Les bactéries ont besoin d’adapter leur cycle cellulaire et leur taux de croissance aux changements environnementaux et nutritionnels. L’initiation de la réplication est ainsi strictement coordonnée aux autres processus cellulaire afin de transmettre un chromosome conforme. Chez B. subtilis, bactérie modèle des Gram⁺, la protéine YabA joue un rôle majeur en réprimant l’initiation de la réplication, ceci en formant un complexe avec la protéine initiatrice DnaA et la clamp polymérase DnaN. YabA interagit en outre avec d’autres protéines partenaires et serait donc multifonctionnelle. Sa structure 3D révèle une architecture en deux domaines: Un domaine N-terminal adoptant un repliement de type superhélice et un domaine C-terminal globulaire structuré autour d’un atome de Zinc. In vivo, YabA est un tétramère par interaction entre les superhélices, connecté aux domaines C-terminaux monomériques par une séquence déstructurée hyper flexible. YabA serait un hub structural interagissant simultanément avec plusieurs protéines et constituerait une plate-forme d’intégration entre différents signaux intracellulaires et l’initiation de la réplication. La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité de nombreuses protéines en réponse à certains signaux cellulaires. Grâce à des expériences de phosphorylation in vitro et des analyses de spectrométrie de masse, nous avons montré que YabA est phosphorylée par la kinase de type Hanks YabT sur une thréonine, localisée dans la région flexible de liaison interdomaines. YabT est une kinase activée par l’ADN, exprimée en carence en glucose, en sporulation et en phase stationnaire. Nous avons construit des mutants phosphomimétique de YabA (yabA-T71D) et non phosphorylable (yabA-T71A) pour i) confirmer le rôle de T71 dans la phosphorylation et ii) réaliser des études fonctionnelles.Nous avons montré in vivo que la phosphorylation de YabA n’est pas impliquée dans l’initiation de la réplication, mais module des programmes de différenciation. La phosphorylation de YabA module inversement la sporulation et la formation de biofilm, ce qui souligne sa multifonctionnalité et son implication dans la signalisation cellulaire connectant l’initiation de la réplication et la différenciation. Nos résultats suggèrent que la phosphorylation YabT-dépendante de YabA affecte la différenciation en modulant le taux intracellulaire de Spo0A-P. En effet, la phosphorylation de YabA est corrélée à un taux élevé de Spo0A-P, ce qui stimule la sporulation et inhibe la formation de biofilm. Par ailleurs, nos expériences de chromatographie sur couche fine (TLC) et de “In-Gel” suggèrent que YabA possède une activité “ATP/GTPasique” atypique modulée par la phosphorylation de YabA sur T71. Nos analyses fonctionnelles révèlent un rôle potentiel de YabA sur des voies de signalisation dépendant du c-di-GMP, qui contrôle la formation du biofilm chez de nombreuses bactéries. Ces résultats suggèrent que YabA joue un rôle complexe pendant la différenciation en intégrant différentes voies de signalisation. Enfin, des analyses de LC-MS montrent que lorsqu’elle est surexprimée chez Escherichia coli, YabA est phosphorylée sur la tyrosine 90, qui appartient au domaine d’interaction C-terminal. Une étude double-hybride chez la levure montre que la phosphorylation de Y90 module l’interaction de YabA avec ses partenaires DnaA et DnaN. In vivo, la phosphorylation de Y90 module l’initiation de la réplication. La kinase impliquée n’a pas encore été identifiée, mais ces résultats suggèrent l’existence d’un contrôle de l’initiation de la réplication lié à la phosphorylation de YabA chez B. subtilis. En conclusion, l’ensemble de nos études suggèrent l’existence de différents niveaux de régulation de l’activité de YabA par phosphorylation sur thréonine et tyrosine. YabA, outre son rôle dans l’initiation de la réplication, joue un rôle majeur dans la différenciation de B. subtilis. / Upon environmental or nutritional changes, bacteria must adjust their cell cycle with their growth rate. Most particularly, DNA replication initiation events must be controlled and coordinated with cell physiology to ensure faithful chromosome inheritance. In Bacillus subtilis, a model of Gram-positive bacteria, YabA plays a major role in down regulating initiation replication through interaction with the initiator protein DnaA and the clamp polymerase DnaN. However, YabA is a structural hub protein able to interact with other protein partners, indicating it might be multifunctional. Through its unique overall tri-dimentional structure composed of N-terminal four helix-bundle tetramer connected to four monomeric C-terminal domains by a highly flexible linker, YabA is capable to physically interact with more than one protein at a time, thus providing a suitable platform to integrate intracellular signals to replication initiation. Phosphorylation is the most prevalent post translational modification that modulates protein activities in response to cellular signals. Using in vitro phosphorylation and mass spectrometry we demonstrated that YabA is phosphorylated by the Hanks-type serine/threonine kinase YabT at a threonine residue localized within