Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-10-01T12:29:21Z No. of bitstreams: 1 2012_JoseLuizCorreaMoraes.pdf: 1415261 bytes, checksum: 7ccca6e56251ac5c47ca3fbacd8a41b3 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-11-08T13:18:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JoseLuizCorreaMoraes.pdf: 1415261 bytes, checksum: 7ccca6e56251ac5c47ca3fbacd8a41b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-08T13:18:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JoseLuizCorreaMoraes.pdf: 1415261 bytes, checksum: 7ccca6e56251ac5c47ca3fbacd8a41b3 (MD5) / O problema da distância entre duas sequências finitas por reversões é estudado neste trabalho em uma abordagem formal e algébrica com base em um grupo de permutações onde a operação do grupo e a de conjugação são utilizadas para simular reversões. A abordagem é geral por operar com sequências genéricas que podem representar estruturas utilizadas na especificação de uma grande variedade de problemas relevantes em computação e em matemática, entre as quais se incluem os genomas. Uma estrutura de grupo foi estabelecida sobre um conjunto de famílias de sequências para possibilitar aplicar uma reversão em uma destas famílias mediante uma operação de conjugação, onde a família e uma certa permutação, atuando como um conjugador, participam como fatores ou termos. Além disso, a mesma reversão pode ser simulada pela operação do grupo utilizando, como fatores ou termos, um conjugador especial da família e a mesma permutação que, acima, atuou como conjugador. O trabalho propõe um método diferente de computar que conduz a uma maneira di- ferente de pensar no problema da distância de reversão o que, eventualmente, poderá contribuir na descoberta de respostas a questões nesta área. Os programas computacionais que utilizam reversões podem ser adaptados ao método. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The problem of sorting finite sequences by reversals is studied in this work using a formal and algebraic approach based on a group of permutations where the operation of the group and the conjugation are used to implement reversals. The approach is general in the sense that it treats generic sequences which can represent structures, used in the specification of a wide variety of relevant problems in computer science and mathematics, among them are included the genomes. A permutation group structure was established on a set of families of sequences in order to apply a reversal on one of this family through the operation of conjugation, where the family and one certain permutation, acting as a conjugator, participate as factors or terms. Moreover, the same reversal may be applied by means the group operation using, as factors or terms, a special conjugator of the family and the same permutation, above mentioned, that served as conjugator. The work proposes a different method of computing resulting in a different way of thinking about the reversal distance problem which may possibly contribute to find answers in this area. Computer programs that use reversals can be adapted for the method.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-11-28T12:00:31Z No. of bitstreams: 1 2012_ViniciusDanielFerreiraBatista.pdf: 1512646 bytes, checksum: e4fb096aa8b82d64fbc0c08c52e23512 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-12-03T14:18:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ViniciusDanielFerreiraBatista.pdf: 1512646 bytes, checksum: e4fb096aa8b82d64fbc0c08c52e23512 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-03T14:18:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ViniciusDanielFerreiraBatista.pdf: 1512646 bytes, checksum: e4fb096aa8b82d64fbc0c08c52e23512 (MD5) / O sistema de expressão Pichia pastoris tem sido utilizado com sucesso na produção de uma grande variedade de proteínas heterólogas. Esta levedura reúne características como fácil manipulação molecular, crescimento celular rápido, capacidade de realizar modificações pós-traducionais e secreção eficiente de proteínas, além de atingir altas densidades celulares com grande produção da proteína heteróloga. O objetivo deste estudo foi construir um vetor de expressão em P. pastoris para produção de proteína heteróloga, reunindo elementos genéticos que possibilitem a seleção de transformantes com multicópias integradas, buscando aumentar o nível de expressão. Nesse sentido, foi utilizado o vetor comercial pPICZαA (Invitrogen) que teve seu gene de resistência Sh ble substituído pelo gene kanR, derivado do transposon Tn 903, alterando a resistência ao antibiótico zeocina para o antibiótico G418. Elevadas concentrações deste antibiótico podem ser utilizadas para a seleção de clones com alto número de cópias integradas. Após troca da marca de seleção, foram clonados no vetor um promotor do gene constitutivo glicolítico PGK1 (PPGK1) de P. pastoris, um sinal de secreção fator α de acasalamento de Saccharomyces cerevisiae - com códons otimizados para P. pastoris - e um novo sítio múltiplo de clonagem. Para analisar a capacidade de produzir uma proteína heteróloga, o gene da pró-quimosina B de Bos taurus foi clonado no vetor e mostrou-se capaz de coagular leite no teste de atividade. Novos elementos genéticos podem ser clonados no vetor a fim de aumentar a frequência de integração genômica, como uma porção repetitiva do DNA de P. pastoris - que servirá como alvo da integração - e o gene defectivo leu2-d de S. cerevisiae para uso de marca auxotrófica. