Cette étude a eu pour but d'élucider le rôle physiologique de l'enzyme ß-lactamase. Nous avons postulé que la ß-lactamase n'est pas exclusivement de nature bactérienne, qu'elle est reliée à une fonction physiologique importante et que cette fonction peut se retrouver chez les mammifères. Nous avons d'abord entrepris de vérifier le concept d'universalité des ß-lactamases. Des méthodes sensibles de détection ont été appliquées afin de mesurer la capacité de souches bactériennes, dites ß-lactamases-négatives, de synthétiser cette enzyme. La présence de ß-lactamase a semblé être une caractéristique commune aux bactéries grain-négatives. Une souche de Mycoplasma pneumoniae n'a montré aucune activité de ce type. Chez les micro-organismes à Gram positif, les actinomycètes Bifidobacterium et Propionibacterium ont montré une faible activité ß-lactamase. Deux Peptococcus anaerobius et un Peptostreptococcus productus n'ont pas révélé d'activité ß-lactamase décelable. Ces deux espèces sont des bactéries anaérobies strictes. Cette observation suggère que la ß-lactamase peut jouer un rôle dans le métabolisme aérobie des cellules productrices. Nous avons ensuite réalisé des expériences métaboliques avec des souches d'entérobactéries afin de vérifier si la synthèse de ß-lactamase est accrue en aérobiose. Nous avons mesuré l'effet de l'oxygène sur la synthèse de ß-lactamases inductibles et constitutives, en présence ou non de cyanure de potassium. De plus, l'influence de la pénicilline, de la source d'énergie et de la composition du milieu de culture sur le taux de synthèse de ß-lactamase fut évaluée en présence et en absence d'oxygène. L'aérobiose ainsi que le milieu minimal ont augmenté les niveaux des ß-lactamases d'Enterobacter et de Citrobacter. Le cyanure de potassium a freiné l'effet inducteur de 1'oxygène en aérobiose. Ce résultat semble suggérer que la synthèse de g-lactamase dépend davantage du fonctionnement normal de la chaîne des transporteurs d'électrons que de l'influence directe de l'oxygène à d'autres niveaux métaboliques. Nous avons justifié la nécessité de réaliser ce type d'expériences avec des souches microbiennes génétiquement définies. A la suite de ces observations, nous avons dirigé nos efforts vers la mise en évidence et la caractérisation d'une activité g-lactamase dans des cellules de mammifères. Les méthodes d'études ont été basées sur 1 'interaction des protéines de rat avec une gamme d'antibiotiques appartenant aux principaux groupes de ß-lactamines. Les résultats ont indiqué que le surnageant 100,000 g d'un homogénat de foie de rat peut dégrader les ß-lactamines. L'activité a été jugée complexe. L'inactivation de deux céphalosporines chromogéniques, le PADAC (pyridinium-2-azo-p-diméthy 1-ani 1ine chromophore) et la nitro- céfine, a semblé reposer sur deux mécanismes différents. Les caractéristiques spectrophotométriques de ces deux substrats et de leurs produits de dégradation ont rappelé une activité de type g-lactamase. Nous avons déterminé l'absence de relation avec d'autres protéines capables de réagir sur les g-lactamines comme la peptidase rénale, l'albumine et l'acylase. La présence d'une ß-lactamase dans les cellules de foie de rat pourrait contribuer à élucider son rôle physiologique essentiel. Dans cette perspective, nous avons entrepris de purifier l'activité ß-lactamase des cellules de foie de rat. Les tentatives entreprises afin d'isoler la protéine responsable de l'hydrolyse du PADAC ont échoué. Chaque étape de purification a été caractérisée par une faible récupération de l'activité enzymatique et, par conséquent, une perte d'activité spécifique. Nous avons d'abord attribué ce résultat à une grande instabilité de l'enzyme. La recherche des conditions optimales pour stabiliser cette protéine a permis de déterminer qu'elle nécessite la présence d'un cofacteur, le NADPH. Elle possède un poids moléculaire voisin de 25,000 et un point isoélectrique d'environ 7.7. Elle a réagi aussi avec quelques pénames et céphèmes. La protéine qui a dégradé la nitrocéfine possède un poids moléculaire inférieur à celle qui a hydro lysé le PADAC et un point isoélectrique près de 5.4. Elle a réagi avec un pénème et un monobactame. Ces propriétés n'écartent pas la possibilité qu'il s'agit de g-lactamases. Cependant, l'appartenance définitive de ces protéines à la famille des ß-lactamases devra attendre leur purification complète. / Montréal Trigonix inc. 2018

