ácido oxindol-acético AIA) e o ácido oxindol-acético (Ox AIA). Quando extratos de raízes de plântulas de milho, geneticamente diferentes, foram adicionados ao meio de crescimento de Azospiririllun, diferenças significativas foram observadas entre as curvas de crescimento obtidas com extratos do híbrido simples Fi 1227, da Secretaria de Agricultura do Estado de São Paulo e extratos de uma linhagem de Milho Americano. A inoculação de híbridos simples de milho, de diferentes origens genéticas com diferentes concentrações e estirpes de ª brasilense apresentou resultados de crescimento radicular significativamente contrastantes. As diferenças observadas parecem ser dependentes preponderantemente, do material vegetal usado não estando correlacionadas com a produção de AIA pelas bactérias. Quando os mesmos materiais vegetais foram crescidos na presença de triptofano e inoculados com Azospirillun, houve uma forte inibição do crescimento radicular de todas as plântulas. Resultados semelhantes foram observados quando AIA e triptofano + fenilalanina + tirosina + AIA estavam presentes no meio de crescimento das plântulas / Abstract: In recent years much attention has been given to the biological nitrogen fixation in grasses and cereal crops. Many studies have been carried out aiming at a better understanding of the plant-bacteria reIationship. The present paper deals with the isolation of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum strains from the roots of teonsinte and maize. Twenty-three strains were obtained. These strains were screened for antibiotics resistance and indol-acetic acid (IAA) production. A great variability for both characteristics was observed. Indol-ethanol (IEt), indol-methanol (IM) and indol-lactic acid (I LA) were the main indolic components detected in Azospirillum brasilense supernatants, when cells were grown with a 0,1 mg/ml tryptophan supply, by high-pressure liquid cromatagraphy and mass spectrometry analysis. Maize roots both inoculated and non-inoculated with Azospirillum presented indol-acetic acid (IAA) and oxindol-acetic acid (Ox IAA) as their main indolic components. Maize seedling root extracts with different genetic backgrounds added to Azospirillum growth media affected the bacterial growth rate. The maize hybrid Fi 1227 extracts differed significatively from the extracts o, an American Maize Inbred Line. The results of the seedling root growth rates of maize hybrids with different genetic backgrounds inoculated with distinct strains of é brasilense contrasted significatively. The differences observed are indicative that a main role is performed by the plant material used without correlation to the bacterial IAA production. The addition of tryptophan to the growth media of plants in combination with Azospirillum inoculation caused a severe inhibition of radicular growth. Similar results were observed in the presence of IAA and also tryptophan+phenylalanine+tyrosine+IAA / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

A utilização massiva de fertilizantes químicos na agricultura tem efeitos perniciosos ao ambiente. As bactérias do gênero Azospirillum são amplamente estudadas, pois são capazes de promover o crescimento vegetal. Essa característica lhes confere potencial para serem utilizadas na agricultura como uma alternativa ecologicamente compatível. Embora a espécie Azospirillum amazonense seja menos conhecida, o estudo de sua biologia molecular poderia contribuir para a elucidação dos mecanismos envolvidos na promoção do crescimento vegetal. Na primeira parte deste trabalho, foram descritas ferramentas genéticas que podem facilitar o estudo da biologia molecular de A. amazonense. Métodos de conjugação e eletroporação foram otimizados utilizando vetores com origens de replicação de amplo espectro (pVS1 e pBBR1). Além disso, mutantes para o gene glnK foram gerados utilizando o sistema do vetor pK19MOBSACB. Finalmente, um protocolo de análise de promotores baseado na expressão de proteínas fluorescentes foi desenvolvido para permitir estudos de regulação gênica. Na segunda parte do trabalho, uma análise abrangente das características do draft do genoma de A. amazonense foi realizada. Essa espécie apresenta um repertório versátil de genes, crucial para seu modo de vida na rizosfera. Genes putativos relacionados com metabolismo de nitrogênio e de carbono, produção de energia, produção de fitormônio, transporte, quorum sensing, resistência a antibióticos, síntese de bacteriofitocromo, quimiotaxia e motilidade foram identificados. Os genes da fixação do nitrogênio e da nitrilase poderiam estar diretamente relacionados com a promoção