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Pichia pastoris expression system has been successfully used in the production of a wide variety of heterologous proteins. This yeast combines characteristics such as easy molecular handling, rapid cell growth, capacity to carry out post-translational modifications and efficient secretion. In addition, it can achieve high cell densities with high production of the heterologous protein. The aim of this study was to create a new P. pastoris vector using genetic elements that allow the selection of multicopy transformants aiming to increase heterologous expression. We used the commercial vector pPICZαA (Invitrogen) as a platform to replace the native Sh ble gene by kanR , derived from transposon Tn5, and, thus, changing antibiotic resistance from zeocin to G418. High concentrations of the former antibiotic can be used to select clones with high number of integrated copies. Next, we cloned the promoter of the constitutive glycolytic gene PGK1 (PPGK1) from P. pastoris, the α mating factor signal sequence of Saccharomyces cerevisiae - with codons optimized for P. pastoris - and a new multiple cloning site. To analyze the ability to produce a heterologous protein, the bovine chymosin B was cloned and successfully secreted as judged by milk coagulating test. Furthermore, we began the construction of a new vector based on the auxotrophic leu-2d marker from S. cerevisiae which should enable the selection of multiple events of integration in the genome of a LEU2-null strain of P. pastoris.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-11-03T16:49:34Z No. of bitstreams: 1 Lorena da Silveira Derengowski.pdf: 1542481 bytes, checksum: cb6123102a20bb711c1f94f71d3a369d (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:31:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Lorena da Silveira Derengowski.pdf: 1542481 bytes, checksum: cb6123102a20bb711c1f94f71d3a369d (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorena da Silveira Derengowski.pdf: 1542481 bytes, checksum: cb6123102a20bb711c1f94f71d3a369d (MD5) Previous issue date: 2006 / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. O mecanismo mais importante de defesa do hospedeiro contra infecções por P. brasiliensis é a resposta imunológica celular. Esse fungo é capaz de sobreviver e se replicar no interior de macrófagos murinos e humanos, revelando a existência de mecanismos que permitam a sobrevivência no ambiente inóspito do fagossomo da célula hospedeira. Em concordância com essa habilidade de P. brasiliensis em sobreviver nesse ambiente de carência nutricional, estresse oxidativo e baixo pH, análises do transcriptoma desse fungo revelam ortólogos a potenciais genes de virulência de outros microrganismos patogênicos. Nesse contexto, esse trabalho descreve a análise da expressão de potenciais genes de virulência de P. brasiliensis por RT-PCR. Visando a avaliar a expressão dos genes icl1 (isocitrato liase) e mls1 (malato sintase), que codificam as enzimas do ciclo do glioxalato, leveduras de P. brasiliensis foram crescidas em condições que potencialmente mimetizam às encontradas no interior do fagossomo, substituindo-se glicose por acetato como única fonte de carbono. Os resultados sugerem um significativo aumento na expressão de icl1 e mls1 quando do cultivo do fungo em meio contendo apenas acetato. A mesma análise foi feita para os genes ady2, que codifica uma permease de acetato, e icl2, que parece codificar outra isoforma da enzima isocitrato liase. Entretanto, os resultados indicam que os genes ady2 e icl2 de P. brasiliensis são regulados independentemente das fontes de carbono utilizadas nesse trabalho. Ainda, a expressão de ure1 (urease) foi analisada quando do cultivo de P. brasiliensis em pH ácido. Esses experimentos não mostraram uma regulação do gene ure1 desse fungo dependente de pH. Adicionalmente, esse trabalho descreve, pela primeira vez, experimentos de RT-PCR utilizando RNA extraído de leveduras de P. brasiliensis após 6 horas de co-cultura com macrófagos murinos. Os resultados mostram um aumento no nível de expressão dos genes icl1, mls1 e ady2, quando comparada à expressão por células crescidas em meio convencional. Essas observações indicam claramente que P. brasiliensis utiliza o ciclo do glioxalato como uma importante via metabólica alternativa para produção de energia, como observado para outros fungos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the ethiologic agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. The most important mechanism of host defense against P. brasiliensis infection is cell-mediated immune response. This fungus is able to survive and replicate within the phagossome of murine and human macrophages, revealing that it have evolved mechanisms allowing its survival within the phagocytic cells, which are considered an inhospitable habitat. In agreement with the ability to survive in this nutritionally poor, oxidative stress and low pH environment, the analysis of P. brasiliensis transcriptome revealed several putative orthologs to virulence genes of other human facultative intracellular pathogenic microorganisms. In this context, this work describes the analysis of putative virulence genes expression by RT-PCR. In order to evaluate the expression of glyoxylate cycle genes, icl1 (isocitrate lyase) and mls1 (malate synthase), the yeast form of P. brasiliensis was grown in media mimicking the phagossome millieu, in which glucose was replaced by acetate as a sole carbon source. The results suggests a significantly increase in the icl1 and mls1 expression when this fungus was grown in media with acetate as the only carbon source. The same analyzis was performed for ady2 gene, that encode an acetate permease, and icl2 gene, that probably encodes another putative isoform of isocitrate lyase enzyme. However, the results indicate that ady2 and icl2 genes of P. brasiliensis are not regulated by these different carbon sources used in this work. On the other hand, the expression of ure1 (urease) was analyzed in this work when P. brasiliensis yeast cells were grown in acid pH, mimicking the phagossome environment. These experiments don’t show a pHdependent regulation by ure1 gene of this fungus. In addition, this work describes for the first time RT-PCR experiments using RNA extracted from yeast cells recovered from murine macrophages after 6 hours of co-culture. The results show the higher levels of icl1, mls1 and ady2 gene expression when compared to cells grown in conventional media. These observations clearly indicates that P. brasiliensis uses the glyoxylate cycle as an important alternative energetic metabolism pathway, as observed for other fungi.