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Les récepteurs canaux pentamériques (RCPs) assurent la transmission synaptique dans le système nerveux, via des réorganisations structurales allostériques globales couplant la liaison de neurotransmetteur à l'ouverture et à la désensibilisation du canal ionique. Sur le RCP bactérien modèle GLIC, j'ai suivi ces changements conformationnels à plusieurs endroits de la protéine, par incorporation de couples fluorophore/quencher (bimane/tryptophane). Les données en détergent et en liposomes, à l'équilibre et en cinétique, m'ont permis d'identifier, et de caractériser structuralement, un intermédiaire rapide (milliseconde) de pré-activation, montrant une réorganisation majeure du domaine synaptique suite à l'application d'agoniste, mais où le pore reste fermé, et ainsi de proposer un modèle global des transitions d'activation et de désensibilisation. En combinant mutagenèse, électrophysiologie et approches structurales, j'ai également identifié une région critique, à l'interface entre les domaines extracellulaires et transmembranaires, pour l'activation et la désensibilisation. Enfin, un criblage fonctionnel m'a permis d'identifier de nouveaux modulateurs allostériques de GLIC.Mon travail de thèse contribue donc à la compréhension du mécanisme allostérique de GLIC, et présente de nouveaux outils pour l'étude des récepteurs du système nerveux humain. / Pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs) are responsible for the synaptic transmission in the nervous system, occurring through their structural reorganizations allosterically coupling neurotransmitter binding to the opening or desensitization of the ion channel.Using the bacterial pLGIC model GLIC, I followed these conformational changes in several regions of the protein, through the incorporation of fluorophore / quencher pairs (bimane / tryptophan). The acquisition of data in detergent and liposomes, at equilibrium and in real time, allowed me to identify and structurally characterize a fast (millisecond) pre-activation intermediate. This new intermediate state is characterized by a major reorganization of the synaptic domain following agonist application, but with a closed pore, thus providing a comprehensive model for activation transitions and desensitization.Combining mutagenesis, electrophysiological and structural approaches, I also identified a critical region at the interface between the extracellular and transmembrane domains for activation and desensitization. Finally, a functional screening allowed me to identify new allosteric modulators of GLIC.This work contributes to the understanding of the allosteric mechanism of GLIC, and provides a structural template as well as new tools for the study of receptors in the human nervous system.

Nous avons déterminé par diffusion de rayons X le potentiel d’interaction entre deux bicouches, une première adsorbée sur un substrat solide et une deuxième flottant à proximité. Nous montrons que les interactions dans ces systèmes fortement hydratés sont deux ordres de grandeur plus faibles que dans les travaux précédents menés sur des phases multilamellaires. Cette caractéristique est attribuée à la répulsion électrostatique due à la faible fraction de lipides ionisés. Nous avons de plus accès aux potentiels de répulsion entropique, et testons les différents modèles théoriques existants.Les effets d’un champ électrique sur les membranes ont également été étudiés. Nous montrons que le champ induit une tension négative et une rigidité positive, et mène à la déstabilisation d’une bicouche supportée sous certaines conditions.Finalement, nous mesurons les propriétés de membranes chargées par diffusion de rayons X, nous permettant d’accéder aux limites de la théorie de Poisson-Boltzmann. / We have determined by grazing incidence X-ray scattering the interaction potential between two lipid bilayers, one adsorbed on a solid surface and the other floating close by. We find that interactions in this highly hydrated system are two orders of magnitude softer than in previously reported work on multilayer stacks. This is attributed to the weak electrostatic repulsion due to the small fraction of ionized lipids in defectless supported bilayers. We also access the entropic repulsion potentials, allowing us to discriminate between the different existing models.The effects of an electric field on the properties of membranes have also been studied. We show that the field induces a negative tension and an increase of the rigidity. We also show that it is possible to destabilize a supported bilayer by an electric field under certain conditions.Finally, we measure the properties of charged membranes using X-ray scattering, giving access to the limits of the Poisson-Boltzmann theory.