the flexible inter-domain region. YabT is a kinase activated by DNA and up-regulated during glucose starvation, sporulation and stationary phase. We constructed YabA phosphomimetic (yab-AT71D) and non-phosohorylatable (yabA-T71A) mutants to (i) confirm the requirement of T71 for YabT-mediated phosphorylation in vitro and (ii) perform in vivo and in vitro functional studies.We show in vivo that the phosphorylation of YabA is not involved in initiation control, but rather modulates bacillus developmental processes. We found that YabA phosphorylation inversely regulates sporulation and biofilm formation highlighting the multifunctional role of YabA as well as its role in integrating physiological signals to connect chromosomal replication initiation control with cell development. Our results support a role of YabT-mediated phosphorylation of YabA in Bacillus subtilis life-style decision making through the modulation of Spo0A-P intracellular levels. We established that YabA phosphorylation correlates with high cellular levels of Spo0A-P, leading to sporulation stimulation and preventing biofilm formation. Additionally, thin layer chromatography (TLC) analysis and In-Gel assays showed that YabA possess an atypical "ATP / GTPase" activity. This unusual activity seems to be modulated by phosphorylation of the YabA T71 residue. Our functional analysis pointed to a potential role of YabA in the c-di-GMP signaling transduction pathway, known to regulate biofilm formation in many bacteria. This suggesting a complex regulatory role of YabA during development, involving signaling crosstalk. LC-MS analyzes showed that when overexpressed in Escherichia coli, YabA is phosphorylated on the residue Y90 in a YabT independent manner. Y90 belongs to the interaction C-terminal domain, which contacts DnaA and DnaN. We found that Y90 was involved YabA-mediated replication initiation control. We provided evidence that phosphorylation state of YabA at Y90 can potentially modulates a protein-interaction switch with its protein partners DnaA and DnaN in a yeast-two-hybrid-based assay. Although we did not identified a kinase responsible for the phosphorylation of YabA at Y90 in B. subtilis, this finding hint at the possibility of a YabA-mediated control of initiation modulated by phosphorylation in this bacteria. Thus, all of these in vitro and in vivo observations suggest the existence of different modes of regulation of YabA activity by phosphorylation, involving threonine and tyrosine residues. This study established that YabA, apart from its role during replication initiation, plays a key regulatory role in B. subtilis development.

Clostridium difficile est une bactérie enteropathogène responsable d'infections intestinales dont les manifestations cliniques varient d’une simple diarrhée à une colite pseudomembraneuse parfois mortelle. L’une des problématiques majeures rencontrées dans la prise en charge des infections à C. difficile (ICD) est la survenue de récidives. Chez de nombreuses espèces bactériennes, la formation de biofilm est associée à la chronicité de l’infection. Le biofilm est un mode de vie dans lequel les bactéries sont engluées dans une substance polymérique qu'elles secrètent elles-mêmes. L’aptitude de C. difficile à former un biofilm in vitro a été clairement établie depuis 2012. Cependant aucune étude n’a montré jusqu’ici s’il est capable de former un biofilm in vivo. L’objectif de cette thèse était d’une part d’étudier différents paramètres impliqués dans la formation du biofilm in vitro et d’autre part de déterminer si C. difficile est capable de former un biofilm in vivo. Dans un premier temps, nous avons analysé la capacité de différentes souches de C. difficile (souches cliniques et souches de laboratoires modifiées génétiquement) à former un biofilm in vitro. Parmi ces dernières, la souche mutée pour le gène cwp84, codant une protéase de surface responsable de la maturation de la couche S de C. difficile, présente un biofilm particulièrement robuste et épais comparé à la souche parentale 630∆erm. L’activité protéolytique de Cwp84 est donc impliquée dans la formation du biofilm et module certaines propriétés de surface de la bactérie telles que l’hydrophobicité. Nous avons également étudié la composition en sucre de la matrice du biofilm, après une étape de mise au point qui a permis de déterminer les conditions permettant d’obtenir suffisamment de matériel. Les conditions retenues ont été les suivantes : formation de biofilm sur un support en verre, en présence de glucose et en milieu renouvelé. La présence d’un sucre qui possède un profil proche du PSII (polysaccharide associé à la surface des cellules planctoniques de C. difficile) dans la matrice du biofilm a été détecté par spectroscopie infrarouge. Dans un second temps, afin d’étudier l’aptitude de C. difficile à former un biofilm in vivo, différents modèles animaux ont été utilisés : un modèle de souris monoxéniques dans lequel plusieurs souches de C. difficile ont été testées (souches 630∆erm, mutant cwp84, R20291, P30) et un modèle de souris dixénique pour étudier la formation de biofilm mixte (C. difficile/Finegoldia magna et