Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-05Bitstream added on 2014-06-13T18:06:56Z : No. of bitstreams: 1 silva_fr_me_sjrp.pdf: 350193 bytes, checksum: 3c820db2a3d1863e41f00f641e837ec6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho apresenta autovalores de energia para o potencial de Lennard-Jones (12,6) (um tipo de potencial de força central) e para o íon molecular H+2 , ambos confinados em cavidades esféricas e elípticas, respectivamente. Esses sistemas também foram estudados sem confinamento. Os resultados foram obtidos através da asssociação entre o Método Variacional e a Mecânica Quântica Supersimétrica, cabendo a supersimetria determinar as funções de onda variacionais. A Aproximação de Born-Oppenheimer é utilizada para simplificar o problema molecular, proporcionando a sua separação em duas partes: uma eletrônica e outra nuclear. Os resultados obtidos para a dinâmica eletrônica da molécula apresentaram um valor de confinamento onde o sistema é mais estável. Por fim, são discutidas possíveis aplicações para sistemas envolvendo sítios ativos de proteínas / This work presents the energy eigenvalues for the Lennard-Jones (12.6) potential )a type of central force potential) and molecular ion H+2, both confined in spherical and eliptical cavities, respectivelly. Those systems werw also studied without confinement. The results wre obtained through th Variation Method and Supersymmetric Quantum Mechanics association, allowing the supersymmetry determine the varational wave functions. The Born-Oppenheimer Aproximation is utilized to simplify the molecular problem, providing its separation in two parts: one electronic and other nuclear. The obtained results to the electronic dynamics of molecule presented a confinement value the system is more stable. Finally, possible applications for systemas involving protein active are discussed

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-05-22Bitstream added on 2014-06-13T19:28:40Z : No. of bitstreams: 1 martinati_ja_me_rcla.pdf: 362018 bytes, checksum: 52f2a691f2a1ec67ccf4b3cf6fda2d9e (MD5) / Linhagens de Xylella fastidiosa de diferentes hospedeiros, incluindo citros, café, pêssego, videira entre outros, foram utilizadas para construir uma relação filogenética a partir da análise de seqüências completas de nucleotídeos do espaço intergênico 16S-23S rDNA. Dadas as dificuldades encontradas frente ao uso dos primers utilizados para o sequenciamento da região genômica em questão, fez-se necessária a construção de novos primers baseada em dados após alinhamento e comparação com as seqüências disponibilizadas pelo NCBI e com as obtidas neste trabalho. Os primers propostos previamente para amplificação da região 16S-23S em Xylella fastidiosa, foram também testados sem muito sucesso uma vez que produzem fragmentos muito extensos e, para a obtenção de seqüências adequadas seria necessário o uso de outras técnicas moleculares mais dispendiosas para obtenção da seqüência completa, o que levaria tempo e custo maiores. Os métodos utilizados tanto para alinhamento de seqüências bem como a construção da árvore filogenética são baseados no princípio cladístico. As seqüências completas do espaço intergênico obtidas, revelaram um nível de variação de bases maior do que a encontrada em seqüências do gene 16S do mesmo organismo (99,0 a 100%), com valores de similaridade que variam em torno de 80 a 100%. A linhagem originada de plantas de pêra, que apresentou uma maior discrepância nos valores, foi tomada como um grupo externo aos dos outros hospedeiros. Baseado no cladograma apresentado, os resultados revelaram que as linhagens de citros e café puderam ser separadas quando se usa o método cladístico de análise, já pela metodologia baseada em princípios fenéticos esta separação não foi possível. Foi possível também agrupar os isolados em três... . / The phylogenetic relationships among Xylella fastidiosa isolates from different hosts were studied, using primers specific for the 16S-23S rDNA intergenic spacer region. Strains isolated from a wide range of host plants were studied - citrus, coffee, grapevine, elm, periwinkle, and others. Current methods for sequencing the 16S-23S spacer regions are laborious because of the large fragment obtained when using the specific primers. Nevertherless, the sequences obtained with this primers did not contribute with significant information, as only partial sequences were obtained. It's necessary other methods to complement in order to obtain a complete sequence of the spacer region. This methods include cloning and the use of internal primers. In order to establish an easier method to sequencing the spacer region, were constructed a new primer pair to facilitated the sequencing and the sequences obtained was complete. The 16S-23S intergenic spacer region analysis showed a higher level of variation than that found in 16S sequences, with similarity values ranging from 80% to 100%. The pear strain, that showed the most variable values, was used as the outgroup. The cladogram constructed by using cladistic methods allowed the grouping of three major clusters: the citrus-coffee-some grapevines- mulberry, the periwinkle-ambrosia, and the others hosts. The citrus and coffee strains could be phylogeneticly separated from this method while by the 16S sequences and the 16S-23S by the phenetic method they couldn't. A phenogram based on similarity data is useful for observing relationships based on share characters. However, its does not necessarily represent the evolutionary histry of the taxa. With the cladistic approach, hypothetical genealogical relationships among Xylella fastidiosa strains... (Complete abstract, click electronic address below).

