Made available in DSpace on 2014-06-12T17:35:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4431_1.pdf: 1604101 bytes, checksum: 252ec0d8f0a96392d0c4fe6ee5c00449 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / No trabalho com moléculas muito pequenas (nanoscópicas) o conhecimento a cerca do seu tamanho é um fator importante para o estudo do transporte de substâncias. Para estimar o raio efetivo de moléculas, seguimos o caminho mostrado por Bezrukov (1999) utilizando uma equação matemática que relaciona o tamanho das micropartículas com a variação da condutividade da solução provocada pela adição da própria micropartícula. Éteres de coroa (moléculas nanoscópicas) são uma família grande de compostos com núcleos cíclicos geralmente formados de etilenoglicol. Algumas dessas substâncias são capazes de atuar como antibióticos (WOODWARD, 1957). Outras supostamente atuam como moduladores de canais (BETHGE, 1991). De acordo com nosso conhecimento não existem estudos sobre o tamanho efetivo das coroas em soluções aquosas nem dados específicos sobre a interação das coroas com canais iônicos. Baseado na ausência dessas informações o objetivo deste trabalho é estudar o raio efetivo das três coroas mais simples (18coroa6, 15coroa5 e 12coroa4) tanto em solução aquosa quanto na interação delas com o canal iônico formado pela alfa-estafilotoxina. As coroas estudadas são não-eletrólitos por não possuírem grupamentos com carga. Para estimar o raio efetivo das coroas, dois procedimentos foram realizados: primeiramente o raio das moléculas escolhidas foi estimado através da modelagem molecular realizada pelo software CSChem3D Pro desenvolvido pela Cambridge Software Corporation. No segundo, o tamanho dessas moléculas foi determinado experimentalmente através do estudo das mudanças de condutividade das soluções aquosas na presença das mesmas. Foram realizados experimentos com soluções de cloreto de potássio, cloreto de sódio e cloreto de lítio em quatro diferentes concentrações (100, 500, 1000 e 2000 mM). Os três tipos de coroa foram adicionadas às soluções para ter seus raios efetivos estimados. Encontramos que os valores obtidos pelos métodos da condutividade e modelagem molecular são semelhantes (12coroa4: 0,46nm - 0.48nm; 15coroa5: 0,5nm - 0.52nm; 18coroa6: 0,56nm - 0.56nm) respectivamente. Essa semelhança indica que os dois métodos podem ser aplicados com sucesso para estimar o tamanho de éteres de coroa. Indica também que a equação matemática que relaciona as mudanças de condutividade com o raio das moléculas, inicialmente desenvolvida para micropartículas, é efetiva para estimação do raio de nanopartículas. Os raios das coroas estão na faixa do tamanho do menor raio dos canais iônicos: 0,15 nm para os dependentes de voltagem e 1 nm para os dependentes de neurotransmissores. Para estudar a interação das coroas com o poro aquoso de canais iônicos é necessário utilizar um canal cuja estrutura seja bem estabelecida. O canal formado pela alfa-estafilotoxina satisfaz essa exigência. Ele apresenta características semelhantes às dos canais dependentes de neurotransmissores: estrutura assimétrica, baixa seletividade, condutância relativamente alta e o raio mínimo e máximo iguais a 0,65 nm e 1,3 nm respectivamente (SONG, 1996). A bicamada lipídica plana com este canal incorporado foi utilizado neste trabalho como um sistema modelo para se estudar a influência das coroas nas propriedades dos canais iônicos. O regime de clampeamento de voltagem em canais iônicos unitários foi adotado. Nos experimentos foram utilizadas soluções de KCl, NaCl e LiCl todas com concentração de 1M. Nosso estudo pela primeira vez mostra que a condutância do canal pode ser influenciada pelas coroas. Indica que as três coroas estudadas apresentam maior efetividade na influência sobre a condutância do canal quando potenciais negativos são aplicados no lado da incorporação do canal na membrana. Essa dependência do potencial indica que a coroa não bloqueia o canal isoladamente, só quando forma um complexo coroa-cátion. Identificamos também que as efetividades das coroas são diferentes entre si e dependem do cátion utilizado. Vimos que a equação de Michaelis-Menten pode descrever de forma precisa a dependência dose-efeito . Concluímos então que o canal iônico possui um único sítio de interação com as coroas e que o bloqueio máximo atingido com o uso das três coroas é similar (~ 53%), entretanto elas têm concentrações de meio-efeito bem diferentes (C50%=186mM; C50%=96.7mM e C50%=32.6mM para 12crown4, 15crown5 e 18crow6 respectivamente em 1M de KCl). Estabelecemos que a 18coroa6 apresenta maior habilidade de bloqueio na condutância do canal do que a 15coroa5 que por sua vez apresenta maior efetividade do que a 12coroa4