C. difficile/Clostridium scindens). Dans le modèle monoxénique, quelles que soient les souches testées, C. difficile est distribué de manière hétérogène tout au long de la surface du tissu intestinal. Les bactéries sont majoritairement retrouvées isolées sauf pour la souche R20291 qui forme le plus souvent des petits agrégats. Pour cette souche, différents marquages immunohistochimiques réalisés sur des coupes de cecum et de colon ont montré que la majorité des bactéries sont enchâssées dans de petites structures en 3 dimensions adhérentes à la couche du mucus. Le polysaccharide PSII est détecté en grande quantité à l'intérieur de cette structure. Ce composé étant présent dans la matrice de biofilm de C. difficile formé in vitro, ces résultats suggèrent que la souche R20291 pourrait s’organiser en biofilm dans le modèle de souris monoxénique. En modèle de souris dixéniques, nous avons montré que la présence de F. magna n’influe pas sur le niveau de colonisation de C. difficile, alors que l'association avec C. scindens semble être bénéfique aux deux bactéries puisqu'une augmentation de la population globale de deux espèces est observée comparé à la population présente dans chaque modèle mono-espèce. En conclusion, une souche productrice de biofilm in vitro semble être capable de s’organiser en une structure biofilm in vivo. Le rôle du biofilm dans l'étape de colonisation du colon par C. difficile et les rechutes des ICD devra être analysé. / Clostridium difficile is an enteropathogenic bacterium responsible for intestinal infections, the clinical symptoms vary from moderate diarrhea to pseudomembranous colitis, sometimes fatal. One of the major problems encountered in the management of C. difficile infections (DCI) is the occurrence of recurrences. In many bacterial species, biofilm formation is associated with the chronicity of infection. Biofilm is a way of life in which bacteria are entrapped in a polymeric substance secreted by the bacteria themselves. The ability of C. difficile to form an in vitro biofilm has been clearly established since 2012. However, no study has so far shown whether it is capable of forming a biofilm in vivo. The objective of this thesis was to analyze different parameters involved in the formation of biofilm in vitro and to determine whether C. difficile is able to form a biofilm in vivo.We first analyzed the ability of different strains of C. difficile to form a biofilm in vitro (clinical strains and strains genetically modified laboratories). Among the latter, the mutant strain for the cwp84 gene, encoding a surface-associated protease responsible for the maturation of the S layer of C. difficile, forms a particularly robust and thick biofilm compared to the 630Δerm parental strain. The proteolytic activity of Cwp84 is involved in the formation of biofilm and modulates certain surface properties of the bacterium such as hydrophobicity. We have also studied the polysaccharide composition of the biofilm matrix, after a development stage that allowed us to determine the optimal conditions for obtaining sufficient material. The conditions retained were the following: formation of biofilm on a glass support in the presence of glucose and in a renewed medium. We were able to determine by infrared spectroscopy the presence of a sugar which has a similar profile than the PSII (polysaccharide associated with the surface of C. difficile planktonic cells) in the matrix of the biofilm.Second, in order to study the ability of C. difficile to form a biofilm in vivo, different animal models were used: a monoxenic mouse model in which we tested several strains of C. difficile (strains 630Δerm, mutant cwp84, R20291, P30) and a dixenic mouse model to study the formation of mixed biofilm (C .difficile/Finegoldia magna and C. difficile/Clostridium scindens). In the monoxenic model, regardless of the strains tested, C. difficile is distributed heterogeneously throughout the intestinal tissue surface. The bacteria are mostly found isolated except for C. difficile R20291 which usually forms small aggregates. For this strain we have shown, thanks to various immunohistochemical labeling performed on cecum and colon sections, that the majority of the bacteria are embedded in a small 3-dimensional structures overlaying the mucus layer. The PSII polysaccharide is present in a large amount in this structure. As this compound has been detected in the in vitro C. difficile biofilm matrix, these results suggest strongly that the R20291 strain could be organized into biofilm structures in the monoxenic mouse model. In the dixenic mouse model, we have shown that the presence of F. magna does not influence the level of colonization of C. difficile, whereas the association with C. scindens seems to be beneficial to both bacteria since an increase of the global population is observed in this model compared to the population present in each single-species model.To conclude, an in vitro biofilm producing strain appears to be able to organize in a biofilm structure in vivo. The role of biofilm in the colonization step of the intestinal tract by C. difficile and in the occurrence of recurrences should be further analyzed.