La résistance bactérienne aux antibiotiques est une menace en constante expansion. Les bactéries ne cessent de développer de nouvelles résistances à un rythme parfois plus rapide que notre capacité à développer de nouveaux médicaments pour les combattre. Il est donc important si l'on veut garder la cadence dans ce marathon contre les bactéries de continuer la recherche de nouvelles méthodes pour contrer la résistance aux antibiotiques. La présente étude se divise en deux projets portant chacun sur une approche distincte dans le but de développer de nouveaux antibiotiques. La première partie porte sur l'étude des peptides antimicrobiens comme nouvelle classe d'antibiotiques. Leur mode d'action distinct des antibiotiques sur le marché est prometteur pour un développement de résistance amoindrie. Par contre, leur complexité entraîne une conception de médicament plus ardue. Afin d'aider la compréhension des facteurs influençant l'interaction des peptides avec leur principale cible, les membranes cellulaires, un peptide modèle synthétique simple et neutre ainsi que des analogues chargés positivement furent développés dans notre groupe. Ces peptides, notamment surnommés 14-mère, R4R11 et R5R10, ont d'abord été étudiés par des multiples méthodes spectroscopiques, biophysiques et bio-informatique. Ces études démontrent qu'il est possible de moduler la structure secondaire des peptides par la position des acides aminés cationiques dans la séquence. De plus, la conformation des peptides influence leurs interactions avec les membranes modèles et les cellules où ceux en feuillets β sont plus sélectifs envers les modèles et cellules procaryotes alors que ceux sous forme d'hélice α interagissent indistinctement avec les deux types membranes modèles ou cellules. Il a aussi été observé une différence d'orientation entre les peptides hélicoïdaux neutres et cationiques en présence de différentes membranes lipidiques. Les peptides étudiés ont une plus grande affinité envers les bicouches plus minces et les peptides cationiques ont une plus grande interaction avec les membranes anioniques. Ensuite, le projet s'est poursuivi par l'étude de l'effet de l'ajout d'un groupement ayant une propension à se lier aux membranes procaryotes. Pour ce faire, un ligand bis-dipicolylamine (bis-DPA) a été ajouté à l'extrémité N-terminale des peptides 14-mère, R4R11 et R5R10 afin de former un complexe de Zn(II) in situ avec le ligand bis-DPA (Zn₂•bisDPA). En général, la présence du complexe augmente la sélectivité des peptides par l'entremise d'une interaction plus grande envers les cellules procaryotes et membranes modèles anioniques. La seconde partie vise plutôt la recherche de nouveaux inhibiteurs de β-lactamases visant sur une approche de combinaison de médicaments afin de diminuer la résistance aux antibiotiques β-lactames. Malgré leurs similitudes avec les composés β-lactames et leurs propriétés d'inhibiteurs de protéases, les molécules de la famille des sulfahydantoïnes n'ont pas été investiguées comme inhibiteurs de β-lactamases. Divers analogues ayant comme cœur l'hétérocycle sulfahydantoïne ont été synthétisés à partir d'acides aminés et ont été évalués pour leur pouvoir inhibiteur sur les β-lactamases courantes TEM-1 et TEM-15. De ces analogues, certain ont démontré une inhibition notable des deux β-lactamases avec des valeurs de IC₅₀ entre 130 et 510 μM et des valeurs inférées de Kᵢ entre 32 et 55 μM. Ces résultats indiquent que ce type de composés ont un potentiel intéressant comme futur inhibiteur de β-lactamases. / Antibiotic resistance is one of the top worldwide healthcare problems. Bacteria are continuously finding new ways to survive the treatment we develop. To stay ahead in this race, we must accelerate the development of new drugs that counteract bacterial resistance. The present study is divided in two projects each using a separate approach aiming to find new antimicrobial molecules. The first part of this thesis focusses on the study of antimicrobial peptides as a potential new class of antibiotics. Their mode of action is different than commercially available antibiotics and is less prone to induce resistance development. However, the design of new peptides for clinical uses is challenging because of the complexity of these compounds. To have a better understanding of the molecular determinants affecting their interaction