Orientador : Prof. Dr. Francisco Filipak Neto / Co-orientador : Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: O aumento das atividades antropogênicas vem sendo causa de uma crescente eutrofização dos ambientes aquáticos, levando a floração de cianobactérias, dentre as quais algumas produtoras de cianotoxinas potencialmente tóxicas à vida animal e à saúde humana. Desta forma, fazem-se necessárias a avaliação dos principais danos causados pelas toxinas assim como a investigação os mecanismos de toxicidade da cilindrospermopsina (CYN) em células. Particularmente, modelos in vitro empregando a linhagem de hepatocarcinoma humano (HepG2) são importantes para a investigação dos mecanismos de toxicidade das cianotoxinas nas células. O objetivo do presente estudo foi investigar as respostas de células HepG2 frente à exposição a diferentes concentrações da cilindrospermopsina (CYN) através de ensaios de viabilidade celular; atividade das enzimas de biotransformação de fase II (Glutationa S-transferase - GST); sistema de resistência a multidrogas (MDR); ambiente redox celular, quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio; danos oxidativos a biomoléculas; e alterações na morfologia das células. Além disso, determinou-se se a indução de isoformas do citocromo P450 aumenta a sensibilidade das células à CYN e avaliou-se a expressão diferencial de proteínas (proteoma). A CYN não se apresentou tóxica na concentração de 10 ?g l-1, levando a um aumento da viabilidade e toxicidade celular em células cultivadas com 10% de soro bovino fetal (SBF). A redução da concentração de SBF para 2% e a indução das isoformas do citocromo P450 (CYP) tornaram o metabolismo das células HepG2 mais próximas das células "normais". Após a indução, poucos parâmetros foram alterados, como a peroxidação lipídica. No entanto, baixas concentrações de CYN (inferior ou igual a 10 ?g l-1) induziram um aumento da proliferação e toxicidade celular. Analisando o proteoma das células expostas a CYN, identificaram-se 26 proteínas, as quais estão envolvidas em diferentes processos biológicos como enovelamento de proteínas, efluxo de xenobióticos, defesa antioxidante, metabolismo energético, anabolismo, sinalização, potencial tumorigênico e estrutura do citoesqueleto. Este perfil de proteínas indica que a exposição à CYN leva a um aumento da absorção e oxidação da glicose para proporcionar energia às células responder ao estresse químico. Aumento da proteína G (GPCRs), heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) e dos níveis das espécies reativas de oxigênio (EROs) podem estar provocando o aumento da proliferação celular, e aumento do potencial tumorigênico das células HepG2. O excesso de espécies reativas de oxigênio ativou mecanismos de proteção celular como a multidrug resistance protein (MRP3) e a glutationa peroxidase. As alterações provocadas pela CYN nas proteínas do citoesqueleto também podem estar associadas com a proliferação celular bem como a reposição das proteínas danificadas pelas EROs. Palavras-chave: cianotoxina, cilindrospermopsina, HepG2, CYPs, proteômica, imunofluorescência / Abstract: The increase of anthropogenic activities has been causing eutrophication of aquatic environments, leading to bloom of cyanotoxin-producer cyanobacteria that can thread wildlife and human health. The evaluation of the toxic effects and the mechanisms of toxicity of cyanotoxins such as cylindrospermopsin (CYN) are important issues in toxicology. For these purposes, cell lines such as human hepatocellular carcinoma (HepG2) are very useful in vitro models. The aim of the current study was to investigate the responses of HepG2 cells after exposure to different concentrations of CYN through assays of cell viability; activities of glutathione S-transferase (GST, a phase II biotransformation enzyme) and the efflux transporters involved in multidrug resistance phenotype (MDR); oxygen and nitrogen reactive species levels; oxidative damage to biomolecules; and alterations of cell morphology. In addition, the possibility of increased toxicity to CYN due to cytochrome P450 (CYP) induction and the differential expression of proteins (proteome) have been investigated. CYN at 10 ?g l-1 was not toxic to HepG2 cells, leading to increased cell viability and metabolism in cells cultured with 10% fetal bovine serum (FBS). Decrease of FBS concentration to 2% and induction of CYP isoforms have made HepG2 cells more sensitive to exposure to CYN. After induction, few parameters have changed, e.g., lipid peroxidation. However, CYN at low concentrations (bellow or equal 10 ?g l-1) has induced increases of cell proliferation and metabolism. A total of 26 proteins have been differentially expressed in CYN-exposed cells versus control. These proteins are involved in different biological processes like protein folding, xenobiotic efflux, antioxidant defense, energy