do crescimento vegetal. A identificação de genes da RubisCO sugere que A. amazonense seja capaz de fixar carbono, característica do seu metabolismo antes desconhecida. Outro aspecto relevante é que alguns genes de A. amazonense, como os da nitrogenase e da RubisCO, são mais próximos filogeneticamente aos genes de membros da ordem Rhizobiales do que dos de espécies do mesmo gênero. / The massive use of chemical fertilizers in agriculture has harmful effects to the environment. Bacteria from the Azospirillum genus are widely studied, since they are able to promote plant growth. This feature gives them the potential to be used in agriculture as an ecologically compatible alternative. Although the Azospirillum amazonense is a lesserknown species, the study of its molecular biology could contribute to a better understanding of the mechanisms implicated in plant growth. In the first part of this study, genetic tools that can support the study of the molecular biology of A. amazonense were described. Conjugation and electrotransformation methods were established utilizing vectors with broad host-replication origins (pVS1 and pBBR1). Furthermore, glnK-specific A. amazonense mutants were generated utilizing the pK19MOBSACB vector system. Finally, a promoter analysis protocol based on fluorescent protein expression was optimized to aid genetic regulation studies on this bacterium. In the second part of this study a comprehensive analysis of the genomic features of this species was presented. The species A. amazonense presents a versatile repertoire of genes crucial for its plant-associated lifestyle. Genes of A. amazonense related to nitrogen/carbon metabolism, energy production, phytohormone production, transport, quorum sensing, antibiotic resistance, chemotaxis/motility and bacteriophytochrome biosynthesis were identified. Noteworthy genes were the nitrogen fixation genes and the nitrilase gene, which could be directly implicated in plant growth promotion, and the carbon fixation genes, which had previously been poorly investigated in this genus. One important finding was that some A. amazonense genes, like the nitrogenase genes and RubisCO genes, were closer phylogenetically to genes from Rhizobiales members than to those from species of its own order.

Several nitrogen fixers were isolated from the roots and rhizosphere of Quebec crops. Many of these nitrogen fixers were discarded when the production of N(,2)O in the presence of C(,2)H(,2), as a test for denitrifying ability, was included as a selected characteristic. Further characterization of the Nir('+) strains showed that they were Azospirillum lipoferum. / The cytochrome composition of Azospirillum brasilense (a denitrifier) grown under various conditions in a defined medium was investigated. Optical absorbance difference spectra of the particulate fraction of cells grown under aerated conditions indicated the presence of cytochromes of type b, c and a+a(,3). Under low aeration there was a quantitative increase in cytochromes b and c with a concomitant decrease in the a+a(,3)-type cytochrome. At high aeration, a CO spectrum indicated the possible participation of an o-type cytochrome. / At both high and low oxygen concentrations, the supernatant fraction revealed only one c-type cytochrome. Its abundance was increased at low oxygen concentrations. / Cytochrome spectra of anaerobically grown cells using different nitrogen oxides (NO(,3)('-), NO(,2)('-) and N(,2)O) as final electron acceptors revealed the presence of the different cytochromes involved in anaerobic respiration. The reduction of NO(,2)('-) was associated with the cytochrome cd (peak at 620 nm) found only in the supernatant fraction of NO(,2)('-)-grown cells. / Growth on NO(,3)('-) was characterized by a diauxic type of curve in which the first logarithmic phase corresponded to the reduction of NO(,3)('-). The second logarithmic phase corresponded to the reduction of NO(,2)('-). / Growth of Azospirillum brasilense with NO(,2)('-) and N(,2)O as final electron acceptor was possible only when a small amount of NO(,3)('-) was present initially. In contrast with other bacteria, growth of Azospirillum brasilense with tungstate instead of molybdate did not result in NO(,3)('-) reductase-deficient cells. / The NO(,2)('-) accumulation observed with NO(,3)('-)-grown cells possibly resulted from the different NO(,3)('-)- and N(,2)('-)-reductase specific activities. However, the longer lag in the NO(,2)('-) reduction when higher concentrations of NO(,3)('-) were used may be due to a direct effect of NO(,3)('-) on the synthesis or activity of the NO(,2)('-) reductase.