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-11-13T22:24:33Z No. of bitstreams: 1 2006_Rosângela Vieira de Andrade.pdf: 1964649 bytes, checksum: 02d5cbead8298816e470ce3372c02313 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-02-25T23:59:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Rosângela Vieira de Andrade.pdf: 1964649 bytes, checksum: 02d5cbead8298816e470ce3372c02313 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-25T23:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Rosângela Vieira de Andrade.pdf: 1964649 bytes, checksum: 02d5cbead8298816e470ce3372c02313 (MD5) Previous issue date: 2006-06 / Paracoccidioides brasiliensis, um fungo dimórfico, termo-regulado, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica de alta prevalência na América Latina. Presume-se que a sua patogenicidade seja uma conseqüência do processo de diferenciação celular, da forma de micélio para a de levedura, que ocorre neste fungo durante a infecção humana. O presente trabalho iniciou-se com o Projeto Genoma Funcional e Diferencial do P. brasiliensis, no qual foram seqüenciadas 25.597 Expressed Sequence Tags (ESTs). Destas, 19.718 ESTs possuíam PHRED 20 e foram agrupadas em 6.022 grupos (genes), dos quais 2,655 eram contigs (grupos com mais de uma EST) e 3,367 eram singlets (grupos com apenas uma EST). Os 6,022 grupos representam aproximadamente 80% do genoma estimado deste fungo. Estes genes foram anotados e categorizados funcionalmente (MIPS) de acordo com o processo celular no qual estavam envolvidos: virulência (28 genes), genes potencialmente envolvidos em alvos para drogas (17 genes), vias de transdução sinal (37 genes), transportadores tipo MDR (multidrugs resistence) (20 genes), genes de choque térmico (48 genes) e estresse oxidativo (23 genes), entre outros. Genes diferencialmente expressos em células de micélio e levedura foram identificados usando duas metodologias de análises da expressão gênica em larga escala: subtração in silico e microarranjos de cDNA. A subtração in silico foi baseada no cálculo do número de ESTs de micélio e de levedura em cada contig. Contigs formados por 100% da mesma forma ou por um número maior de ESTs em uma das fases foram considerados diferencialmente expressos. Esta análise indicou 417 genes diferencialmente expressos, sendo 178 de micélio e 239 de levedura. Para os microarranjos de cDNA, 1.152 genes foram selecionados, sendo 565 contigs formados por 6 ou mais ESTs de micélio e levedura, 39 contigs formados por 2, 3, 4 ou 5 ESTs exclusivos de micélio ou levedura e 548 singlets que apresentavam anotação funcional. Nos microarranjos, os fragmentos de cDNA foram amplificados por PCR e hibridados com RNA total das duas formas. Destes genes, 328 mostraram-se diferencialmente expressos, sendo 58 de micélio e 270 de levedura. Estas duas estratégias identificaram 110 genes diferencialmente expressos em micélio e levedura. Dentre estes, foram selecionados para análise os genes classificados em três categorias MIPS. Na categoria metabolismo, foram selecionados 12 genes, sendo 5 (icdh, scs, tal, adk, udk) mais expressos em micélio e 7 (icl, acylcs, pdh, adh, papsr, aca, amt) mais expressos em levedura. Na categoria metabolismo e transporte de íons, foram selecionados 5 genes, sendo 2 (chs, ats) da via de síntese de novo de cisteína do metabolismo de enxofre e 3 (isc, ktp, pct) envolvidos no transporte de íons. Na categoria controle e organização celular - parede celular, membrana e citoesqueleto, foram selecionados 5 genes: ags, pcd, vrp bgl e hex. O caráter diferencial de todos estes genes foi confirmado por experimentos de northern blot. Estas análises mostraram que: células de micélio apresentam uma tendência para o metabolismo aeróbico enquanto um metabolismo anaeróbico é sugerido para as células de levedura; a super expressão em levedura dos genes que codificam as enzimas ATP sulfurilase, APS quinase, PAPS redutase e coline sulfatase, pertencentes ao metabolismo de enxofre, mostram a importância do enxofre orgânico para os processos de crescimento e diferenciação deste patógeno; a expressão diferencial de genes envolvidos na organização celular é essenciais para o processo de diferenciação celular, virulência e conseqüentemente patogenicidade de P. brasiliensis. Neste contexto, o conjunto das informações geradas neste trabalho fornece novos caminhos para o entendimento da transição dimórfica do P. brasiliensis, bem como identifica novos genes importantes para a virulência/patogenicidade deste fungo, que constituem potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Alexandre Marinho Pimenta (alexmpsin@hotmail.com) on 2009-11-16T20:16:00Z No. of bitstreams: 1 2006_MárciodeCarvalhoMoretzsohn.pdf: 1215656 bytes, checksum: f2e2c88e48af0d2dda769d96b02350f0 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2009-12-07T19:35:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_MárciodeCarvalhoMoretzsohn.pdf: 1215656 bytes, checksum: f2e2c88e48af0d2dda769d96b02350f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-07T19:35:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_MárciodeCarvalhoMoretzsohn.pdf: 1215656 bytes, checksum: f2e2c88e48af0d2dda769d96b02350f0 (MD5) Previous issue date: 2006 / O amendoim cultivado (Arachis hypogaea) é uma cultura importante, amplamente cultivada nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. É bastante susceptível a diversos estresses bióticos e abióticos, para os quais muitas das espécies silvestres são resistentes. Como um primeiro passo visando a introgressão desses genes de resistência no amendoim cultivado, um mapa de ligação foi construído, usando uma população F2, obtida do cruzamento entre duas espécies silvestres diplóides de genoma AA (A. duranensis e A. stenosperma). Esse mapa foi baseado em marcadores microssatélites e marcadores âncoras, ambos codominantes e transferíveis entre espécies aparentadas. Um total de 271 novos marcadores microssatélites foi desenvolvido no presente trabalho, a partir de bibliotecas genômicas enriquecidas para microssatélites, de bibliotecas de etiquetas de seqüências expressas (ESTs ou “expressed sequence tags”) e por mineração (“data mining”) de seqüências disponíveis no GenBank. Para facilitar o desenvolvimento dos marcadores a partir de um grande número de seqüências, foi