metabolism, anabolism, cell signaling, tumorigenic potential and cytoskeleton structure. This protein profile indicates that the exposure to CYN leads to an increased absorption and breakdown of glucose as to provide energy for the cells to respond to chemical stress. Increased G protein (GPCRs), nuclear ribonucleoprotein heterogeneous (hnRNP) and the levels of reactive oxygen species (ROS) may be associated with increased cell proliferation, and increased tumorigenic potential of HepG2 cells. The excess ROS has activated cellular protection mechanisms such as MRP3 and glutathione peroxidase. The changes caused by CYN in cytoskeletal proteins may also be associated with cell proliferation as well as replacement of proteins damaged by ROS. Keywords: cyanotoxin, Cylindrospermopsin, HepG2, CYP, proteomics, immunofluorescence

Orientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Banca: Francisco Javier Medrano Martin / Banca: Beatriz Amaral de Castilho / Resumo: Em um rastreamento por duplo-híbrido, dois parceiros físicos de eIF5A foram identificados: Dys1 e Lia1 (Ligante de eIF5A). Lia1 foi identificada mais tarde como desoxihipusina hidroxilase. As interações físicas evidenciadas por duplo-híbrido foram confirmadas por copurificação. Mapeamento do sítios de ligação de eIF5A revelou que ambos os domínios N- e C-terminal podem ligar-se a Dys1, enquanto que o domínio Cterminal é suficiente para a ligação com Lia1. Pela primeira vez foi demonstrado in vivo que a estrutura secundária em -hélice, presente na extremidade N-terminal da proteína Dys1, pode modular a atividade da enzima através do impedimento estérico da entrada do substrato eIF5A no sítio ativo. Experimentos de inativação gênica mostraram que, em contraste com eIF5A e Dys1, Lia1 não é essencial para a viabilidade celular. Superexpressão do gene LIA1 não suprime o fenótipo temperatura-sensível de mutantes condicionais de eIF5A. Além disso, os alelos de TIF51A não são sinteticamente letais com a deleção de LIA1. Assim como previamente demonstrado para a enzima humana DOHH, o ferro também é essencial para a atividade hidroxilásica de Lia1. O sítio ativo de Lia1 é compreendido pelos resíduos de aminoácidos H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 e E271. A proteína recombinante é uma mistura de formas ligada e não ligada ao metal, as quais foram separadas por gel nativo ou gel filtração, sugerindo um raio hidrodinâmico maior para a apoenzima. A forma mais alongada adotada por Lia1 na ausência do metal foi confirmada por ensaios de "quenching" da fluorescência do triptofano por acrilamida e SAXS. Além da alteração conformacional e inativação da enzima, a perda do metal levou à maior instabilidade de Lia1 na desnaturação térmica ou química. Os resultados obtidos em conjunto mostram que, além de manter a estabilidade da proteína...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In a two-hybrid screen, two eIF5A binding partners were identified: Dys1 and Lia1 (Ligand of eIF5A). Lia1 was further identified as deoxyhypusine hydroxylase. The two-hybrid interactions were confirmed by GST pulldown. Mapping binding sites for these proteins revealed that both eIF5A domains can bind to Dys1, whereas the C-terminal domain is sufficient to bind Lia1. We demonstrate for the first time in vivo that the N-terminal α-helix of Dys1 can modulate enzyme activity by impairing eIF5A interaction. Gene disruption studies showed that, in contrast to the essential nature of eIF5A and Dys1, Lia1 is not essential for cell viability. Overexpression of LIA1 gene does not suppress temperature-sensitivity of eIF5A mutants. Moreover, these TIF51A alleles are not synthetically lethal with a knockout strain of LIA1. Recently, It was shown that LIA1 encodes the enzyme responsible for the final step of hypusine formation, the metalloenzyme deoxyhypusine hydroxylase. As the hydroxylation step in hypusine synthesis is not required for eIF5A activity, lack of genetic interactions between these two genes is expected. As previously demonstrated for the human enzyme DOHH, iron is also essential for Lia1 hydroxylase activity. Lia1 active site is formed by aminoa cid residues H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 and E271. The recombinat protein is a mixture of iron-bound and iron-free forms, which were separated by native gel or gel filtration, suggesting a bigger hydrodynamic radius for the apoenzyme. The elongated shape adopted by Lia1 in the absence of the metal was confirmed by acrylamide quenching of tryptophan intrinsic fluorescence and SAXS. In addition to the conformational change and enzyme inactivation, loss of iron led to higher instability of Lia1 during thermal or chemical unfolding. Taken together, the results show that, besides the ability of iron to keep the stability of the protein...