with cellular membranes, we have developed a simple synthetic model peptide with a neutral global charge named 14-mer. Multiple analogs were synthesized bearing cationic amino acids at different positions in the sequence. Notably, analogs R4R11 and R5R10, bearing arginine residues at positions 4 and 11, and 5 and 10 respectively, were studied alongside the 14-mer model by various spectroscopic, biophysical and bioinformatics methods. These experiments show that the secondary structure and supramolecular self-assembly can be modulated by the position of the cationic residue in the peptide sequence. The peptide secondary structure affects their interactions with model membranes and living cells. The β-strand peptides tend to interact more selectively toward prokaryotic model membranes and cell whereas α-helical peptides interact indistinctly with both prokaryotic and eukaryotic model membranes and cells. In addition, a difference in peptide orientation has been observed between uncharged and cationic α-helical peptides when they interact with phospholipid membranes. These peptides have generally a higher affinity with thinner bilayers, and cationic peptides possess better interaction with cationic membranes. The investigation was continued by studying the effect of the incorporation of a molecular tag that is known to have a high affinity toward prokaryotic membranes. This was achieved by adding a bis-dipicolylamine (bis-DPA) ligand at the N-terminus of peptides 14-mer, R4R11 and R5R10 to form a Zn(II) complex in situ. The Zn(II) complex tends to increase the selectivity of the studied peptides toward prokaryotic model membranes and cells. The second part of this thesis instead focusses on finding new β-lactamase inhibitors in order to reduce the antibiotic resistance of one of the most versatile antibiotic families, the β-lactams. As potential candidates, the sulfahydantoin family has never been investigated for this application even if they possess similar structure to β-lactam antibiotics and has been shown to inhibit similar enzymes like proteases. To evaluate their potential, we synthesized multiple analogs containing the sulfahydantoin heterocycle starting from amino acids. These analogs were tested as inhibitors of two of the most prevalent β-lactamases, TEM-1 and TEM-15. Out of these compounds, two analogs have shown substantial inhibition with IC₅₀ values between 130 and 510 μM and inferred Kᵢ values between 32 and 55 μM. These results suggest that sulfahydantoin compounds have a good potential for the development of new and improved β-lactamase inhibitors.

La caractérisation des interactions protéines/polysaccharides a été réalisée à l’aide d’un système modèle β-lactoglobuline (β-lg)/pectine. Les pH de formation des complexes solubles entre la β-lg et la pectine faiblement ou hautement méthylée (pectine LM ou HM) mesurés par titrage potentiométrique sont de 6,1 et 5,5, respectivement. L’importance des interactions électrostatiques et la présence de liens hydrogène ont été démontrées par la dissociation des complexes en présence d’agents déstabilisants. La constante d’association, la stoechiométrie, la taille du site de liaison et la coopérativité des complexes ont été déterminés sous différentes conditions. Les paramètres d’interaction des peptides β-lg 132-148, 76-83, 41-60 et 1-14 suggèrent l’implication de ces zones peptidiques dans les complexes β-lg/pectine. L’initiation de l’interaction entre la β-lg et la pectine se traduit par la formation de complexes solubles d’origine enthalpique. La neutralisation des complexes induit leur agrégation et leur insolubilisation. Des facteurs d’origines entropique et enthalpique sont favorables à cette agrégation. La séparation de phases observée lors de l’agrégation des complexes s’effectue selon un mécanisme de nucléation et croissance. / The aim of this study was to characterize protein/polysaccharide interactions using the β-lactoglobulin (β-lg)/pectin as a model system. The pH values leading to the formation of soluble complexes (pHc) between β-lg and low or high-methoxyl-pectin (LM- or HM-pectin) measured with titration were 6.1 and 5.5, respectively. The destabilizing effect of sodium chloride, urea and temperature has demonstrated that interactions in the systems are mainly caused by electrostatic forces and, to a lesser extent, hydrogen bonding. Binding parameters of