utilizado um módulo de programas desenvolvido em parceria com a Universidade Católica de Goiás e com a Universidade Católica de Brasília. Esse módulo integra um programa para busca de microssatélites (TROLL), um conjunto de programas para agrupamento e processamento das seqüências (Staden package) e um terceiro programa, para desenho de primers (Primer3). Com isso, o desenvolvimento dos marcadores pôde ser automatizado, tornando o processo bem mais rápido e eficiente. Dos 271 novos marcadores microssatélites, 66 mostraram-se polimórficos para o amendoim cultivado e 62 deles foram utilizados para análise das relações genéticas entre acessos representando as seis variedades botânicas descritas de A. hypogaea. Os resultados obtidos foram consistentes com a classificação taxonômica atual, exceto para as variedades fastigiata/peruviana e fastigiata/aequatoriana, que formaram um grupo separado e distante das outras duas variedades da subespécie fastigiata. Os 271 novos marcadores microssatélites, além de outros 218 publicados ou em publicação para o amendoim foram testados, usando-se os dois progenitores. Desses 489 marcadores microssatélites, 215 (44,0%) mostraram-se polimórficos, sendo 181 codominantes e 34 dominantes (amplificaram alelos nulos em um dos progenitores). Os 99 marcadores microssatélites codominantes que não apresentaram distorções da segregação 1:2:1 esperada (p<0,05), junto aos 40 2 marcadores âncoras não distorcidos (de um total de 72), foram utilizados para o estabelecimento dos grupos de ligação. Em seguida, os marcadores distorcidos e os dominantes foram incluídos no mapa. Usando um LOD escore mínimo de 11, 182 marcadores microssatélites, 66 marcadores âncoras e 12 RGAs foram mapeados em 10 grupos de ligação, como esperado, uma vez que Arachis duranensis e A. stenosperma são espécies diplóides com 2n=20 cromossomos. Um comprimento de mapa total igual a 1645,1 cM foi obtido, com uma distância média de 6,32 cM entre marcadores. Esse mapa foi utilizado para o mapeamento de QTLs que controlam três características de interesse para o melhoramento do amendoim. Dez QTLs que controlam o peso de sementes, oito QTLs que controlam o número de sementes produzidas por planta e dois QTLs para resistência ao fungo causador da mancha preta (Cercosporidium personatum) foram significativamente identificados pelo método de mapeamento por intervalo múltiplo. Esse é o primeiro mapa baseado em marcadores microssatélites desenvolvido para Arachis. Além disso, os primeiros QTLs para componentes da produtividade e para resistência à mancha preta foram mapeados em Arachis spp. Uma vez que a maioria dos marcadores microssatélites utilizados foi desenvolvida a partir de ESTs e de bibliotecas genômicas digeridas com enzimas de restrição sensíveis a metilação, mais da metade dos marcadores mapeados, incluindo os marcadores âncoras, são provavelmente gênicos. Os grupos de ligação identificados nesse trabalho, as ordens dos marcadores obtidas e os QTLs mapeados estão sendo validados em outras populações de mapeamento, visando a construção de um mapa de referência para Arachis e a obtenção de estimativas mais robustas sobre os QTLs identificados, para uso dessas informações nos programas de melhoramento do amendoim. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cultivated peanut (Arachis hypogaea) is an important crop, widely grown in tropical and subtropical regions of the world. It is highly susceptible to several biotic and abiotic stresses to which wild species are resistant. As a first step towards the introgression of these resistance genes into cultivated peanut, a linkage map was constructed, using an F2 population obtained from a cross between two diploid wild species with AA genome (A. duranensis and A. stenosperma). The map was based on microsatellite and anchor markers that are both codominant and transferable among related species. A total of 271 new microsatellite markers were developed in the present study from SSR-enriched genomic libraries, ESTs, and by “data-mining” sequences available in GenBank. To aid the development of microsatellite markers from a great number of sequences, a module, developed in collaboration with the Catholic University of Goiás and the Catholic University of Brasília, was used. This module integrates a program for the detection of microsatellites (TROLL), the Staden Package for the assembly and processing of sequences, and a software for primer design (Primer3). By using this module, the SSR marker development was automated, and the process proved to be fast and efficient. Of the 271 new SSR markers, 66 were polymorphic for cultivated peanut and 62 were used for the genetic relationship analysis of accessions representing the six described botanical varieties of A. hypogaea. Results were consistent with the actual taxonomic classification, except for the fastigiata/peruviana and fastigiata/aequatoriana varieties, which formed a separated group, distant from the other two fastigiata varieties. The 271 new markers plus another 218 published or being published for peanut were screened against both progenitors. A total of 215 (44.0%) were polymorphic, with 181 codominant and 34 dominant markers (amplified null alleles in one of the progenitors). The 99 codominant markers segregating 1:2:1 (p<0.05) plus the 40 non-distorted anchor markers (of a total of 72 markers) were initially used to establish the linkage groups. Distorted and dominant markers were subsequently included in the map. By using a minimum LOD score of 11 and a maximum recombination fraction of 0.35, 182 microsatellite markers, 66 anchor markers and 12 RGAs mapped in 10 linkage groups, as expected, since A. duranensis and A. stenosperma are diploid species with 2n=20 chromosomes. A total map distance of 1645.1 cM was obtained, with an average distance of 6.32 cM between markers. This map was used 4 for the mapping of QTL for three traits of interest for the peanut breeding programs. Ten QTL controlling seed weight, eight QTLs for seed number and two QTLs for resistance against the fungus C. personatum were significantly mapped by using the multiple interval mapping method. This is the first microsatellite-based map published for Arachis. Moreover, the first QTLs for yield components and for resistance to late leafspot were mapped in Arachis spp. Because most markers used were derived from ESTs and genomic libraries made using methylation sensitive restriction enzymes, more than a half of the markers, including the anchor markers, are genic. Linkage group ordering and the mapped QTL are being validated in other mapping populations, with the aim of constructing a transferable reference map for Arachis and to obtain more robust estimates about the mapped QTL for use in the peanut breeding programs.