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:35:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4440_1.pdf: 451057 bytes, checksum: d63fb1844a213a25db1bd666f456e9a3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / O laser de baixa intensidade encontra larga aplicabilidade clínica em medicina. Os efeitos terapêuticos esperados e referidos na literatura especializada abrangem eliminação de processos dolorosos, estimulação de crescimento celular dentre outros. Muitos e novos tipos de equipamentos são disponibilizados no comércio com diferentes potências e densidades energéticas. Neste trabalho nos propusemos a avaliar o efeito do L B I sobre embriões de moluscos Biomphalaria glabrata considerando as variáveis físicas de intensidade e densidade energética. O uso do Laser de arseniato de alumínio e gálio com comprimento de onda de 684nm nas potenciais 15, 30 e 50 mW e densidades energéticas de 3 e 6 Joules, permitiu observar experimentalmente resultados sugestivos da existência de forte correlação entre potência densidade energética e bioestimulação

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:35:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4450_1.pdf: 834431 bytes, checksum: 9b8ba911262a1f186c2483cb694e92ba (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / A densidade energética de baixa potência (Laser e campo eletromagnético) vem sendo utilizada, nos últimos anos, com bastante freqüência na área médica e odontológica. O principal uso do Laser é auxiliar o reparo tecidual, para aliviar a dor, controlar a inflamação e o edema. Enquanto que, a ação de campos eletromagnéticos de baixa freqüência sobre os seres vivos é alvo de estudo ao longo dos últimos anos e tem se constatado a sua interferência sobre a debilidade do sistema endócrino. Vale ressaltar que o estudo de marcação das hemácias com tecnécio-99m é usado para diversas avaliações em medicina nuclear incluindo o estudo do volume sangüíneo em tratamento intensivo neurológico. Este trabalho visa avaliar a influencia da radiação não ionizante sobre a marcação de hemácias "in vitro" e avaliar o efeito do laser na cicratização em camundongos. Para isto foram utilizadas amostras de sangue de ratos da linhagem Wistar com 60 dias de idade pesando cerca de 240g. O sangue foi colhido por punção cardíaca e dividido em dois grupos. O primeiro para ser submetido à indução com Laser de Baixa Potência (LBP) nas seguintes densidades energéticas separadamente: 3, 6 , 9 e 18 J/cm2 .Nos experimentos, com a indução do LBP foram utilizados o EDT A e a Heparina como anticoagulante. O segundo grupo foi submetido a um campo eletromagnético (CEM) de 60 Hz durante 2, 4, 17 e 21 horas separadamente. Após a indução do laser e do campo eletromanético as amostras de sangue foram submetidas a marcação com Tecnécio 99m (99mTc). Os resultados mostram que a presença de EDT A e Heparina no sangue, como anticoagulante é capaz de modificar a captação de tecnécio-99m pelas hemácias. A indução do laser promove uma redução da capacidade de ligação do tecnécio-99m a partir de 3J/cm2 obtendo uma redução em torno de 50% e permanecendo inalterada até 18J/cm2. Por outro lado, pode-se verificar que o campo eletromagnético também altera a capacidade de ligação em função do tempo de exposição, porém a inibição da captação pelas hemácias é menos acentuada que o laser. No experimento "in vivo" com camundongos machos, após incisões no abdome da ordem de 1 cm, com posterior aplicação do laser na densidade energética de 3J/cm2, na incisão esquerda, observa-se que 48 horas após as aplicações, o tecido epitelial e conjuntivo, macroscopicamente, encontra-se totalmente livre de inflação e infecção e com uma cicatrização superficial mais pronunciada que a incisão direita. Pode-se concluir que o laser e o campo eletromagnético promovem alterações na marcação dos elementos sangüíneos, e o laser é capaz de acelerar o reparo celular