Le contrôle de la formation des biofilms est un enjeu économique majeur pour un grand nombre de secteurs économiques comme la distribution d’eau potable. De nombreuses voies sont explorées pour contrôler leur développement. Ces travaux proposent d’explorer la possibilité de prévenir l’adhésion bactérienne en exploitant les propriétés mécaniques de surface de films minces obtenus par polymérisation plasma basse pression à partir de deux précurseurs : le 2-(diméthylamino)éthyl méthacrylate (DMAEMA) et l’hydroxyéthyl méthacrylate (HEMA). Les résultats des caractérisations des propriétés de surface (AFM, IR, XPS, mouillabilité, nanoindentation par AFM) de ces films minces ont montré qu’il est possible de contrôler les propriétés mécaniques des dépôts polymères plasmas, notamment du HEMA, tout en conservant des propriétés chimiques similaires. Les propriétés d’anti-adhésion bactérienne des films minces HEMA ont été évaluées en utilisant une souche Escherichia coli SCC1 au cours de culture statiques et dynamiques. Ces cultures ont montré que lorsque les propriétés mécaniques de surface sont de l’ordre de 600kPa, elles induisent des propriétés d’anti adhésion et une forte mobilité des bactéries. Sous flux, ces propriétés sont exaltées avec aucune bactérie détéctée au bout de deux heures. Afin de pérenniser cette solution sur plusieurs dizaines d’années, un système multicouche a été développé afin de conduire à un renouvellement périodique des propriétés antibactériennes. De plus, cette stratégie a été développée par polymérisation plasma à pression atmosphérique dans l’optique de son industrialisation. / Control of biofilm formation is a major economic challenge for a large number of economic sectors such as the distribution of drinking water. Many strategies have been explored to fight against their development. This work proposes to explore the possibility of preventing bacterial adhesion by playing with mechanical surface properties. To do this, low pressure plasma polymerization of two precursors: 2- (dimethylamino) ethyl methacrylate (DMAEMA) and hydroxyethyl methacrylate (HEMA) has been explored. The results of surface characterizations (AFM, IR, XPS, wettability and AFM nanoindentation) of these thin films showed the possibility to obtain different mechanical properties in wide range (kPa to MPa) with similar chemical surface properties. Bacterial anti-adhesion properties of these films were evaluated using an Escherichia coli SCC1 strain during static and dynamic cultures. These results showed that mechanical surface properties around 600 kPa induced very good bacterial anti-adhesion properties and also revealed mobility of bacteria on the surface. Under flow, these properties were highlighted with almost no bacterial detected after two hours. In order to prolongate the life time of these properties, multilayer system has been proposed and synthesis of these plasma polymer multilayer has been studied at atmospheric pressure for industrial scale up.

This diploma thesis focuses on an optimalization of simple laboratory model systems which serve as an innovative tool for an experimental study on the adsorption of bacterial cells on solid surfaces. In the description of living biological systems, an adsorption is labelled as an adhesion. Designed model systems were validated with a physical-chemical analysis. Various techniques were used to determine bacteria properties, more specifically Burkholderia cepacia and Bacillus megaterium. The solid surfaces after sorption of bacterial cells of Bacillus megaterium were subjected to a structural and visual analysis. Applying the theoretical approach (e.g. using different physical-chemical models) to study the adhesion of microorganisms to a particular surface allows a prediction of the conditions for a successful adhesion. The results will give us a better understanding of a formation and development of a biofilm.

Objectifs : Le but de travail est d'étudier les possibles variations des propriétés physiques et chimiques en rapport avec l’usinage et les effets de l’irradiation avec des lasers CO2 et Nd:YAP. Il s’agit d’évaluer l’étanchéité de cet assemblage par micro-infiltration d’un biofilm mono bactérien par une technique FISH. Méthodes : Les tests d’évaluation ont été : la micro dureté, le cisaillement, la rugosité, la mouillabilité et l’EDS. 60 échantillons de 2 céramiques (les disilicates de Lithium et les Zircones) ont été soumises aux différents test. Pour le test d’étanchéité : Six couronnes de chacune des céramiques ont été exposées à biofilm de Streptococcus Salivarius pendant 10j. FISH a été appliquée pour marquer les infiltrations bactériennes observées en microscopie confocale. La résistance au cisaillement (p.=0,014 S) est significativement différente entre les échantillons irradiés et non irradiés. La mouillabilité superficielle partielle est bonne pour les 2 types de céramique. Les surfaces irradiées au Laser CO2 sont plus rugueuses pour les deux céramiques. La micro dureté de Li irradiée au CO2 a augmenté (6,32 GPa). Aucune élévation notable de température sur les 2 types de céramique. Le test d’étanchéité s’est avéré positif à la jonction cervicale couronne /dent. Conclusion : Les lasers CO2 et Nd: YAP modifient les forces de cisaillement et les surfaces des céramiques sans en modifier la composition chimique. L'irradiation au laser CO2 semble augmenter la résistance au cisaillement, la rugosité de la surface, la micro dureté et la mouillabilité des 2 types de céramique. L'irradiation des couronnes usinées au laser CO2 semble amélioré l’étanchéité de l’assemblage collé. / The purpose is to study the physical and chemical properties of CAD/CAM ceramics irradiated with CO2 and Nd:YAP lasers and to evaluate surface adhesion of ceramic crowns by microleakage test with a mono bacterial biofilm and a FISH technique. Methods : Evaluations tests were: Micro hardness, roughness, surface wettability, shear bond strength and EDS. 60 samples Two ceramics used: lithium disilicate and zirconia ceramics were prepared for different test. For microleakage test:Six ceramics crowns of different ceramics were contaminated with a Streptococcus salivarius biofilm for 10 d. Fluorescence in situ hybridization technique was applied samples were examined with confocal laser microscope. Results: Shear bond test showed significant difference between irradiated and non irradiated (p. value= 0,014 S). Partial superficial wettability was observed for the two ceramics. In micro hardness test, CO2 at 5 W increased micro hardness of lithium disilicate ceramics with significant value (6,32 GPa). SEM showed rough surface in all groups. EDS did not modify the chemical composition of tested ceramics. No significant rise in temperature could be recorded on both types of ceramic.The micro leakage test of a mono-bacterial biofilm was positive at the crown / tooth cervical junction. Conclusion: CO2 and Nd: YAP lasers modify CAD/CAM ceramic surfaces without chemical composition modifications. CO2 irradiation increase shear bond strength, surface roughness, micro hardness and made CAD/CAM ceramics hydrophilic. Irradiation with CO2 laser seems to improve surface adhesion and decrease bacterial microleakage.