Les hydrophobines sont des protéines fongiques caractérisées par leurs propriétés amphipathiques et un motif de quatre ponts disulfures. Leur forme soluble s’auto-assemble aux interfaces hydrophobe/hydrophile pour former une couche amphipatique. Ces protéines sont utilisées par les champignons pour franchir la barrière air/eau, former des hyphes aériennes ou recouvrir les spores les rendant hydrophobes, ce qui facilite leur dispersion dans l’air. L’hydrophobine RodA du pathogène opportuniste Aspergillus fumigatus forme une couche de fibres amyloïdes avec une morphologie en bâtonnets qui recouvre la surface des spores ce qui les rend inertes vis-à-vis du système immunitaire. Nous aspirons à décrire l’auto-association de RodA en bâtonnets, caractériser la structure des fibres et établir les potentiels liens entre structure et inertie immunologique. La protéine recombinante RodA exprimée chez E. coli peut être correctement repliée in vitro et s’auto-associe sous forme de fibres amyloïdes. Comme première étape, la structure et la dynamique de RodA ont été étudiées par RMN en solution. Par rapport aux autres hydrophobines, RodA présente de nouveaux éléments structuraux ainsi que d’autres conservés. Grâce à une étude de mutagénèse, des régions importantes dans la formation des fibres ont été identifiées, certaines impliquées dans le cœur des fibres et d’autres dans les interactions latérales des bâtonnets. Les relations entre la structure et les propriétés immunologiques ont également été établies. L’étude d’autres hydrophobines d’A. fumigatus, probablement impliquées dans la formation du biofilm ou importantes pour la conidiation et la survie des spores, a été initiée.dC), a été initiée. / Hydrophobins are fungal proteins characterised by their amphipatic properties and a pattern of four disulfide bridges. Their soluble form self-assembles at hydrophobic/hydrophilic interfaces to form an amphipatic layer. These proteins are used by fungi to breach the air/water barrier, to form aerial hyphae, or to cover spores rendering them hydrophobic, thus facilitating spore dispersal. The RodA hydrophobin of the opportunistic pathogen Aspergillus fumigatus forms an amyloid monolayer with a rodlet morphology that covers the surface of spores rendering them inert relative to the immune system. We aim at describing the self-association of RodA into rodlets, characterising the structure of the amyloid rodlets and shedding light on the possible relationships between structure and immunological inertness. Recombinant RodA expressed in Escherichia coli can be successfully refolded in vitro and it can auto-associate into amyloid rodlets. As a first step, we have studied the structure and dynamics of RodA by solution NMR and shown that the protein displays new as well as conserved structural features relative to other hydrophobins. A mutational analysis has highlighted important residues for rodlet formation that may be involved on the one hand in the spine of the amyloid fibres and on the other hand on the lateral association of the rodlets to form a monolayer. We have also established the relationship between structure and immunological inertness. We have initiated the study of other hydrophobins from A. fumigatus, that are most likely involved in biofilm formation or in conidiation and spore survival.