Orientador: Alceu Sergio Trindade Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-23T01:40:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sampaio_AnaClaudiaMartins_M.pdf: 3377487 bytes, checksum: 2d1950f306f4121ef59b49daf8fd0520 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: O presente trabalho teve como propósito estudar a função neuromuscular do sistema estomatognático em um grupo de indivíduos com fissura lábio-palatina, portadores de marcantes desarmonias oclusais. Para isso, utilizou-se um eletromiográfo de dois canais (DISA 1500 EMG-System). Determinou-se, nos músculos masseteres e nos músculos temporais, a duração do período de silêncio eletromiográfico, induzido pela percussão do mento e pela percussão voluntária e rítmica dos dentes, a duração do ato mastigatório e a duração do ciclo mastigatório. A análise estatística mostrou que a duração do período de silêncio eletromiográfico, induzido pela percussão do mento foi significantemente maior nos indivíduos com fissura lábio-palatina que no grupo de normais. O mesmo foi observado na duração do período de silêncio eletromiográfico, quando induzido pela percussão voluntária e rítmica dos dentes nos músculos masseteres. Com relação aos músculos temporais, os valores da duração do período de silêncio eletromiográfico foram também maiores no grupo de indivíduos com fissura lábio-palatina, porém a diferença não se manifestou ao nível estatístico. A duração do ato mastigatório foi significantemente maior no grupo de indivíduos com fissura lábio-palatina que no grupo controle, apenas nos músculos do lado direito. A duração do ciclo mastigatório não apresentou diferença estatística entre os dois grupos analisados. Essas observações são indicativas da redução da duração do período de relaxamento muscular nos indivíduos com fissura de lábio e de palato. Tais resultados sugerem que a duração do período de silêncio eletromiográfico, induzido pela percussão do mento é o melhor parâmetro eletromiográfico para a avaliação do estado funcional do sistema neuromuscular estomatognático / Abstract: The purpose of the present study was to analyse the neuromuscular function of the stomatognathic system in subjects with cleft lip and palate and marked occlusal dysfunction. Electromyographic activity was recorded by a two channel-eletromyograph (DISA 1500 EMG-System). The duration of the EMG silent period, elicited by chin tapping as well as by voluntary rhythmic percussion of the teeth, the masticatory act duration and the masticatory cicle duration were determined at the masseter and temporal muscles. The statistical analysis showed that the EMG silent period duration elicited by chin tapping was significantly greater in the cleft subjects than in the normal subjects. The same was observed for the silent period duration elicited by voluntary rhythmic percurssion of the teeth on the masseter muscles. Concerning the temporal muscles EMG silent period duration was also greater in the cleft subjects than in the normal subjects; however, the differences was not statistically significant. The masticatory act duration was significant1y greater in the cleft subjects; only for the right side muscles. The masticatory cycle duration did not differ between the two groups. These observations showed that the period of the muscular relaxation was reduced in the cleft group. The results suggest that the EMG silent period duration elicited by chin tapping is the best parameter for the evaluation of the functional state of the neuromuscular stomatognathic system / Mestrado / Fisiologia e Biofisica do Sistema Estomatognatico / Mestre em Odontologia