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Claudio de Oliveira / Banca: Lurdes Foresti de Almeida Toledo / Banca: Adriane Pinto Wasko / Resumo: A família Callichthyidae apresenta cerca de 177 espécies distribuídas na região Neotropical e está dividida em duas subfamílias: Callichthyinae e Corydoradinae. Os peixes dessa família apresentam uma notável radiação evolutiva associada a muitos eventos de rearranjos cromossômicos, inclusive com exemplos de poliploidia. A subfamília Callichthyinae compreende os gêneros Callichthys, Dianema, Hoplosternum, Megalechis e Lepthoplosternum. As relações entre os cinco gêneros representantes de Callichthyinae foram estudadas com base em caracteres morfológicos e moleculares e, atualmente, duas hipóteses bastante conflitantes são disponíveis sobre suas relações. Com o objetivo de testar as hipóteses sobre as relações entre os gêneros e espécies da subfamília Callichthyinae e propor uma nova hipótese de consenso para o grupo, foram seqüenciados os genes mitocondriais 12S rRNA, 16S rRNA e ND4 e o gene nuclear Siah. Ainda que as diferentes filogenias obtidas pelos métodos de Neighbor-Joining, Máxima Parcimônia e Máxima Verossimilhança não tenham sido todas congruentes, foi confirmada a posição basal de Dianema em relação aos demais da subfamília discordando dos dados morfológicos existentes. Os dados sugerem uma possível relação mais estreita de parentesco entre Dianema e Hoplosternum. Exemplares de Hoplosternum encontrados na Venezuela diferem das amostras encontradas no Brasil, indicando a possível existência de novas espécies nesse gênero. A espécie Megalechis picta encontrada na Venezuela difere dos demais exemplares encontrados no Brasil, podendo sugerir a ocorrência de uma nova espécie na bacia do rio Orinoco. As espécies Megalechis picta e Lepthoplosternum pectorale formam um grupo monofilético e este é grupo irmão da espécie M. thoracata. Nas espécies do gênerol... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Não disponível. / Mestre

Orientador: Elso Drigo Filho / Banca: Frederico Vasconcellos Prudente / Banca: Regina Maria Ricotta / Resumo: Este trabalho apresenta autovalores de energia para o potencial de Lennard-Jones (12,6) (um tipo de potencial de força central) e para o íon molecular H+2 , ambos confinados em cavidades esféricas e elípticas, respectivamente. Esses sistemas também foram estudados sem confinamento. Os resultados foram obtidos através da asssociação entre o Método Variacional e a Mecânica Quântica Supersimétrica, cabendo a supersimetria determinar as funções de onda variacionais. A "Aproximação de Born-Oppenheimer" é utilizada para simplificar o problema molecular, proporcionando a sua separação em duas partes: uma eletrônica e outra nuclear. Os resultados obtidos para a dinâmica eletrônica da molécula apresentaram um valor de confinamento onde o sistema é mais estável. Por fim, são discutidas possíveis aplicações para sistemas envolvendo sítios ativos de proteínas / Abstract: This work presents the energy eigenvalues for the Lennard-Jones (12.6) potential )a type of central force potential) and molecular ion H+2, both confined in spherical and eliptical cavities, respectivelly. Those systems werw also studied without confinement. The results wre obtained through th Variation Method and Supersymmetric Quantum Mechanics association, allowing the supersymmetry determine the varational wave functions. The "Born-Oppenheimer Aproximation" is utilized to simplify the molecular problem, providing its separation in two parts: one electronic and other nuclear. The obtained results to the electronic dynamics of molecule presented a confinement value the system is more stable. Finally, possible applications for systemas involving protein active are discussed / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-25Bitstream added on 2014-06-13T19:18:38Z : No. of bitstreams: 1 mehanna_mn_me_botib.pdf: 704117 bytes, checksum: 7f41f23c47d6efbfb7cdff064584bd65 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste trabalho é analisar as espécies do gênero Trichomycterus presentes na sub bacia do rio Cuiabá, drenagem do rio Paraguai, através de analises morfológicas e moleculares, e um breve ensaio sobre o complexo de espécies T. brasi/iensis através de análises moleculares. Os resultados obtidos foram divididos em duas partes: na primeira parte são apresentados os resultados das análises morfológicas e moleculares dos exemplares de Trichomycterus, e uma análise da morfologia externa de T. johnsoni; e na segunda parte são apresentadas as análises moleculares de alguns espécimes que pertencem ao complexo de espécies T. brasi/iensis. Foram identificadas quatro novas espécies, T. sp. n1, T. sp. n2, T. sp. n3, T. sp. n4 que divergem entre elas pelo seguintes conjuntos de caracteres, respectivamente: Número de odontóideos na placa pré-opercular (9 versus 20-22 versus 17-18 versus 14); número de odontóideos na placa inter-opercular (16-17 versus 27-31 versus 21-25 versus 22-25); T. sp. n1 diverge de seus congêneres pelo número de raios na nadadeira peitoral (i+6 versus i+5). O número de raios da nadadeira anal permite diferenciar T. sp. n1 (ii+4) de T. sp. n2 (ii+5) e T. sp. n3 (ii+5) e T. sp. n4 (ii+6), sendo essa caráter compartilhado entre T. sp. n2 e T. sp. n3. As espécies compartilham o número de raios da nadadeira dorsal (ii+7), o número de raios da nadadeira caudal (i+11 +i), e o número de raios na nadadeira pélvica. Com relação aos canais laterosensorias, T. sp. n1 e T. sp. n3 apresentaram a ausência do canal infra-orbital i1 e i3. Nas análises osteológicas, a única variação encontrada entre as espécies citadas (com exceção de T. sp. n4) foi a formação da nadadeira pélvica, em relação a estruturas dos ossos pélvicos e do processo mesial. Nas análises moleculares foi amplificado e sequenciado parte do gene mitocondrial Citocromo... / The objective of this work is analyze the Trichomycterus species presents in the Cuiabá river sub basin, Paraguay river drainage, through morphologic and molecular analyze, and make a briefing essay species complex of T. brasi/iensis with molecular analyses. The results had been divided in two parts: in the first part are presented the results of the morphologic and molecular analyses of Trichomycterus, and an analysis of the external morphology of T. johnsoni; e in the second part is presented the molecular analyses of some specimens that comprise to the species complex of T. brasiliensis. The species had been identified to four new species, T. sp. n1, T. sp. n2, T. sp. n3 and T. sp. n4, that they diverge between them for the following characters: Number of odontodes in the opercular plate (9 versus 20-22 versus 17-18 versus 14); number of odontodes in the Interopercular plate (16-17 versus 27-31 versus 21-25 versus 22-25); T. sp. n1 diverge of ali species for the number of rays in the pectoral fins (i+6 versus i+5). The number of rays of the anal fins allows differente in T. sp. n1 (ii+4) of T. sp. n2 (ii+5) and T. sp. n3 (ii+5) and T. sp. n4 (ii+6), being this character shared between T. sp. n2 and T. sp. n3. Ali species share the number of rays of the dorsal fins (ii+ 7), the number of caudal fins rays (i+11 +i), and the number of the pelvic fins rays. With regard to the laterosensory canais, T. sp. n1 and T. sp. n3 had presented the absence of the infra-orbital canais i1 and i3. In the osteology analyses, the only variation of ali species cited (with exception of T. sp. n4) was the pelvic fins, where the variation of the pelvic bones structures and the mesial process diverge between them. In the molecular analyses it was amplified and sequence part of the mitochondrial gene Citocromo Oxidase I sub-unit, and was elaborated a matrix with 634 pb. The dendogram with method UPGMA with... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-02-24Bitstream added on 2014-06-13T19:39:35Z : No. of bitstreams: 1 mariguela_tc_me_botib.pdf: 1059906 bytes, checksum: beb489c9117c02f141120280dc139192 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A família Callichthyidae apresenta cerca de 177 espécies distribuídas na região Neotropical e está dividida em duas subfamílias: Callichthyinae e Corydoradinae. Os peixes dessa família apresentam uma notável radiação evolutiva associada a muitos eventos de rearranjos cromossômicos, inclusive com exemplos de poliploidia. A subfamília Callichthyinae compreende os gêneros Callichthys, Dianema, Hoplosternum, Megalechis e Lepthoplosternum. As relações entre os cinco gêneros representantes de Callichthyinae foram estudadas com base em caracteres morfológicos e moleculares e, atualmente, duas hipóteses bastante conflitantes são disponíveis sobre suas relações. Com o objetivo de testar as hipóteses sobre as relações entre os gêneros e espécies da subfamília Callichthyinae e propor uma nova hipótese de consenso para o grupo, foram seqüenciados os genes mitocondriais 12S rRNA, 16S rRNA e ND4 e o gene nuclear Siah. Ainda que as diferentes filogenias obtidas pelos métodos de Neighbor-Joining, Máxima Parcimônia e Máxima Verossimilhança não tenham sido todas congruentes, foi confirmada a posição basal de Dianema em relação aos demais da subfamília discordando dos dados morfológicos existentes. Os dados sugerem uma possível relação mais estreita de parentesco entre Dianema e Hoplosternum. Exemplares de Hoplosternum encontrados na Venezuela diferem das amostras encontradas no Brasil, indicando a possível existência de novas espécies nesse gênero. A espécie Megalechis picta encontrada na Venezuela difere dos demais exemplares encontrados no Brasil, podendo sugerir a ocorrência de uma nova espécie na bacia do rio Orinoco. As espécies Megalechis picta e Lepthoplosternum pectorale formam um grupo monofilético e este é grupo irmão da espécie M. thoracata. Nas espécies do gênerol...