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-24T21:07:45Z No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado TULIO CESAR FERREIRA.pdf: 2124486 bytes, checksum: 5d88203c3a807e8558cc3f19e1451b12 (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2009-11-26T14:58:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado TULIO CESAR FERREIRA.pdf: 2124486 bytes, checksum: 5d88203c3a807e8558cc3f19e1451b12 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-26T14:58:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado TULIO CESAR FERREIRA.pdf: 2124486 bytes, checksum: 5d88203c3a807e8558cc3f19e1451b12 (MD5) Previous issue date: 2006 / O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) é um regulador central da resposta à mudanças na concentração de oxigênio e tem um papel importante nos processos fisiológicos e patológicos em humanos. Este fator de transcrição é expresso quando as células de mamíferos são submetidas à condições de hipóxia e ativa cerca de 70 genes alvos regulados por oxigênio. HIF-1 é uma proteína heterodimérica composta por dois membros da família de proteínas contendo o domínio basic helix-loop-helix (bHLH)-PER-ARNT-SIM (PAS), HIF-1α (atua unicamente na resposta à hipóxia) e o HIF-1β (também conhecido como translocador nuclear do receptor de aril hidrocarbono, ARNT, que é constitutivamente expresso). A estabilidade e a atividade do HIF-1α são reguladas por modificações pós-traducionais, tais como fosforilação, hidroxilação, nitrosilação e acetilação. Sob normóxia, HIF-1α é constitutivamente expresso e subsequentemente hidroxilado pela HIF prolil hidroxilase (HPH) levandoo a ser rapidamente marcado para a degradação mediada pelo proteasoma. A seqüência de eventos que leva a ativação do HIF-1α e os efeitos paradoxais do HIF- 1 (efeitos pro- e anti-apoptóticos) não são completamente entendidos. Também não estão claros como os mecanismos dependentes e independentes de oxigênio que contribuem para as modificações pós-traducionais do HIF-1α, translocação nuclear, heterodimerização com o ARNT, ligação ao DNA em regiões regulatórias cis de genes alvos e recrutamento de cofatores. Portanto, as proteínas que interagem com o HIF-1α e as modificações pós-traducionais precisam ser melhor entendidas. Células de leveduras compartilham vários aspectos de sua bioquímica com os organismos multicelulares tais como, respostas transcricionais e celulares e mecanismos de modificações pós-traducionais de proteínas. Além disso, elas são fáceis de manipular sob diferentes condições de laboratório. Este trabalho visou avaliar a viabilidade da expressão do HIF-1 na levedura Saccharomyces cerevisiae como um modelo alternativo de expressão. Em células de leveduras, HIF-1 não é alvo de degradação sob condições de normóxia, já que esse microorganismo não possui a via de degradação mediada pelo von Hippel Lindau (proteína supressora de tumor). Pretendemos usar esse modelo de expressão para estudar as modificações pós-traducionais do HIF-1α e sua interação com outras proteínas que possam afetar sua dimerização/co-ativação, sob diversas condições. Estabelecemos então uma linhagem de levedura que expressa o HIF-1α e o ARNT constitutivamente sob condições normais de oxigênio. Também mostramos que o HIF-1α recombinante humano foi capaz de formar o heterodímero com o ARNT e se ligar ao elemento responsivo a hipóxia (HRE) da eritropoietina humana. Além disso, nós descrevemos a presença desse motivo no genoma de levedura e mostramos que esse organismo pode conter motivos HRE funcionais. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is a central regulator in the response to changes in oxygen concentration and plays an important role in physiological and pathological processes in humans. This transcription factor is expressed when mammalian cells are subjected to hypoxia and activates transcription of over 70 oxygen-regulated target genes. HIF-1 is a heterodimeric protein composed of two members of the basic helix-loop-helix (bHLH)-containing PER-ARNT-SIM (PAS) domain family, HIF-1α (unique to the hypoxia response) and HIF-1β (also known as the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT, which is constitutively expressed). HIF-1α stability and activity are regulated by post-translational modifications such as phosphorylation, hydroxylation, nitrosation and acetylation. Under normoxia, HIF-1α is constitutively expressed and subsequently hydroxylated by a HIF prolyl hydroxylase (HPH) causing it to be rapidly targeted for proteasomemediated degradation. The sequence of events that leads to the full activation of HIF- 1α and the paradoxical effects of HIF-1 (pro- and anti-apoptotic effects) are not completely understood. Neither is clear how oxygen-dependent nor oxygenindependent mechanisms contribute to the post-translational modifications of HIF-1α, nuclear translocation, heterodimerization with ARNT, DNA binding to the cisregulatory region of target genes and recruitment of cofactors. Therefore, HIF-1α interacting partners and the pos-translational modifications need to be better elucidated. Yeast cells share several aspects of its biochemistry with multicellular organism such as, transcriptional and cellular responses and mechanisms of protein post-transcriptional modifications. In addition they are easy to manipulate under different laboratory conditions. This work aimed to evaluate the viability of HIF-1 expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae as an alternative expression model. In yeast cells, HIF-1 may not be targeted to