Hydrogen oxidation by Azospirillum brasilense Sp7 was studied in N(,2)-fixing and NH(,4)('+)-grown batch cultures. The K(,m) for H(,2) of O(,2)-dependent H('3)H oxidation in whole cells was 9 uM. The rates of H('3)H and H(,2) oxidation were very similar, indicating that the initial H(,2) activation step in the overall H(,2) oxidation reaction was not rate-limiting and that H('3)H oxidation was a valid measure of H(,2)-oxidation activity. Hydrogen-oxidation activity was inhibited irreversibly by air. In N-free cultures the O(,2) optima for O(,2)-dependent H(,2) oxidation, ranging from 0.5-1.25% O(,2) depending on the phase of growth, were significantly higher than those of C(,2)H(,2) reduction, 0.15-0.35%, suggesting that the H(,2)-oxidation system may have a limited ability to aid in the protection of nitrogenase against inactivation by O(,2). Oxygen-dependent H(,2) oxidation was inhibited by NO(,2)('-), NO, CO, and C(,2)H(,2) with apparent K(,i) values of 20, 0.4, 28, and 88 uM, respectively. These inhibitors also affected methylene blue-dependent H(,2) oxidation, presumably by acting on the hydrogenase directly. The CO inhibition was easily reversible; the NO(,2)('-) and NO inhibitions were irreversible; and the C(,2)H(,2) inhibition was not readily reversible. Hydrogen-oxidation activity was 50 to 100 times higher in denitrifying cultures when the terminal electron acceptor for growth was N(,2)O rather than NO(,3)('-), possibly due to the irreversible inhibition of hydrogenase by NO(,2)('-) and NO in NO(,3)('-)-grown cultures. THe expression of the H(,2)-oxidation system was independent of nitrogenase expression, did not require added H(,2) (and probably not endogenous H(,2)), was not affected by low concentrations of carbon substrates (less than 30 mM malate), and required low O(,2) concentrations (microaerobic or anaerobic conditions).

Bactérias do gênero Azospirillum possuem a capacidade de promover o crescimento vegetal através de mecanismos que não estão claramente elucidados. Contudo, essa característica é muito estudada, tendo em vista a possibilidade de utilizar esses microrganismos na agricultura em detrimento do uso indiscriminado de fertilizantes industriais, que poluem o meio ambiente. O solo é um ambiente altamente variável quanto à disponibilidade de nutrientes e quanto a fatores físico-químicos, por isso, bactérias que ocupam esse nicho possuem um aparato genético capaz de prover uma adaptação plena a este ambiente. A bactéria A. amazonense tem um genoma altamente complexo e pouco estudado. O presente trabalho isolou genes envolvidos na resposta de A. amazonense ao estresse por limitação nutricional de nitrogênio, elemento crucial para a sobrevivência, já que compõe diferentes moléculas biológicas. Um dos objetivos deste trabalho foi o isolamento de genes que codificam proteínas PII em A. amazonense, que estão envolvidas na regulação do metabolismo do nitrogênio. A. amazonense apresenta dois genes parálogos que codificam para proteínas PII, glnB e glnK. Demonstramos que ambos são regulados pela disponibilidade de nitrogênio no meio. A região promotora de glnK possui elementos típicos de genes regulados pelo sistema Ntr: quatro sítios de ligação ao fator de transcrição NtrC e um promotor dependente de σ54. Foi identificada uma seqüência que corresponde a um promotor dependente de σ70 putativo sobreposto a um sítio de ligação a NtrC. O segundo objetivo foi isolar genes regulados pela disponibilidade de nitrogênio através da técnica Micro-RDA. Essa técnica é muito sensível, no entanto há poucos relatos da sua utilização em bactérias, visto provavelmente as dificuldades técnicas do trabalho com o mRNA bacteriano. Através desse procedimento, foram isolados oito genes envolvidos na resposta à limitação de nitrogênio. Sete deles apresentam homologia com genes de bactérias da classe Proteobacteria: dnaK e rpoH (genes que codificam proteínas envolvidas em choque térmico), relA (envolvido na síntese de ppGpp, um mediador da resposta “estringente”), um gene que codifica para uma diguanilato ciclase/fosfodiesterase (envolvido na síntese de c-di-GMP, envolvido na formação de biofilmes), um gene que codifica uma subunidade do complexo I da cadeia transportadora de elétrons, glnA (glutamina sintetase) e gltB (glutamato sintase). A variedade