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-08-14T11:27:23Z No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatriciaBravoChaucanes_Parcial.pdf: 2199963 bytes, checksum: 32f34de0fb4306a0e65e2ee1e766bf95 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-08-14T11:58:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatriciaBravoChaucanes_Parcial.pdf: 2199963 bytes, checksum: 32f34de0fb4306a0e65e2ee1e766bf95 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-14T11:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatriciaBravoChaucanes_Parcial.pdf: 2199963 bytes, checksum: 32f34de0fb4306a0e65e2ee1e766bf95 (MD5) / As infecções fúngicas invasivas configuram um problema grave de saúde pública, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Mais de 90% de todas as mortes relacionadas com fungos procedem de espécies que pertencem aos gêneros: Cryptococcus, Candida, Aspergillus e Pneumocystis. A Criptococose é causada pelo fungo encapsulado Cryptococcus neoformans, que causa doença pulmonar e pode-se espalhar amplamente no cérebro e pele; afeta cerca de um milhão de pessoas anualmente e mata cerca de 650.000. A virulência desse fungo é mediada por vários fatores, como a presença de uma cápsula polissacarídica anti-fagocítica e a indução de enzimas antioxidantes tais como peroxidases e catalases. Estes mecanismos antioxidantes de defesa se mostram importantes, não só para a resistência às espécies reativas, mas também para a sobrevivência em hospedeiros mamíferos. Estas enzimas antioxidantes, importantes para a virulência, podem servir como alvos excelentes para a terapia antifúngica. O gene TRR1 é essencial em C. neoformans e, codifica para a enzima citoplasmática tioredoxina redutase. Esta proteína tem um papel importante na manutenção redox da célula e é parte do complexo chamado sistema tioredoxina, no qual participam a tioredoxina (Trx), tioredoxina redutase (Trr) e NADPH, protegendo as células contra o estresse oxidativo e nitrosativo. Algumas drogas estão disponíveis para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas ou superficiais, contudo, existe apenas um número limitado de agentes antifúngicos eficazes (anfotericina B e o fluconazol para tratar a criptococose), muitos deles com efeitos secundários tóxicos e indesejáveis. Além disso, a resistência aos antifúngicos representa uma limitação nas atuais terapias utilizadas, demonstrando uma necessidade urgente de uma nova geração de agentes antifúngicos. No presente trabalho, a expressão heteróloga, purificação e caracterização enzimática de Trr1 e seu substrato Trx1 do fungo patogênico C. neoformans foram realizados. Os genes TRR1 e TRX1 de C. neoformans (H99) foram expressos em Escherichia coli via estratégia recombinante. Os fragmentos gênicos foram obtidos por meio da montagem de genes sintéticos inseridos no vetor pET21a para a produção como proteínas de fusão na forma solúvel. Os produtos expressos foram purificados por cromatografia de afinidade em coluna de níquel e detecção por western-blot e foi possível identificar uma banda de ̴ 39 kDa e outra de ̴ 12 kDa, correspondentes às proteínas recombinantes Trr1 e Trx1. A análise de atividade enzimática da proteína Trr1 recombinante foi realizada por ensaios de cinética enzimática. Os parâmetros cinéticos Vmáx e Km foram determinados variando a concentração de Trx1 de 0.25 μM até 15 μM. Como resultado a velocidade de reação foi aumentando gradualmente à medida que a concentração xiv de substrato crescia, mostrando assim a capacidade da Trr1 em reduzir Trx1. Este trabalho possibilitou a produção das proteínas recombinantes com atividades biológicas esperadas, proporcionando quantidades necessárias para a realização de estudos estruturais tridimensionais (3D). Como resultado preliminar foi identificado o crescimento dos cristais para a proteína recombinante Trx1 de C. neoformans, em presencia do agente precipitante sulfato de amônio 2 M pelo método de difusão de vapor em gota sentada. A partir do refinamento das condições será possível encontrar uma solução ideal para a difração dos cristais de cada proteína. Diante dos resultados obtidos pelo nosso grupo, na proposta maior do projeto principal: “Pós-genoma de fungos patogênicos humanos visando o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas”, este trabalho encontra-se inserido nesta linha de pesquisa para a obtenção de novas moléculas candidatas que inibam a atividade da proteína tioredoxina redutase, especificamente na viabilidade do fungo patogênico C. neoformans. Embora estas moléculas tenham sido selecionadas por varredura virtual de quimiotecas, uma metodologia in silico, os resultados in vitro feitos previamente em nosso grupo já apontaram o potencial