degradation under normoxic conditions, since this microorganism lacks the pathway mediated by the von Hippel Lindau-VHL (a tumor suppressor protein). We intend to used this expression model to study the post-translational modifications and its interaction with other proteins that may affect its dimerization/co-activation. We established a yeast strain overexpressing HIF-1α and ARNT in a constitutive manner under normal conditions of oxygen. We also showed that recombinant HIF-1α was able to form a heterodimer with ARNT and bind to human erythropoietin hypoxia responsive element (HRE) motif. Additionally, we described the presence of this motif in the yeast genome and showed that this organism may harbor HRE motifs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-02T19:14:30Z No. of bitstreams: 1 2009_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 1487096 bytes, checksum: d710a5d028048014f75d9399e8d27530 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-03-02T22:57:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 1487096 bytes, checksum: d710a5d028048014f75d9399e8d27530 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-02T22:57:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 1487096 bytes, checksum: d710a5d028048014f75d9399e8d27530 (MD5) Previous issue date: 2009 / O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM) – a micose sistêmica mais comum na América Latina. O tratamento é prolongado e traz severos efeitos secundários. Além disso, a resistência a medicamentos usados tem sido demonstrada em P. brasiliensis. O farnesol, conhecido componente de óleos essenciais, exerce um papel crítico no quorum-sensing e na virulência de Candida albicans. Dados da literatura relataram um efeito antimicrobiano do farnesol para diversos microrganismos. O efeito fungicida deste composto, bem como seu papel no retardo da transição dimórfica do isolado Pb18, pertencente à espécie críptica S1 de P. brasiliensis, foi descrito recentemente por nosso grupo de pesquisa. Neste trabalho estendemos esta análise para representantes de outras espécies crípticas, o isolado Pb01 do grupo “Pb01-like” e o isolado Pb3 do grupo PS2. Em concordância com nossos estudos prévios, confirmamos o efeito fungicida para estes dois outros isolados de P. brasiliensis. A concentração inibitória mínima (MIC90) de farnesol, que inibe 90% do crescimento de P. brasiliensis, tanto para o isolado Pb01 quanto para o isolado Pb3 é de 20μM, enquanto a concentração letal mínima (MLC90) de farnesol para o isolado Pb01 é de 30μM e para o isolado Pb3 é de 40μM. Neste trabalho, analisando o efeito do farnesol na transição dimórfica dos isolados Pb01 e Pb3, observamos que este também retarda a transição de levedura para micélio destes dois isolados. Diante da expectativa de uso deste sequisterpeno como um adjuvante terapêutico, analisamos o seu efeito em associação com alguns antifúngicos empregados no tratamento da PCM. Nossos dados indicam uma ausência de efeito sinergístico entre o farnesol e os antifúngicos da família dos azóis (fluconazol e cetoconazol), além de um possível efeito protetor para o fungo quando associado a uma dada faixa de concentração (0,0312 a 0,125μg/mL) de anfotericina B. Estes resultados sugerem, fortemente, que o farnesol não deve ser utilizado como um adjuvante terapêutico no tratamento da PCM sistêmica. Uma vez que dados da literatura descreveram a indução de apoptose em Aspergilus nidulans pelo farnesol, analisamos a expressão de alguns genes de P. brasiliensis relacionados a este processo. Nenhuma alteração significativa no padrão de expressão dos genes analisados foi observada. No entanto, ainda não podemos descartar a possível ativação deste processo de morte celular em P. brasiliensis em resposta ao tratamento com farnesol. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM) – the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Its treatment is usually long and frequently results in several side effects. Besides, some isolates of P. brasiliensis have developed resistance to many of the anitimicribial agents used. Farnesol, a known component of essential oils, is a quorumsensing molecule and a virulence factor of Candida albicans. It was demonstrated that farnesol exerts an antimicrobial activity in a number of microorganisms. The fungicide effect of this compound, as well as its role in the delay of the dimorphic transition in the isolate Pb18, belonging to the S1 cryptic species of P. brasiliensis, has been recently describe by our research group. In this work, we expanded our analyzes to other cryptic species of P. brasiliensis found in Brazil, namely the isolates Pb01 from “Pb01-like” group and Pb3 from the PS2 cryptic species. In accordance to our previous results, we confirmed the fungicide effect of farnesol in the other two isolates of P. brasiliensis. The minimum inhibitory concentration (MIC90) of farnesol, the concentration that inhibits 90% of growth, was 20μM for both isolates, while the minimum lethal concentration (MLC90) of farnesol were 30μM and 40μM for the isolates Pb01 and Pb3, respectively. Additionally, in this study it was also analyzed the effect of farnesol on the dimorphic transition of the isolates Pb01 and Pb3, which results also reveal that farnesol promotes a delay in the transition from yeast to mycelium of these isolates. Based on its fungicide activity, the use of farnesol has been proposed as a possible adjuvant in the treatment of bacterial and fungal diseases. In this sense, we analysed its effect in association with some fungicides commonly used in the treatment of PCM. Nonetheless, we found an absence of synergism between farnesol and the azole family of fungicides (fluconazole and ketoconazole). Curiously, a protective effect to the fungus was observed when farnesol was associated to amphotericin B in concentrations of 0,0312 to 0,125μg/mL. These results suggest that farnesol should not be used as therapeutic adjuvant in the treatment of PCM. The effect of farnesol as an apoptosis inducer in Aspergillus nidulans was described. In this context, we analysed the expression of some P. brasiliensis’ genes related to the process of programmed cell death. Although no significant alteration was observed in the gene expression pattern, the possible role of farnesol in inducing apoptosis in P. brasiliensis cannot be ruled out.