Orientador: Iris C. L. Torriani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-12T00:08:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bigatto_JoseOtavio_M.pdf: 3280223 bytes, checksum: 91b8aeb170f846aad44d0b54f624ff66 (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: Bicamadas lipídicas livres de proteínas , foram estudadas intensamente durante os últimos anos, devido a grande similaridade entre tais sistemas e as membranas naturais. Recentemente, com o propósito de se obter uma melhor semelhança com os sistemas naturais, incorporou-se proteínas nas bicamadas lipídicas. Realmente, a localização e distribuição das proteínas no plano das membranas, não foram ainda completamente determinadas para um grande número de sistemas de membranas. Proteínas extrínsecas, como o citocromo-C, parecem estar superficialmente ligadas à membrana por forças eletrostáticas e permanecem quase que completamente sobre a fase aquosa, definida pelos grupos polares dos lipídeos (11,15). Mais recentemente, foi proposto que as proteínas extrínsecas poderiam também interagir hidrofobicamente com as cadeias de hidrocarbonos dos lipídeos ou até mesmo com as proteínas intrínsecas. Além disso, a existência de alguns estudos que parecem indicar que os citocromos-C tem uma pequena penetração nas bicamadas lipídicas (18, 28), motivaram o estudo estrututal por nós realizado. O preparo das amostras para os raios-X, para três sistemas de fosfolipídeos, foi feito segundo as técnicas usuais. Diagramas de difração de raios-X a baixo ângulo foram obtidos para multicamadas úmidas de Lecitina Dipalmítica -(D.P.L.), Cardiolipina/D.P.L. (1 : 4) e Cardiolipina/ D.P.L. /Citocromo-C (5 : 20 : 1). As razões molares aqui especificadas, provaram ser as que produziam melhores diagramas de difração. A análise da difração lamelar, usando-se uma das técnicas de determinação de fases, normalmente utilizada para este tipo de problema, permitiu-nos obter o perfil de densidade eletrônica das membranas modelo em estudo, com uma resolução de aproximadamente 5 Å. Um exame dos perfis de densidade eletrônica, mostrou alguma pertubação na região superficial da membrna quando da introdução do citocromo-C. A região hidrofóbica central parecia permanecer praticamente inalterada. Ambos estes resultados concordam com os recentemente obtidos por técnicas de N.M.R. e E.S.R. (18). O modelo proposto para o sistema DPL/ Cardiolipina /Citocromo-C é confirmado por nossos experimentos / Abstract: Protein free lipid bilayers have been intensely studied during the past few years due to the striking similarities between these systems and natural membranes. In recent years, with the purpose of attaining a better simulation with the natural systems, proteins have been incorporated into the bi1ayers. It is a fact that the location and tributiori of the protein in the plane of the membrane has not been completely determined for a number of membrane systems. Extrinsec proteins, like cytochrome C, seem to be superficially bound to the membrane by electrostatic forces and remain a1most completely on the aqueous side defined by the polar groups of the lipids (11, 15). More recently been proposed that extrinsec proteins might also have some hidrofobic interaction with the lipid hydrocarbon chains or even with the intrinsec proteins. Furthermore, the existence of some seem to indicate a slight penetration of Cyt.C in the 1ipid bilayes (18,28), have motivated the structural work undertaken by us. Preparation of X-ray samples of three phospholipid systems was done following the usual techniques. Low angle X-ray diffraction diagrams were obtained for wet rnultilayers of Dipalmitoyl Phosphatidyl Choline (DPL), Cardiolipin / DPL (1 : 4) and Cardiolipin / DPL / Cytochrome C. (5 : 20 : 1). The molar ratios here specified proved to be the ones that produced better diffraction patterns. Analysis of the lamellar diffraction using one of the usual phasing techniques for this kind of problem, allowed us to obtain the electron density profile of the model membrane systems under study, with a resolution of approximately 5 A. A close examination of the electron density profiles showed some perturbation in the membrane surface region upon introduction of the Cytochrome C. The hydrofobic central region seemed to remain practically unaltered. Both these results agree with the outcome of recent NMR and EPR experiments(18). A model proposed for the DPL / Card / Cyt C membrane is confirmed by our experiments / Mestrado / Física / Mestre em Física

Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:22:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borges_JulioCesar_D.pdf: 17156188 bytes, checksum: e2f1c0a8fbb9107a01472bb1172baa8d (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A função de uma proteína depende da estrutura nativa obtida a partir de sua estrutura primária de aminoácidos por um processo denominado de enovelamento protéico. Falhas neste processo podem levar à formação de agregados protéicos que têm relação com doenças humanas; como as doenças amilóides. Durante a evolução, as células têm desenvolvido mecanismos de prevenção e controle de qualidade para evitar a agregação de proteínas. Um destes mecanismos é através da síntese das chaperones moleculares. Dentre as várias proteínas desta categoria, destaca-se o sistema Hsp70 que desempenha funções essenciais no metabolismo de proteínas, pois age como um pivô, recebendo e distribuindo proteínas desenoveladas ou substratos entre as demais chaperones moleculares. Assim, o estudo do mecanismo de ação desta maquinaria é importante para compreender o enovelamento protéico no meio intracelular. Como muitas das informações disponíveis para o sistema Hsp70 são do sistema bacteriano, este estudo pretendeu a obtenção de proteínas da família Hsp70: Hsp70-1A e suas co-chaperones Hsp40 (DjA 1 e DjB4) e GrpE (GrpE#1 e GrpE#2) de origem humana. Os cDNAs destas proteínas foram clonados e as proteínas foram expressas, purificadas e caracterizadas quanto à relação estrutura e função. Para tanto, foram utilizadas técnicas como: dicroísmo circular, fluorescência, calorimetria, ultracentrifugação analítica e espalhamento de raios X a baixos ângulos. Os resultados principais mostraram que: 1) a Hsp70-1 A sofre pequenas mudanças conformacionais induzidas pelos nucleotídeos adenosina tri-fosfato ou adenosina di-fosfato; 2) as duas representantes humanas das subfamílias A e B das Hsp40, a DjA 1 e DjB4, respectivamente, possuem atividade chaperone e estrutura quaternária distintas uma da outra; e 3) as GrpEs humanas possuem estrutura quaternária similar, porém diferem na disposição espacial de alguns domínios e em outras propriedades biofísicas, indicando funções específicas ou especializadas no interior da mitocôndria. Estes resultados podem ajudar na compreensão sobre a relação estrutura-função desta importante maquinaria celular / Abstract: The role of a protein depends on its three-dimensional structure, which is acquired from its amino acid sequence through a process called protein folding. However, mistakes on this process cause protein aggregation, which may be related to some human illness; like amyloids diseases. During the evolution, the cells have developed mechanisms to prevent and to control quality in order to avoid protein aggregation. One of these mechanisms is the molecular chaperones. Among the several proteins from this category, the Hsp70 system has essential functions in the protein metabolism, because it acts as a pivot, receiving and handing out unfolded proteins or substrates among the others molecular chaperones. Thus, the study of the action mechanism of the Hsp70 machinery is important to understand the protein folding process inside the cells. Since, there is a large amount of information available about the Hsp70 system from bacteria, this study intended the characterization of proteins from human Hsp70 system: Hsp70-1A and its co-chaperones Hsp40 (DjA1 and DjB4) and GrpE (GrpE#1 and GrpE#2). The cDNA from those proteins were cloned and the proteins were expressed, purified, and characterized concerning their structure-function relation. In such effort, several techniques were used, like: circular dichroism, fluorescence, calorimetry, analytical ultracentrifugation and small angle X-ray scattering. The main results are: 1) the Hsp70-1A underwent little conformational changes induced by the nucleotides adenosine triphosphate or adenosine di-phosphate; 2) the two representatives of human Hsp40 proteins DjA 1 and DjB4, from subfamily A and B, respectively, possess distinct chaperone activities and quaternary structures; and 3) the human GrpEs possess similar quaternary structure, but with discrete differences in the spatial disposition of some domains and with dissimilar biophysical properties, implying in specific or specialized functions inside the mitochondria. These results may help the further understanding of the structure-function relation of that important cell machinery / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Alcides Guimarães / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-14T00:19:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_LilianeAratoMendesde_M.pdf: 1762823 bytes, checksum: f30e460e615b952a6dc12d9688e0f090 (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: O presente trabalho foi realizado com o objetivo de verificar se os efeitos da sialotoxina I sobre o hemograma de camundongos fêmeas, bem como possíveis alterações na histologia do fígado e baço destes animais.Foram utilizados 30 camundongos fêmeas (Hus musculus albinus) com 30 e 45 dias de idade pesando entre 20 a 30 g. Os animais foram distribuidos casualmente em três grupos experimentais.Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract:The purpose of this work was to verify the effects of sialotoxina I (a substance purified from submandibular gland extract of male mice) on the number of circulating erythrocytes and leukocytes and on the liver ans spleen histology of female mice. Thirty animals divided into three distint groups were used for this evaluation. Female mice were 1 p. injected during 10 consecutive days with NaCl 0,9% (Group I). Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Fisiologia e Biofisica do Sistema Estomatognatico / Mestre em Odontologia

Orientador : Gilberto D'Assunção Fernandes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T02:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Parada_CarlosAmilcar_M.pdf: 7085968 bytes, checksum: dc16709fe7a9dd98a15fca5e6d994834 (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: O efeito da lesão septal e estresse na resposta imune primária e no eixo hipotálamo-hipófise-adrenal foi investigado em ratos imunizados com hemácias de carneiro. Ratos machos da linhagem Wistar, com idade entre 2 a 3 meses, foram submetidos à aspiração bilateral dos núcleos septais com auxílio de um aparelho estereotáxico. O procedimento de estresse utilizado foi a contenção noturna por 12 horas. Amostras de sangue foram coletadas para a determinação dos níveis séricos de corticosterona e imunoglobulinas, ao longo dos 15 dias que sucederam a imunização. Os resultados mostraram que a lesão septal diminui o aparecimento de imunoglobulinas 2-mercaptoetanol-resistentes (Ig G) na circulação, altera a dinâmica das imunoglobulinas 2-mercaptoetanol-sensíveis (Ig M), nos primeiros dias após a imunização, e induz uma resposta hiperreativa do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, nos animais imunizados, independente do estresse aplicado. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The effects of septal lesion and stress on the primary immune response and hypothalamic-pituitary-adrenal axis were investigated in rats immunized with sheep red blood cells. Male Wistar rats were set up on a stereotaxic instrument and their septal nucleus were bilaterally aspirated. The stress procedure used was the restraint for 12 hour during the dark period. Blood samples were collected for determination of corticosterone levels and serum immunoglobulins,during 15 days after immunization. The results had shown that the septal lesion decreases the level of 2-mercaptoethanol-resistant immunoglobulins (Ig G) in the blood stream, modifies the dynamics of 2-mercaptoethanol-sensitive immunoglobulins (Ig M) until the third day after immunization and induces hiperreactivity of hipotalamic-pituitary-adrenal axis associated with the immune response, independently of the applied stress. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T14:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Perez_AndreadeCastro_M.pdf: 2741916 bytes, checksum: 85ad46653f3a715c8f296eb031da0911 (MD5) Previous issue date: 1986 / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos da gentamicina sobre as diferentes permeabilidades do 'Ca POT. 2¿ nas celulas 'beta¿ de ratos. Dois metodos distintos foram empregados: 1 - Anãlise da incorporação do 'ANTPOT.45 Ca¿ por ilhotas após 10 ou 90 minutos de incubação em diferentes situações experimentais. 2 - Anãlise do efluxo do 'ANTPOT. 86 Rb¿ de ilhotas previamente marcadas com o referido isótopo (substituto do 'ANTPOT. 