Diese Promotionsarbeit beschreibt die Anwendung und Entwicklung eines Mehrkanal-Sensors zur zeitaufgelösten Biofilmbildungsdetektion und -überwachung. Biofilme, bestehend aus an Oberflächen gebundenen Gemeinschaften aus Mikroorganismen, findet man sowohl in technischen wasserfüh-renden Systemen, als auch im medizinischen Bereich. Dort sind sie als Verursacher von Biokorrosion, Biofouling, Kontaminationen und Infektionen meist unerwünscht. Reinigungs- und Desinfektionspro-zesse zur Entfernung dieser Biofilme erzeugen weltweit immense Kosten. Auf Grund von Forschungs-ergebnissen ist inzwischen bereits einiges über die Entwicklung und das Entstehen von Biofilmen an Modellorganismen bekannt. Viele Fragestellungen, besonders im Bereich der anwendungsbezogenen Detektion von Biofilmen, sind jedoch immer noch nicht gelöst, auch verursacht durch das Fehlen geeigneter Messmethoden. Sensoren, die es ermöglichen, Biofilmwachstum nicht-destruktiv online zu verfolgen, bieten im Gegensatz zu klassischen Methoden Vorteile unter anderem in der zeitlichen Auflösung und der Möglichkeit des Screenings. Derzeit gibt es lediglich wenige solcher Sensoren, die auch noch intrinsische Schwachpunkte aufweisen, wie beispielsweise eine geringe zeitliche Mess-dauer, einen geringen sensitiven Bereich, oder ein statisches Setup. Ziel dieser Dissertation war es daher, einen solchen Sensor zu entwickeln, der es erlaubt, beginnend mit der Adhäsion der Mikroorganismen bis hin zur Langzeit-Reifung des Biofilms unter Ausbildung 3-dimensionaler Strukturen Biofilmwachstum online zu dokumentieren. Ausgehend von einem 2-Kanalprototypen wurde in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Bastian Rapp (früher KIT, Institut für Mikrostrukturtechnik; IMT) ein 48-Kanalbiofilmsensor, basierend auf den beiden elektrochemischen Techniken Impedanzspektroskopie und amperometrischer Messung, entwickelt. Die zunehmende Biomasse eines in einem Sensorkanal anwachsenden Biofilms wurde hierbei durch ein Ansteigen der Inhibition beim Landungstransfer zwischen einem Elektrodenpaar ermittelt. Paral-lel wurde die Aktivität der gebundenen Biomasse über den Elektronenfluss ausgehend von respirati-ons-aktiven oxidativen Prozessen gemessen. Die Verwendung von parallelen Mikrokanälen ermög-licht ein referenziertes, zeitaufgelöstes Screening, geeignet beispielsweise für die Evaluation und Optimierung von Behandlungsmethoden und Reinigungsstrategien für Biofilme, als auch für die Untersuchung von Biofilmen in der Grundlagenforschung. Im Laufe dieser Arbeit wurde dieser neuentwickelte Mehrkanal-Sensor optimiert, validiert und an-gewendet. Die Optimierung, besonders in Bezug auf Sensitivität, erfolgte durch die Verwendung verschiedener Elektrodentypen der Amperometrie- und der Impedanz-Messung. Eine Kombination aus Interdigital- und zirkulärer Elektrode erlaubt letztendlich eine sensitive Impedanzmessung im Bereich weniger Stunden bis hin zu mehreren Wochen. Die Systemvalidierung erfolgte durch den Vergleich der Biofilmbildung von P. aeruginosa im Sensor zu klassischen mikrobiologischen Metho-den wie Fluoreszenz- oder Biomassenfärbung und zeigte die Eignung des Systems zur Verfolgung der Biofilmbiomasse und deren Aktivität. Nach erfolgreicher Optimierung und Validierung wurde der Sensor auf verschiedenste Anwendungs-möglichkeiten hin getestet. Beispielsweise wurde der Sensor zur Detektion aller Biofilmstadien und der Wachstumscharakterisierung verschiedenster Gram-positiver und –negativer Bakterienspezies eingesetzt und zeigte seine Verwendbarkeit für beide Bakterien-Domänen. Zusätzlich bietet der Sensor ein geeignetes mikrobiologisches Werkzeug zur Grundlagenforschung, besonders in Kombi-nation mit sensorübergreifenden Analysemethoden wie Genexpressions- und Populationsanalysen. Gerade durch die kombinierten