β-lg/pectin complexes were determined using frontal analysis continuous capillary electrophoresis (FACCE). At pH 4, approximately 23 β-lg molecules are cooperatively complexed on LM-pectin, where each β-lg molecule covers an average of 12 D-galA residues. The calculated binding constant is 1431 M-1. The peptides β-lg 132-148, 76-83, 41-60, and 1-14 would be involved in the interaction with the pectin. Isothermal titration calorimetry (ITC) was used to characterize the thermodynamic parameters of β-lg/LM- or HM-pectin complexes. The binding isotherms revealed the formation of soluble intrapolymer complexes further followed by their aggregation in insoluble interpolymer complexes. The soluble complexes were enthalpically driven, whereas enthalpic and entropic factors were involved in the insoluble complexes formation. Static light scattering was used to monitor the phase separation of β-lg/LM and HM-pectin mixtures as they were acidified with glucono-δ-lactone (GDL). This technique was used to confirm the two-step mechanism observed with ITC. The phase separation resulting from complexation was achieved through a nucleation and growth mechanism. The increase of complexation in solution with acidification led to a local ordering of systems. Complex formation through acidification was confirmed using phase contrast microscopy. A better understanding of β-lg/pectin interactions was required to achieve research projects using complexes as food ingredients.

La préséniline1 (PS1) lorsqu'elle est mutée, cause la maladie d'Alzheimer sous forme héréditaire. Cette protéine est impliquée dans diverses voies de signalisation, particulièrement la voie de Notch et de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP). L'objectif de ce travail était d'étudier la relation entre ces deux voies. Pour ce faire, nous voulions créer une banque d'ADNc à partir de cellules qui surexpriment une portion du gène Notch pour ensuite la cribler par la méthode du double hybride de levure. Malheureusement, nous n'avons pu créer la banque d'ADNc. Cependant nous avons criblé une banque commerciale d'ADNc de cerveau embryonnaire humain en utilisant les sondes constituées par le domaine N-terminal de PS1 (1-132) ainsi que le domaine intracellulaire d'APP (AICD). Différents partenaires ont été identifiés avec les 2 sondes. Parmi ceux-çi, un clone ayant le potentiel de relier les voies de Notch et APP a été identifié avec la sonde AICD.

La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale cause de démence chez les personnes âgées. Les mutations dans les gènes codant pour les présénilines 1 et 2 (PS1 et PS2) sont associées à une forme familiale très agressive de la MA, affectant des individus entre 25-50 ans. PS1 est un membre du complexe y-sécrétase impliqué dans la production de l'amyloïde, et les mutations de PS1 entraînent une surproduction des formes longues de ce peptide qui évoluent vers les plaques seniles. Cependant, il est maintenant bien décrit que PS1 interagît avec d'autres protéines et voies de signalisation, parmi lesquelles se trouve son seul partenaire exclusivement neuronal, la neural plakophilin related armadillo protein (NPRAP ou 5-caténine). Afin d'investiguer la fonction biologique de NPRAP, ainsi que son interaction avec PS1, nous avons réalisé une analyse d'expression génique à l'aide de micropuces à ADN. Nous avons trouvé plusieurs gènes régulés par NPRAP, y compris BCHE (butyrylcholinesterase), qui est associé à la MA. De plus, nous avons démontré que le signal de localisation nucléaire de NPRAP est requis pour cette modulation et que la PS1 peut affecter l'effet de NPRAP sur BCHE. Ces résultats sont en accord avec d'autres observations qui suggèrent un rôle pour PS1 comme régulateur de la mobilité de NPRAP, de la périphérie cellulaire jusqu'à la région périnucléaire ou ils interagissent très fortement. De façon intéressante, l'analyse de l'interactome de NPRAP par spectrométrie de masse a identifié son association directe à une isoforme de la dynamine 2 impliquée dans le trafic membranaire et l'assemblage de l'actine dans le Golgi. Nos résultats suggèrent que PS1 peut réguler la signalisation intracellulaire médiée par NPRAP, mais aussi que NPRAP aurait un rôle putatif dans la régulation du complexe y-sécrétase dans lequel participe PS1.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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