42 K¿) e perfundidas durante 72 minutos em diferentes condições experimentais. A incorporação do 'ANTPOT.45 Ca¿ foi inibida pela gentamicina (1 mM) com maior potencia, quando estimulada por glicose ou arginina, quando comparada com altas concentrações de 'K POT. +¿. Como a glicose (8,3 mM) -e arginina (10 mM) estimulam a permeabilidade ao 'Ca POT. 2+¿ voltagem-insensivel e altas concentrações de 'K POT. +¿ estimulam a permeabilidade voltagem-sensivel, concluimos que nesta concentração a gentamicina age preferencialmente sobre a permeabilidade ao 'Ca POT. 2+¿ independente da voltagem tanto em 10 como 90 minutos de incubação. Na concentração de 0,1 mM não observamos efeito inibitório da gentamicina, indicando que a manifestação desse efeito seja dose-dependente. O D600 não manifestou seletividade por nenhum dos tipos de permeabilidade, inibindo de maneira semelhante a incorporação de 'ANTPOT.45 Ca¿ induzida tanto por altas concentrações de 'K POT. +¿, quanto por glicose. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es una proteína integral de membrana, en íntimo contacto con los lípidos de la misma. El objetivo de este trabajo de Tesis fue analizar si las propiedades intrínsecas del AChR son las que determinan su partición en un determinado dominio de lípidos. Para ello se eligió el tipo de AChR con mejor caracterización, el del tejido eléctrico del pez marino Torpedo. El AChR completo, purificado a partir de T. californica, se reconstituyó en membranas mode-lo con proporciones definidas de colesterol, esfingomielina y fosfatidilcolina, y luego se procedió a su análisis mediante téc-nicas bioquímicas y biofísicas. Una porción del AChR que se sabe reside normalmente en el interior de la membrana, el péptido sintético γM4, se estudió de manera similar con el objetivo de aprender acerca de la contribución del anillo exte-rior del segmento transmembrana, en contacto directo con los lípidos, en la supuesta segregación lateral en la membrana del AChR. La distribución del AChR o del péptido γM4 se evaluó por extracción de los liposomas con el detergente no-iónico Triton X-100, y su posterior centrifugación, para obtener membranas resistentes al detergente (DRM). Se ha postulado que tales fracciones serían el homólogo bioquímico de los dominios de lípidos tipo balsa ("rafts") preexistentes en la membrana plasmática de células. La contrapartida de tales fracciones, las denominadas "no-rafts", son las membranas solubles en el detergente (DSM). Se estudió también la in-fluencia de la rapsina (una proteína periférica involucrada en agrupamiento del AChR) o de la agregación de dominios tipo-rafts (utilizando membranas que contienen al gangliósido GM1 seguido por el entrecruzamiento de GM1). Los resultados experimentales permiten concluir que el péptido γM4 exhibe una marcada preferencia por los dominios tipo-rafts. Por el contrario el AChR, ya sea solo o en presencia de la proteína rapsina, o de la agregación del gangliósido GM1, no exhibió tal preferencia por los dominios tipo-rafts. La composición lipídica de las fracciones DRM y DSM obtenidas a partir de liposomas compuestos sólo por fosfatidilcolina:esfingomielina:colesterol en proporciones equimolares, o por la mismo mezcla de lípidos con γM4 o AChR incorporado, estaba enriquecida en todos los casos en colesterol y esfingomielina en la fracciones DRM, y enriquecidas en fosfatidilcolina en las fracciones DSM. Estos resultados demuestran que la composición lipídica de estas fases depende principalmente de las propiedades de los lípidos que las componen. Sin embargo, la proporción de cada dominio de lípidos depende de la presencia del AChR o del péptido γM4. El AChR produjo un aumento significativo en la cantidad total de la fracción DSM, con una reducción concomitante en la cantidad total de la fracción DRM. Por otra parte, γM4 aumentó la proporción de la fracción DRM. Por lo que inferimos que el péptido γM4 actuaría como un promotor de DRM y el AChR completo, por el contrario, actua-ría como un perturbador de DRM. La eficiencia de la transfe-rencia de energía resonante de Förster entre la fluorescencia intrínseca de la proteína (o del péptido) y el dehidroergosterol (mimético fluorescente del colesterol) sirve como una medida de la localización de la proteína en la membrana. La sonda fluorescente Laurdan como aceptora se utilizó como control, ya que no muestra ninguna partición preferencial por un dominio en particular. Los valores de la denominada polariza-ción generalizada, calculados a partir de los espectros de fluorescencia de la sonda Laurdan, fueron utilizados como informativos de las condiciones biofísicas de cada membrana. El AChR purificado