destas moléculas como antifúngicos para o gênero Paracoccidioides spp. Em parceria com pesquisadores da França foi predita a estrutura da proteína Trr1 de C. neoformans por modelagem molecular por homologia. A partir da varredura virtual de quimiotecas foram selecionadas 4 moléculas inibitórias do banco Life Chemicals que interagem com os modelos de Trr1 obtidos para C. neoformans (Anexo). Os testes in vitro para validar tais inibidores potenciais estão sendo realizados em nosso laboratório, com intuito de desenvolver novas drogas para o tratamento de infecções fúngicas de relevância mundial, e gerar informações básicas da estrutura e função desta proteína. / Invasive fungal infections constitute a major public health problem, especially in immunocompromised patients. Over 90% of all deaths related to fungi come from species belonging to the genera Cryptococcus, Candida, Aspergillus and Pneumocystis. Cryptococcosis is caused by Cryptococcus neoformans, an encapsulated fungus that causes lung disease and can spread widely in the brain and skin, affects about one million people each year and kills about 650,000. The virulence of this fungus is mediated by several factors such as the presence of an anti-phagocytic polysaccharide capsule, and the induction of antioxidant enzymes such as peroxidases and catalases. These antioxidant defense mechanisms have been shown to be important not only for resistance to reactive species but also for survival in the mammalian host. These antioxidant enzymes important for virulence may serve as excellent targets for antifungal therapy. The TRR1 gene is essential and encodes the cytoplasmic thioredoxin reductase enzyme. This protein has a role in maintaining the redox balance of the cell and forms part of a complex called thioredoxin system, which contains thioredoxin (Trx), thioredoxin reductase (Trr) and NADPH, protecting cells against oxidative and nitrosative stress. Some drugs to treat systemic and superficial fungal infections are available; however, there is only a limited number of effective antifungal agents (amphotericin B and fluconazole to treat cryptococcosis) many of them are toxic and present undesirable secondary effects. Furthermore, drug resistance is a limitation on current therapy used, demonstrating an urgent need for a new generation of antifungal agents. In this study, heterologous expression, purification and enzymatic characterization of Trr1 and its substrate Trx1 of the fungal pathogen C. neoformans were performed. The TRX1 and TRR1 genes of C. neoformans (H99) were expressed in Escherichia coli using recombinant strategy. The gene fragments were obtained by assembling synthetic genes and these were inserted into pET21a vector for production as fusion proteins in soluble form. The expressed products were purified by affinity chromatography on nickel column and detected by western blot. It was possible to identify a band of ̴ 39 kDa and another of ̴ 12 kDa corresponding recombinant proteins Trr1 and Trx1. The enzymatic activity of the recombinant protein Trr1 was confirmed by assays of enzyme kinetics. The kinetic parameters Km and Vmáx were determined by varying the Trx1 concentration of 0.25 μM to 15 μM. As a result the reaction rate was gradually increased as the substrate concentration, showing the ability of Trr1 to reduce Trx1. In conclusion, this work shows a viable system for the production of recombinant proteins providing amount necessary to perform three-dimensional structural studies (3D). As a preliminary result crystal xvi growth for recombinant protein, Trx1 of C. neoformans was identified in the presence of sulfate 2M as the precipitant agent. From the refinement of the conditions will be possible to find an ideal solution for diffraction of crystals of each protein. Considering the results obtained by our group, most of the main project proposal: "Post-genome of human pathogenic fungi aiming the development of new antifungal drugs," this work is inserted in this line of research for obtaining new candidate molecules that inhibit the activity of thioredoxin reductase protein, specifically on the viability of the pathogenic fungus C. neoformans. Although these molecules have been selected for virtual screening library, a methodology in silico, in vitro results previously made in our group have pointed out the potential of these molecules as antifungal in the Paracoccidioides genus. In collaboration with researchers from France, the structure of the protein Trr1 of C. neoformans was predicted by molecular homology modeling. From the virtual screening library, four inhibitory molecules that interact with the Trr1 models obtained for C. neoformans were selected from Life Chemicals database (Appendix). Currently in vitro tests to validate these potential inhibitors are being carried out in our laboratory, aiming at developing new drugs for the treatment of fungal infections of global significance, and generating basic information on the structure and function of this protein.