Anwendungen dieser Techniken mit der sensorbasierten Biofilmde-tektion konnte gezeigt werden, dass sich die Expression von Attachmentgenen zwischen P. aerugino-sa- und S. maltophilia-Stämmen deutlich unterscheidet. Es wurde ermittelt, dass eine Anhaftung von P. aeruginosa hauptsächlich durch Flagellen gesteuert wird, wohingegen S. maltophilia sich Fimbri-en-bedingt anlagert. Neben der Arbeit mit Modellorganismen wurde auch eine anwendungsbezogene Biofilmüberwachung von Abwasser- oder anaeroben Biofilmen mit Hilfe des Sensorsystems getestet und bestätigte dabei die vergleichsweise hohen bakteriellen Aktivitäten in anaeroben Systemen. Des Weiteren wurden Biofilmmanipulations-Strategien basierend auf DNase, Antibiotika, Desinfekti-ons- und Reinigungsmitteln in Echtzeit untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Kombinatio-nen von EPS-Matrix-Destabilisierung und Biofilminaktivierung einen vielversprechenden Ansatz zur Biofilmentfernung darstellt. Eine alleinige Biofilm-Destabilisierung erwies sich jedoch als kritisch für ein nachfolgendes Wiederanwachsen eines Biofilms. Dies war besonders im Hinblick auf das Lang-zeitverhalten eines behandelten Biofilms relevant. Der hier entwickelte Sensor liefert zur Analyse dieses Wiederanwachsens optimale Möglichkeiten, da auch über einen längeren Zeitraum das Bio-filmbildungspotential in einer nicht-destruktiven Weise detektiert werden kann. Zusammenfassend bietet der neuentwickelte Sensor nun eine Technologie, um tiefere Einblicke in das Verständnis von Biofilmbildung zu gewinnen und daraus neue Strategien zur gezielten Bio-filmmanipulation zu entwickeln und zu testen und damit hohe Kosten einzusparen. Mit diesem Po-tential kann der Sensor nun sowohl in der Wissenschaft als auch in der Industrie seinen Einsatz finden.:1. EINLEITUNG 1.1. BIOFILME 1.1.1. Vorkommen 1.1.2. Biofilmzyklus 1.1.3. Aufbau und Bestandteile 1.1.4. Biofilmmodellorganismen Pseudomonas aeruginosa Allgemein. Biofilmbildung - Genexpression der Adhäsion und Motilität. Stenotrophomonas maltophilia Allgemein. Biofilmbildung- Genexpression der Adhäsion und Motilität. 1.1.5. Biofilm-Manipulation 1.2. BIOFILMDETEKTION UND –MONITORING 1.2.1. Biofilmsensoren 1.2.2. Elektrochemische Impedanzspektroskopie 1.2.3. Amperometrie 1.3. ZIEL DER ARBEIT 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1. MATERIAL 2.1.1. Chemikalien 2.1.2. Bakterien 2.1.3. Nährmedien, Puffer und Kits Verwendete Kits 2.1.4. Geräte, Analyse-Software und Verbrauchsmaterialien 2.2. METHODEN 2.2.1. Biosensorfertigung Elektrodenherstellung Herstellung der mikrofluidischen Kanäle Herstellung der amperometrischen Gegenelektrode Impedanzspektrummessgerät 2.2.2. Mikrobiologische Methoden Bakterien-Anzucht Fluidische Biofilmbildung im Sensor Allgemein. Spezifische Parameter. Abwasserbiofilme. Anaerobe Biofilmanzucht im Sensor. DNase Test fluidisch. Kombinatorische Tests. Statische Biofilmquantifizierung durch Kristall-Violett-Färbung Allgemein. Spezifisch. DNase Test statisch eDNA-Screening eDNA-Färbung von Biofilmen Lebend/Tot-Färbung von Biofilmen Allgemein. Motilitäts-tests 2.2.3. Molekularbiologische Methoden Nachweis von spezifischen Genabschnitten mittels PCR RNA-Isolierung und cDNA-Synthese Genexpressionsanalyse durch PAGE Genexpressionsanalyse durch qRT-PCR DNA-Isolierung im Kanal Populationsanalyse durch DGGE Populationsanalyse mittels qPCR und DNA-Sequenzing Bestimmung exoenzymatische Aktivität 2.2.4. Statistische Auswertung 3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Sensorprinzip Sensor-Design 3.1. OPTIMIERUNG, VALIDIERUNG UND CHARAKTERISIERIUNG DES SENSORS 3.1.1. Amperometrischer Sensor Optimierung Validierung 3.1.2. Impedimetrischer Sensor Optimierung Frequenzauswahl Validierung Reproduzierbarkeit 3.1.3. Eignung für verschiedenste Medien und