funcional desses genes ilustra o grau de complexidade da resposta de A. amazonense à limitação nutricional de nitrogênio. / Bacteria belonging to the Azospirillum genus are capable of promoting plant growth, but the mechanisms implicated in this feature are not clearly elucidated. This ability has been investigated by several research groups with the main objective of substitute the use of industrialized fertilizers by bacteria inoculation in the soil. The soil is a very dynamic enviroment, so bacteria have developed many genetic resources to survive in this environment. Azospirillum amazonense has a very complex genome and up till now is poorly analysed. This work has isolated different genes implicated in the nitrogen starvation response of A. amazonense. In the first part of this work we investigated the PII coding genes of A. amazonense, that are involved in nitrogen metabolism regulation. A. amazonense has two PII genes, glnK and glnB. Both are regulated by the nitrogen availability in the medium. The glnK regulatory region has typical elements of Ntr regulated genes: four NtrC UAS sequences (upstream activator binding site) and one σ54-dependent promoter. A putative σ70-dependent promoter, that overlaps the NtrC UAS sequence has been found. In the second part of this work we isolated nitrogen regulated genes by the Micro-RDA technique. This tecnique is very sensitive, but there are few reports of its applicability on bacterial species. This occurs probably due to the bacterial mRNA features. In our work we isolated eight nitrogen regulated genes through the micro-RDA procedure and seven of them have shown similarity to proteobacteria genes. The isolated sequences correspond to: dnaK and rpoH genes (implicated in heat shock response), relA gene (involved in stringent response), a diguanylate cyclase/phosphodiesterase gene (implicated in biofilm formation), a complex I subunit gene (electrons transport chain), glnA gene (glutamine syntethase) and gltB gene (glutamate synthase). The functional variability of these genes illustrates the complexity of the nitrogen starvation response of A. amazonense.

Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes, amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas, que catalisam a hidrólise da ureia à amônia e a dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmeros formados por subunidades idênticas. Em bactérias, as ureases são formadas por duas ou três subunidades distintas, como é o caso em Helicobacter pylori e Azospirillum brasilense, respectivamente. As bactérias do gênero Azospirillum são microrganismos diazotróficos (capazes de fixar nitrogênio atmosférico), encontrados no solo e em associação com raízes de plantas como o arroz, o trigo e o milho. A principal função da urease em plantas parece estar relacionada à reciclagem do nitrogênio, mas diversas atividades biológicas que independem da atividade ureolítica têm sido demonstradas, sugerindo que esta possa estar envolvida na defesa da planta contra insetos e fungos. A fim de estudar esta enzima, a primeira parte do trabalho objetivou obter a urease recombinante de Azospirillum brasilense FP2. Para isso, o inserto foi clonado no vetor pET-23a por recombinação homóloga in vivo. Seis aminoácidos mostraram-se diferentes, em relação a sequência de proteínas predita do A. brasilense sp245, o que parece diferença entre as cepas de A. brasilense sp245 e FP2. A expressão da enzima recombinante foi otimizada, seguida de purificação feita por cromatografia de afinidade a níquel. No segundo capítulo desse trabalho é apresentada a clonagem, a expressão do gene e a purificação de um peptídeo derivado da urease ubíqua de soja. Esse peptídeo, denominado soyuretox, é colinear com o jaburetox, uma peptídeo recombinante derivado da urease de Canavalia ensiformis. Dados prévios do nosso laboratório demonstram diversas propriedades biológicas do jaburetox, tais como atividade inseticida, capacidade de interagir com bicamadas lipídicas, efeito fungitóxico, dentre outras. Estudos comparativos com o soyuretox mostraram que esse peptídeo apresenta toxicidade para duas leveduras testadas, Candida tropicalis e Saccharomyces cerevisiae. / Urease (urea amidohydrolase, EC 3.5.1.5) are nickel-dependent enzymes widely distributed in bacteria, fungi and plants which