no tuvo una partición preferencial entre dominios rafts (dominios enriquecidos en colesterol) y domi-nios no-rafts, mientras que el péptido γM4 se particionó preferentemente en dominios rafts. Podemos inferir que la predilección del AChR en su medio natural por un dominio dado de lípidos no puede ser atribuida exclusivamente a las propiedades fisicoquímicas de ambos o a las interacciones entre el dominio TM de la proteína y el ambiente lipídico, por lo que debería haber señales exteriores en las membranas celulares nativas que direccionen al AChR hacia un dominio de membrana específico. / The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is an integral membrane protein, in intimate contact with the lipids in its native membrane. The aim of the present Thesis was to analyze the possibility that it is the intrinsic properties of the AChR that determine its partition into a given lipid domain. For this purpose we chose the best characterized AChR, the one from Torpedo electric tissue. The AChR purified from Torpedo californica was reconstituted into model membranes with defined proportions of cholesterol, sphingomyelin and phosphatidylcholine, and analyzed by biochemical and biophysical techniques. The synthetic γM4 peptide was studied using the same experimental approach to learn about the contribution of the lipid-contacting transmembrane outer ring to the putative lateral segregation of the AChR in the membrane. The distribution of the AChR or the γM4 peptide was assessed by Triton X-100 extraction of the liposomes combined with centrifugation to yield detergent-resistant membranes (DRMs). These fractions have been postulated to correspond to the biochemical homolog of the lipid rafts domains that preexist in the cellular plasma membrane. Counterparts of those fractions, non-raft domains, are detergent soluble membranes (DSM). The influence of rapsyn (a peripheral protein involved in AChR aggregation) or that of aggregation of raft-like domains (using membranes containing the ganglioside GM1 followed by GM1 crosslinking) was also studied. The γM4 peptide displays a marked preference for raft-like domains. In contrast, the AChR alone or in the presence of rapsyn or ganglioside aggregation exhibits no such preference for raft-like domains. The lipid composition of the DRM and DSM fractions obtained from liposomes composed of the equimolar phosphatidylcholine: sphin-gomyelin:cholesterol mixture alone, or the same lipid mixture with γM4 or AChR, were all enriched in cholesterol and sphingomyelin in the DRM fractions, and enriched in phosphatidylcholine in the DSM fractions. These results indicate that the lipid composition of these phases depended mainly on the properties of the lipid. However, the amount of each lipid domain depends on the presence of the AChR or the γM4 peptide. The AChR macromolecule caused a significant increase in the total amount of the DSM fraction, with a concomitant reduction in the total amount of the DRM fraction. On the other hand, the presence of the γM4 increased the proportion of the DRM fraction. Thus, the γM4 peptide appears to behave as a DRM promoter and the AChR as a DRM disruptor. The efficiency of the Förster resonance energy transfr (E) between the protein (or peptide) intrinsic fluorescence and dehydroergosterol (a fluorescent cholesterol mimetic) served as a measure of the protein location in the membrane. Using the fluorescent probe Laurdan as a control acceptor -as it shows no preferential partition into a particular domain- the so-called generalized polarization values calculated from the Laurdan fluorescence spectra were used as a reporter of the biophysical properties of te membrane. Purified AChR displayed no preferential partition between rafts (domanins enriched in cholesterol) and non-rafts domains, whereas the y M4 peptide preferentially partitioned into raft domains. Putting all the data together, it can be inferred that the preference of the AChR for a given lipid domain in its natural milieu cannot be solely ascribed to the physicochemical properties of the two partners or to the interactions between the protein transmembrane domain and the lipid moiety, and that there must therefore be an external signal in native cell membranes that directs the AChR to a specific membrane domain.