Bakterien 3.1.4. Fließeigenschaften 3.1.5. Zusammenfassung Sensoroptimierung, Validierung und Charakterisierung 3.2. SENSOR-ANWENDUNG 3.2.1. Komplexe Biofilme Abwasserbiofilme Anaerobe Biofilme 3.2.2. Biofilm-Manipulation Abtötung von Biofilmen Destabilisierung von Biofilmen Destabilisierung durch Reinigungssubstanzen am Beispiel Tergazyme. Enzymatische Destabilisierung am Beispiel DNase. eDNA-Screening eDNA-Menge in Relation zur DNase-Effizienz eDNA-Lokalisierung Zusammenfassung eDNA-Charakterisierung Destabilisierung fluidischer Biofilme: Statische vs. fluidische DNase-Applikation Wachstumsphasen-abhängige Destabilisierung Kombinationatorische Ansätze Tergazyme und Sterillium. Stressen von Biofilmen Zusammenfassung Biofilm-Manipulation 3.2.3. Stammcharakterisierung Biofilmbildung von P. aeruginosa und S. maltophilia Statisch vs. fluidisch. Attachment- vs. Langzeitbiofilm. Biofilmbildung vs. Genexpression Anlagerungs-Gene. Biofilmbildung vs. Motilität. Zusammenfassung Stammcharakterisierung 4. FAZIT 5. LITERATUR DANKSAGUNG 6. ANHANG

Die Mechanismen von Immobilisierungsprozessen radioaktiver Schwermetall-Ionen innerhalb von Biofilmen sind noch weitgehend unerforscht. Das liegt an der Komplexität der Biofilme, welche häufig diskrete geochemische Mikromilieus bilden, die sich vom umgebenden Milieu („Bulk Solution“) in Bezug auf dessen Biozönose (der mikrobiellen Diversität), den darin herrschenden geochemischen Bedingung (z.B. Red/Ox-Potential u./o. gelöster Sauerstoffmenge), aber auch in der Konzentration möglicher Komplexbildner (z.B. Metaboliten u./o. EPS-Komponenten) deutlich unterscheiden. Alle diese Faktoren können die Speziation der Radionuklide verändern und damit auch deren Transportverhalten. Für ein besseres Prozessverständnis zu den Wechselwirkungen von Radionukliden mit natürlichen, in Uran-kontaminierten Milieus lebende Mikroorganismen und den damit verbunden Stoffen wurde die Biozönose in Biofilmen und im Grubenwasser des ehem. WISMUT-Uranbergwerkes Königstein nach klassischen mikrobiologischen- und molekularbiologischen Methoden bestimmt. Aus einem Vergleich der Chemie im Biofilm mit der Chemie der umgebenden Lösung wird der Einfluss der Biofilme auf das Migrationsverhalten von Radionukliden in der Natur beurteilt. Die Identifizierung und Quantifizierung von Prokaryoten erfolgte u.a. mit der CARD FISH Methode. Die selektive Visualisierung der EPS-Komponenten in der Matrix der Biofilme wurde mit Hilfe der Konfokalen Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) bewerkstelligt. Zur Untersuchung der Speziation von fluoreszierenden Schwermetall-Ionen wie U(VI) kam die zeitaufgelöste, laser-induzierte Fluoreszenzspektroskopie (TRLFS) zum Einsatz. Um diese Methode auch im mikroskopischen Bereich anwenden zu können, wurde sie weiter zum CLSM hin entwickelt: Da ein 80-MHz-MaiTai-Laser zur Verfügung stand, wurde durch im kHz-Bereich alternierendes Beugen des Anregungslaserstrahls von der Probe weg (und wieder zu ihr hin) mittels akusto-optischem Modulator (AOM) eine quasi-gepulste Laseranregung im kHz-Bereich erreicht. Durch Einbindung von Frequenzvervielfachern („Harmonixx“ von APE Berlin und „Inspire“ von Spectra-Physics) konnte so eine gepulste Anregung innerhalb eines breiten Wellenlängenbereiches (ca. 230-1090 nm) ermöglicht werden. Für die Auswertung des als äußerst schwach zu erwartenden Fluoreszenzsignales (entsprechend des mikroskopisch kleinen Anregungsraumes) wurde die Time-Correlated Single-Photon Counting Methode (TCSPC) – auch „zeitbezügliche Einzelphotonenzählungs-Methode“ – an das Laser-Anregungssystem angepasst. Die Fluoreszenzlebenszeitkurve des Fluoreszenzsignals von U(VI) Species, die sich an der Oberfläche von den Protozoen Euglena Mutabilis befanden, konnte z.B. auf diese Art mit Hilfe der TCSPC ermittelt werden.