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biología Celular Programa de Pós-graduação em Biología Molecular, 2013. / Submitted by Flávia Renata Santos Gasparotto (flavia.gasparotto@gmail.com) on 2014-08-20T15:15:22Z No. of bitstreams: 1 2013_Thaina de Almeida Lima.pdf: 3712308 bytes, checksum: 37656dfe6751626b9aa10a3be5dfb69d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-08-21T14:05:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_Thaina de Almeida Lima.pdf: 3712308 bytes, checksum: 37656dfe6751626b9aa10a3be5dfb69d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-21T14:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_Thaina de Almeida Lima.pdf: 3712308 bytes, checksum: 37656dfe6751626b9aa10a3be5dfb69d (MD5) / O câncer é classificado como uma doença crônica degenerativa, com evolução prolongada e progressiva se não sofrer interferência em alguma de suas fases, e configura-se como um grande problema de saúde pública tanto nos países desenvolvidos como nos países em desenvolvimento. A relação entre câncer e o sistema imune começou a ser explorada no começo do século XX na Alemanha, quando foi sugerido que os carcinomas poderiam ser suprimidos pelo sistema imune. Antígenos do tipo câncer/testis (ACTs) são uma classe única de antígenos que ocorrem naturalmente em alguns tecidos imunoprivilegiados e em células carcinogênicas; dentre eles, pode-se destacar NY-ESO-1, um ACT associado a diversos tipos de malignidades que é capaz de desencadear resposta imune tanto celular quanto humoral, o que o tornou um dos candidatos mais promissores ao desenvolvimento de estratégias imunoterapêuticas. A produção de NY-ESO-1, em sua forma integral e em grandes quantidades, é imprescindível para a aquisição de maiores informações acerca de seu modo de ação e subsequente exploração de seu potencial, e o desenvolvimento de sistemas de produção heteróloga estáveis e seguros são fundamentais. Este trabalho propôs a utilização de tabaco e soja como biofábricas para o acúmulo deste importante antígeno em sua forma integral e completamente livre de fusões e tags de purificação, a fim de oferecer uma alternativa estável, segura para uso em humanos e de custo mais baixo. Dentre os sistemas utilizados, apenas a expressão em sementes de soja apresentou expressão e acúmulo da proteína-alvo, chegando a um nível de expressão médio de 0,079% de NY-ESO-1, tornando este trabalho pioneiro não apenas por ser o primeiro a utilizar plantas como sistema de expressão, mas também por evitar a expressão associada a proteínas de fusão e tags de purificação, comumente utilizadas como estratégia para a expressão deste importante antígeno. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cancer is classified as a chronic degenerative disease with prolonged and progressive evolution if not interfered in any of its phases; it is characterized as a large public health problem both in developed and in non-developed countries. The relationship between cancer and the immune system began to be explored in the early 20th century in Germany when it was suggested that carcinomas could be suppressed by the immune system. Antigens cancer / testis ( ACTs ) are a unique class of naturally occurring antigens in some immune-privilged tissues and cancer cells. Among them, we can highlight NY-ESO-1, an ACT associated with various types of malignancies which is capable to trigger both cellular and humoral immune response, becoming one of the most promising candidates for the development of immunotherapeutic strategies. The large scale production of NY-ESO-1 in its native form is essential to acquire more information about its mode of action and subsequent exploitation of its full potential, and the development of stable and secure heterologous production systems are fundamental. This work proposes the use of tobacco and soybean seeds as bio¬factories for the accumulation of this important antigen in its integral form, completely free of protein fusion and purification tags, aiming to offer an alternative treatment that is stable, low cost and safe for humans. Among the systems elected only soybean seeds presented expression and accumulation of the target protein, reaching an average expression level of 0.079 %, which can be considered promising as the heterologous expression of NY-ESO-1 is in most cases dependent on fusion proteins and purification tags, and usually presents low success in eukaryotic systems.