catalyze the hydrolysis of urea to ammonia and carbon dioxide. In plants and fungi, ureases are hexamers formed by one type of subunit. In bacteria, ureases are formed by two or three distinct subunits, such as in Helicobacter pylori and in Azospirillum brasilense, respectively. Bacteria of the genus Azospirillum are diazotrophic (capable of fixing atmospheric nitrogen), found in the soil and in association with roots of plants such as rice, wheat and corn. The main function of urease in plants appears to be related to nitrogen recycling, but several biological activities that are independent of ureolytic activity have been demonstrated, suggesting that it may be involved in the defense of plants against insects and fungi. In order to study this enzyme, the first part of the study aimed to obtain the recombinant Azospirillum brasilense FP2 urease. For this end, the insert was cloned into the vector pET-23a by in vivo homologous recombination. Six amino acids were different in relation to the predicted protein sequence of A. brasilense sp245, which seems to difference among strains of A. brasilense sp245 and FP2. Expression of the recombinant protein was optimized, following purification by nickel affinity chromatography. Cloning, expression of the gene and purification of a peptide derived from soybean ubiquitous urease is presented in the second chapter of this work. This peptide, called soyuretox, aligns with jaburetox, a recombinant peptide derived from Canavalia ensiformis urease. Previous data from our laboratory have shown diverse biological properties for jaburetox, such as insecticidal activity, ability to interact with lipid bilayers, fungitoxic effects, among others. Comparative studies with soyuretox, showed that this peptide presents toxicity against yeast, Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae.

A utilização massiva de fertilizantes químicos na agricultura tem efeitos perniciosos ao ambiente. As bactérias do gênero Azospirillum são amplamente estudadas, pois são capazes de promover o crescimento vegetal. Essa característica lhes confere potencial para serem utilizadas na agricultura como uma alternativa ecologicamente compatível. Embora a espécie Azospirillum amazonense seja menos conhecida, o estudo de sua biologia molecular poderia contribuir para a elucidação dos mecanismos envolvidos na promoção do crescimento vegetal. Na primeira parte deste trabalho, foram descritas ferramentas genéticas que podem facilitar o estudo da biologia molecular de A. amazonense. Métodos de conjugação e eletroporação foram otimizados utilizando vetores com origens de replicação de amplo espectro (pVS1 e pBBR1). Além disso, mutantes para o gene glnK foram gerados utilizando o sistema do vetor pK19MOBSACB. Finalmente, um protocolo de análise de promotores baseado na expressão de proteínas fluorescentes foi desenvolvido para permitir estudos de regulação gênica. Na segunda parte do trabalho, uma análise abrangente das características do draft do genoma de A. amazonense foi realizada. Essa espécie apresenta um repertório versátil de genes, crucial para seu modo de vida na rizosfera. Genes putativos relacionados com metabolismo de nitrogênio e de carbono, produção de energia, produção de fitormônio, transporte, quorum sensing, resistência a antibióticos, síntese de bacteriofitocromo, quimiotaxia e motilidade foram identificados. Os genes da fixação do nitrogênio e da nitrilase poderiam estar diretamente relacionados com a promoção do crescimento vegetal. A identificação de genes da RubisCO sugere que A. amazonense seja capaz de fixar carbono, característica do seu metabolismo antes desconhecida. Outro aspecto relevante é que alguns genes de A. amazonense, como os da nitrogenase e da RubisCO, são mais próximos filogeneticamente aos genes de membros da ordem Rhizobiales do que dos de espécies do mesmo gênero. / The massive use of chemical fertilizers in agriculture has harmful effects to the environment. Bacteria from the Azospirillum genus are widely studied, since they are able to promote plant growth. This feature gives them the potential to be used in agriculture as an ecologically compatible alternative. Although the Azospirillum amazonense is a lesserknown species, the study of its molecular biology could contribute to a better understanding of