In the last decade, several novel and cost-effective biological nitrogen removal technologies have been developed. The discovery of anaerobic ammonium oxidation (Anammox), about 15 years ago, has resulted in new opportunities for research and development of sustainable nitrogen removal systems. Compared to conventional nitrification/denitrification, Anammox eliminates necessity of external organic carbon source, has a smaller production of excess sludge, reduces energy demand for aeration (up to 60-90%) and CO2 emissions (up to 90%). Systems based on Anammox can be of great help to comply with stricter wastewater discharge regulations and reduce environmental problems caused by nutrients discharges (e.g. eutrophication). This thesis investigates the partial nitritation/Anammox in one stage system under oxygen limited condi-tions (also called CANON or Deammonification) and with the Moving Bed Biofilm Reactor (MBBR™) technology. Anammox process coupled with partial nitritation can be particularly suitable to treat ammo-nium-rich wastewater with low content of biodegradable organic matter, such as the reject water from dewatering of digested sludge, which is usually recirculated back to the main stream of wastewater treat-ment plants, accounting for the 15-20% of the total nitrogen load. Partial nitritation/Anammox process was successfully tested on a pilot plant scale for four months at 25°C, in a 200 L Continuous Stirred Tank Reactor (CSTR), filled with 40% of Kaldnes media (model K1). At an Ammonium Surface Load (ASL) of 3.45 gN m-2d-1, the removal rate was about 2.85 gN m-2d-1. Removal efficiencies of 95%, 85% and 83% were respectively achieved for NH4+-N, inorganic nitrogen, and Total Nitrogen (TN). Bacteria activity was followed by batch tests such as Specific Anammox Activity (SAA), Oxygen Uptake Rate (OUR) and Nitrate Uptake Rate (NUR), which revealed an increase in activi-ty for Nitrosomonas and Anammox bacteria within the biofilm. Dissolved oxygen concentration in the bulk liquid was a crucial parameter, whereas pH and conductivity turned out to be two useful monitoring tools. Two laboratory-scale reactors were previously run for two months each, in order to evaluate the one-stage partial nitritation/Anammox process with a lower ASL. One reactor was fed with diluted reject water, whereas the other one treated the effluent from UASB (Up-flow Anaerobic Sludge Blanket) reactor after sand filtration. Fairly good efficiency (>75%) were reached but, however, in the last case the low ammo-nium nitrogen load could represent a problem for a stable full-scale installation and long-term growth of Anammox bacteria. Some suggestions for full-scale implementation and further research are proposed in the last chapter of this master thesis.

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Water scarcity is an issue faced across the globe that is only expected to worsen in the coming years. We are therefore in need of methods for treating non-traditional sources of water. One promising method is desalination of brackish and seawater via reverse osmosis (RO). RO, however, is limited by biofouling, which is the buildup of organisms at the water-membrane interface. Biofouling causes the RO membrane to clog over time, which increases the energy requirement of the system. Eventually, the RO membrane must be treated, which tends to damage the membrane, reducing its lifespan. Additionally, antifoulant chemicals have the potential to create antimicrobial resistance, especially if they remain undegraded in the concentrate water. Finally, the hazard of chemicals used to treat biofouling must be acknowledged because although unlikely, smaller molecules run the risk of passing through the membrane and negatively impacting humans and the environment. It is, therefore, integral to investigate techniques for prevention of biofouling and removal of mature biofilms that are effective, less damaging to the membrane, and safe for humans and the environment. A common experimental setup is biofilm antimicrobial microdilution susceptibility tests. To acquire meaningful data from these tests, however, appropriate organisms must be tested. Manuscripts 1 investigates, via semi-systematic reviews, the question of what organisms are appropriate to represent the complexity of a biofilm in antimicrobial tests. Ultimately, we recommend utilizing the model biofilm-forming, pioneer organism, Pseudomonas aeruginosa for these studies. Biofouling studies also must present data in a useful manner to the many disciplines that are interested in preventing or removing biofouling. Our goal is to investigate both via antimicrobial microdilution susceptibility tests. In Manuscript 2 we investigate the metrics of each discipline with an interest in anti-biofouling studies. Ultimately we recommend utilizing both crystal violet stain to assess total biomass removal and the LIVE/DEAD BacLight stain to assess cell vitality (including log reduction and MIC, BPC, MBIC, MBC, BBC, and MBEC), to satisfy the metrics of all interested disciplines. Finally, in Manuscript 3 we implement the recommendations from Manuscripts 1-2 for biofilm prevention and biofilm removal antimicrobial microdilution susceptibility tests. In this manuscript, we work with a subset of safer preservatives including, methylisothiazolinone, phenoxyethanol, and sodium benzoate. We found that methylisothiazolinone was the most effective antimicrobial, however, it was not the safest. Additionally, we investigated the relationship between MBIC and BPC, which was found to vary between the preservatives. Ultimately, we have provided recommendations for biofilm antimicrobial susceptibility tests that produce widely applicable and useful metrics, as well as utilized these recommendations to investigate the efficacy of safer antimicrobials. All of this work provides a framework for which even safer and effective novel antimicrobials can be investigated. / Graduate / 2021-07-22