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-17T13:48:49Z No. of bitstreams: 1 2009_ArnubioValenciaJimenez.pdf: 1332526 bytes, checksum: 5d99a28ecacddcd233c64d4de0727188 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-03-24T12:05:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_ArnubioValenciaJimenez.pdf: 1332526 bytes, checksum: 5d99a28ecacddcd233c64d4de0727188 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-24T12:05:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_ArnubioValenciaJimenez.pdf: 1332526 bytes, checksum: 5d99a28ecacddcd233c64d4de0727188 (MD5) Previous issue date: 2009-04 / Sementes do feijão (Phaseolus coccineus) foram analisadas pela presença e atividade do inibidor de amilase (-AI). Por meio do uso de anticorpos policlonais gerados contra o inibidor -AI-1 do feijão comum (P. vulgaris), foi possível detectar polipeptídios típicos deste inibidor (Mr. 14 18 kDa), além do polipeptídeo de 32 kDa. Os resultados encontrados nos testes de inibição permitem sugerir que o inibidor presente nas sementes de P. coccineus 35590 seria o melhor candidato para a transformação genética do café visando à geração de plantas com resistência a larvas da broca-do-café. A digestão proteolítica in vitro do inibidor puro causou uma perda rápida da sua atividade inibitória, afetando seriamente sua capacidade natural de interagir com as -amilases. Também, neste trabalho foram estudadas as propriedades das -amilases presentes no trato digestivo de larvas de Tecia solanivora, um inseto-praga que gera um dano importante à batata (Solanum tuberosum). O inseto tem no mínimo três isoformas principais de -amilases digestivas, as quais apresentaram pontos isoelétricos de 5.30, 5.70 e 5.98. A atividade da -amilase digestiva tem um pH ótimo entre 7.0 e 10.0, com um pico de atividade em pH 9.0. A enzima foi inibida por inibidores de natureza protéica presentes nas sementes de P. coccineus (70% de inibição) e de P. vulgaris cv Radical (87% de inibição) em pH 6.0. Os resultados mostram também que o inibidor de - amilase de amaranto pode ser o melhor candidato para gerar batatas modificadas geneticamente resistentes a este inseto-praga. Futuras pesquisas precisam ser desenvolvidas para esclarecer se estes inibidores de -amilase são resistentes às proteases presentes no trato digestivo da lagarta de batata, T. solanivora. Em um ensaio subseqüente, foi desenvolvido e testado um novo e sensível método espectrofotométrico para a detecção da atividada leucine aminopeptidase (-aminoacyl-peptide hydrolase, EC 3.4.11.1) proveniente do trato digestivo de larvas de Telchin licus (Lepidoptera: Castniidae), fazendo uso do substrato L-leucyl-2- naphthylamide. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Seeds of scarlet runner bean (Phaseolus coccineus L.) were analyzed for -amylase inhibitor (-AI) activity. By using polyclonal antibodies raised against pure a−AI-1 from common bean (Phaseolus vulgaris L.) it was possible to detect the typical -AI polypeptides (Mr 14 -18 kDa) as well as a large polypeptide of Mr 32,000 Da. Differential inhibition curves lead us to suggest that the gene encoding one of the inhibitors in P. coccineus (in accession G35590) would be a good candidate for genetic engineering of coffee resistance towards the coffee berry borer Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Scolytidae). An in vitro proteolytic digestion treatment of pure a−AI−1, resulted in a rapid loss of the inhibitory activity, seriously affecting its natural capacity to interact with mammalian -amylases. In addition, the properties of the digestive -amylase from T. solanivora larvae, an important insect pest of potato (Solanum tuberosum), were studied. This insect has three major digestive -amylases with isoelectric points 5.30; 5.70 and 5.98 respectively, which were separated using native and isoelectric focusing gels. The -amylase activity has an optimum pH between 7.0 and 10.0 with a peak at pH 9.0. The enzyme was inhibited by proteinaceous inhibitors from P. coccineus (70% inhibition) and P. vulgaris cv. Radical (87% inhibition) at pH 6.0. The results show that the -amylase inhibitor from Amaranthus may be a better candidate to make genetically modified potatoes resistant to this insect. However, it is necessary to know if these -amylase inhibitors are resistant to the gut proteases from T. solanivora. On the other hand, a simple and sensitive spectrophotometric assay to determine the activity of leucine aminopeptidase (-aminoacyl-peptide hydrolase, EC 3.4.11.1) from insect intestinal tracts of Telchin licus (Lepidoptera: Castniidae), using L-leucyl-2- naphthylamide as substrate, was developed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2010-03-25T19:07:34Z No. of bitstreams: 1 2009_HugoCostaPaes.pdf: 1466586 bytes, checksum: 1606d978954121d718e5bb816fef2e6e (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T13:59:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_HugoCostaPaes.pdf: 1466586 bytes, checksum: 1606d978954121d718e5bb816fef2e6e (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T13:59:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_HugoCostaPaes.pdf: 1466586 bytes, checksum: 1606d978954121d718e5bb816fef2e6e (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / O presente trabalho foi o primeiro a caracterizar o fator de choque térmico (Hsf) em um fungo patogênico para humanos. O gene de Paracoccidioides brasiliensis isolado 01 (Pb01) teve sua seqüência determinada e analisada por ferramentas de bioinformática. Constatou-se que os domínios regulatórios da proteína são divergentes dos de Saccharomyces cerevisiae e similares aos de outros membros da superclasse Eurotiomycetidae, sugerindo especialização evolutiva. O cistron do Hsf de Pb01 foi clonado num vetor epissomal de expressão em S. cerevisiae, e a clonagem do plasmídio resultante na levedura foi capaz de resgatar a perda do gene nativo, que normalmente seria letal. Isso comprova que a proteína de P. brasiliensis reteve seu papel funcional. Uma varredura computacional de promotores de Pb01, em busca de elementos de resposta ao choque térmico (HSE), resultou na constatação de que uma diversidade de genes maior que a vista em levedura contém HSEs em suas regiões regulatórias, embora sejam necessários estudos funcionais para confirmar esse achado. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work is the first to characterise the heat shock factor (Hsf) in a fungal pathogen of humans. The gene of Paracoccidioides brasiliensis isolate 01 (Pb01) had its sequence determined and analysed by bioinformatics tools. Its regulatory domains are distinct from those of the Hsf from Saccharomyces cerevisiae and similar to those of other Eurotiomycetidae, suggesting evolutionary specialisation. The cistron of the Pb01 Hsf was cloned into an episomal expression vector for S. cerevisiae, and the final construct was able to rescue the otherwise lethal loss of the native gene in yeast, thus proving that the Pb01 protein retained its function. A computational screening of Pb01 promoters for heat shock 7 elements (HSE) showed that a greater proportion of genes contains these regulatory regions than in budding yeast. However, functional studies will be necessary to confirm this finding.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-12T19:24:52Z No. of bitstreams: 1 2009_MarcioMandelliLorenzoni.pdf: 3831224 bytes, checksum: 3001c54fd129f0a73cc6293a06a30627 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-06T19:42:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MarcioMandelliLorenzoni.pdf: 3831224 bytes, checksum: 3001c54fd129f0a73cc6293a06a30627 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-06T19:42:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MarcioMandelliLorenzoni.pdf: 3831224 bytes, checksum: 3001c54fd129f0a73cc6293a06a30627 (MD5) Previous issue date: 2009-07 / As Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) correspondem a um grupo heterogêneo e pouco caracterizado quando comparado aos demais patotipos de E. coli. O fato de algumas linhagens descritas serem patogênicas e outras não geram dúvidas sobre a classificação precisa deste grupo. Contribui para isso, o fato de ainda não existir qualquer marcador molecular específico para genes de virulência de DAEC. Alguns patógenos da mucosa intestinal fazem uso do Sistema de Secreção Tipo Três (TTSS) para a injeção de proteínas efetoras em células alvo. Neste trabalho, utilizando linhagens de DAEC isoladas de crianças diarréicas do DF, realizamos experimentos de PCR com iniciadores definidos a partir de genes do TTSS da linhagem E23468/69 de EPEC. Assim, foram sintetizados iniciadores dirigidos às seqüências rorf1, cesAB, escR, escT e sepQ. Análises de similaridade revelaram escores de até 100% entre alguns dos produtos obtidos e linhagens de EPEC, EHEC, STEC. Foi possível identificar o fragmento de DNA referente ao provável gene escR completo, bem como de seqüências de DNA extremamente conservadas da rorf1, cesAB, escT e sepQ. Os produtos das amplificações correspondentes aos prováveis genes do TTSS foram clonados, para a criação de um banco de seqüências, visando futuras análises. Devido ao êxito na detecção de alguns prováveis genes do TTSS em nossas amostras e, uma vez que a expressão de genes do TTSS ainda não foi relatada em DAEC, experimentos visando analisar a expressão desses prováveis genes foram realizados por meio de RT-PCR, empregando RNA isolado de linhagens de DAEC em culturas submetidas a condições de indução dos genes do TTSS. Tal abordagem nos permitiu demonstrar que houve transcrição dos prováveis genes escN, escR e escT, apesar dos resultados divergirem um pouco em relação às amostras e genes testados. Nossas análises indicaram claramente a presença e a expressão dos prováveis genes do TTSS em duas das amostras de DAEC analisadas. Estudos complementares deverão ser realizados a fim de avaliarmos a funcionalidade deste sistema de secreção e os resultados obtidos certamente contribuirão na elucidação dos mecanismos de virulência deste ainda controverso patotipo. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The diffusely adhering Escherichia coli (DAEC) is a heterogeneous group and less characterized when compared to other pathotypes of E. coli. The fact that some strains are pathogenic and others not, creates doubts about the exact classification of this group. Contributes to it, the lack of molecular markers corresponding to the virulence genes of DAEC. Some intestinal pathogens use the Type Three Secretion System (TTSS) to inject effector proteins into target cells. In this study, using strains of DAEC originated from diarrheic children of DF, we performed PCR experiments employing primers based on genes of the TTSS of EPEC strain E23468/69, directed to the sequences rorf1, cesAB, escR, escT and sepQ. DNA analyses revealed similarity scores of 100% between some of the products and EPEC, EHEC and STEC strains. It was possible to detect the presence of a DNA fragment corresponding to the complete escR gene, as well as highly conserved DNA sequences homologous to rorf1, cesAB, escT, and sepQ. The amplification products corresponding to the probable TTSS genes were cloned in order to create a database of sequences, to be submitted to further analyses. The success obtained in detecting probable TTSS genes in our samples and, since the expression of genes of the TTSS has not yet been reported in DAEC, experiments were performed in order to examine the expression of these candidate genes by means of RNA extraction and reverse transcription procedures of cultures grown under TTSS genes induction conditions. This approach allowed us to conclude that the escN, escR and escT genes were transcribed, although the results differ somewhat among the samples and genes tested. Our analyses clearly showed the presence and expression of TTSS genes in two samples of DAEC. Additional studies should be conducted to assess the functionality of this secretion system, and the results certainly help in elucidating the mechanisms of virulence of this still controversial pathotype.