the mechanisms implicated in plant growth. In the first part of this study, genetic tools that can support the study of the molecular biology of A. amazonense were described. Conjugation and electrotransformation methods were established utilizing vectors with broad host-replication origins (pVS1 and pBBR1). Furthermore, glnK-specific A. amazonense mutants were generated utilizing the pK19MOBSACB vector system. Finally, a promoter analysis protocol based on fluorescent protein expression was optimized to aid genetic regulation studies on this bacterium. In the second part of this study a comprehensive analysis of the genomic features of this species was presented. The species A. amazonense presents a versatile repertoire of genes crucial for its plant-associated lifestyle. Genes of A. amazonense related to nitrogen/carbon metabolism, energy production, phytohormone production, transport, quorum sensing, antibiotic resistance, chemotaxis/motility and bacteriophytochrome biosynthesis were identified. Noteworthy genes were the nitrogen fixation genes and the nitrilase gene, which could be directly implicated in plant growth promotion, and the carbon fixation genes, which had previously been poorly investigated in this genus. One important finding was that some A. amazonense genes, like the nitrogenase genes and RubisCO genes, were closer phylogenetically to genes from Rhizobiales members than to those from species of its own order.

Orientadora : Profª Drª Emanuel Maltempi de Souza, Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo / Co-orientadores : Dr.Helisson Faoro / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2014 / Inclui referências / Resumo: Celulases apresentam diversas utilidades industriais, desde uso em etapas de polimento de tecidos até produção de biocombustíveis, especialmente de bioetanol de 2ª geração. Na busca por novas celulases, a prospecção em bactérias colonizadoras de plantas pode levar a identificação de enzimas particulares. Este trabalho teve como objetivo identificar, expressar e caracterizar genes de possíveis celulases e hemicelulases presentes no genoma de Azospirillum brasilense, uma bactéria colonizadora de rizosfera de gramíneas. Genes codificando glicosil-hidrolases foram identificados por comparação de sequências. Os genes identificados foram posteriormente clonados e expressos em E. coli. Dos 10 genes codificando prováveis glicosil hidrolases, 4 foram clonados em vetor de expressão. Dois dos plasmídeos obtidos, contendo genes de uma celulase e uma hemicelulase, permitiram superexpressar as proteínas recombinantes em E.coli que foram purificadas com sucesso. Porém, as 4 enzimas não demonstraram atividade de degradação celulolítica ou hemicelulolítica. Com a finalidade de se identificar se realmente há enzimas com atividade de degradação de celulose ou xilana em A. brasilense, a bactéria foi cultivada em meios específicos contendo apenas celulose ou xilana como fonte de carbono. Evidência de crescimento foi observada apenas na presença de xilana, o que leva a crer que há maquinaria ativa capaz de degradar este polímero em A. brasilense estirpe FP2. Palavras-chave: celulases, xilanases, Azospirillum brasilense. / Abstract: Cellulases have many industrials uses, from polishing fabrics to biofuel production, especially second generation bioethanol. Searching for new cellulases, bioprospection in plant-root-colonizing bacteria could lead to discover novel enzymes. This study aimed to identify and characterize possible cellulolytic and hemicellulolytic enzymes in genome of Azospirillum brasilense. Sequence comparison was used for identification of glycosyl hydrolases (cellulases and xylanases) in the A. brasilense draft genome. Four out of 10 selected genes were cloned and overexpressed in E. coli. Of these four, a probable cellulase and a hemicellulase were purified successfully. However, the four enzymes had no degradation activity. In order to determine if A. brasilense is capable of degrading cellulose or xylan, the bacterium was grown in media containing either cellulose or xylan as sole carbon source. Only xylan sustained A. brasilense growth, suggesting the presence of active machinery capable for degrading this polymer in A. brasilense strain FP2. Key-words: cellulases, xylanases, Azospirillum brasilense.