Les lymphocytes T jouent un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. par l'intermédiaire d'un récepteur distinctif - le RCT (Récepteur des Cellules T), qui est responsable de la reconnaissance spécifique de peptides étrangers dans le corps. Les interactions moléculaires entre le RCT et son ligand, présenté par des cellules spécialisées (CPA cellules présentatrices d'antigène) sont suivies par un processus d'adhésion et d'étalement cellulaire caractérisé par d'importantes réorganisations à l'échelle supramoléculaire et cellulaire. Le rôle des propriétés physiques des cellules à ces échelles est encore mal compris. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés aux événements suivant cette reconnaissance en mimant la CPA par des substrats artificiels contrôlés exploitant plusieurs techniques de microscopie avancé. Nous avons réalisé une étude systématique de la dynamique d'étalement ainsi que de la morphologie (en terme d'aire d'adhésion et d'organisation de l'actine) des lymphocytes T humains de la lignée Jurkat sur des substrats présentant des anti-CD3 (un ligand spécifique du RCT) mobiles ou non. L'étalement des LT est fortement réduit sur les ligands mobiles par rapport aux ligands fixes. De plus le blocage de la myosine-II ou l'inclusion d'ICAM (le ligand des intégrines LFA-1) sur les substrats permettent de compenser ces différences. Nous proposons un modèle, inspiré de ceux sur la migration ou la croissance du cône neuronal , qui lie la dynamique du front d'étalement des lymphocytes T à la friction générée au niveau de la surface en tirant ou en fixant les ligands. / T- cells play a central role in cell mediated adaptive immune response. They are a class of lymphocytes that carry distinctive receptors - the TCRs (T cell receptor), which are responsible for specific recognition of foreign peptides in the body. Molecular interactions between the TCR complex and its ligand is followed by cell adhesion and spreading accompanied by dramatic changes at molecular and cellular scale. In this thesis we focus on the events that immediately follow recognition. I report a systematic study of the spreading dynamics and morphology (in terms of adhesion area and actin organization) of T lymphocytes on substrates with mobile or immobilized anti-CD3 (a ligand targeting the TCR complex). The spreading behaviour is seen to be dramatically different on the two types of substrates. Interestingly, on blocking myosin-II or by inclusion of ICAM (ligand of LFA1 integrins) on the substrate, these differences tend to disappear. We propose a model, partially inspired by earlier models of neuronal growth cones and filopodia, that links the dynamics of the leading edge of the spreading T cell to the friction generated at the surface by dragging or pinning of the ligands. I also report studies on T cells interacting with substrates decorated with nano-scale islands of anti-CD3 in a sea of repulsive PEG or a supported lipid bilayer. Dramatic differences in adhesion, organization of actin, and receptor distribution are observed on different geometries. I report advances in multi channel RICM towards the reconstruction of not only the topography of the proximal membrane of the T cell with high level of confidence but also the distal surface of lamellipodia.

Nous avons développé un dispositif combinant pinces optiques et imagerie par feuillet de lumière. Nous montrons que les interfaces cellulaires de l'épithélium précoce de l'embryon de Drosophile peuvent être piégées et manipulées directement avec des pinces optiques. La manipulation optique est réalisée à la fin de la cellularisation, processus par lequel des membranes cellulaires séparent les noyaux pour donner naissance à un épithélium ; à ce stade, les mouvements cellulaires sont minimes et les cellules ont des formes hexagonales similaires. En imposant un mouvement sinusoïdal au piège perpendiculairement à une interface, nous étudions la déflection de l'interface en fonction de la puissance laser, de l'amplitude du mouvement du piège et de la fréquence d'oscillation. En outre, des expériences de déflection-relaxation par déplacement instantané puis arrêt du piégeage, ont été réalisées, fournissant une alternative à l'analyse fréquentielle pour étudier les propriétés viscoélastiques de l'interface. Un modèle de type solide linéaire standard rend compte des observations et permet d'extraire les paramètres viscoélastiques de l'interface. Nous mettons également en évidence que la déflection imposée à une interface se propage aux interfaces voisines en s'affaiblissant exponentiellement sur une distance d'une à deux cellules. Cette technique étant établie, nous l'utilisons pour mesurer les tensions durant l'extension de la bandelette germinale. Les tensions sont anisotropes, les jonctions parallèles à la direction dorsoventrale ayant une tension trois fois plus élevée que celles perpendiculaires. Ce travail fournit des mesures absolues des tensions intercellulaire. / Here, an optical tweezers setup was developed on a pre-existing single-plane illumination (SPIM) setup. The cell-cell interface in embryonic epithelia could be trapped and manipulated directly with optical tweezers. The interaction of the interface with the trap was initially characterized at the end of cellularization where the tissue has minimal movements and actomyosin turnover. With a sinusoidal trap excursion, the interface amplitude was found to increase linearly with applied laser power as well as trap amplitude and time period. Furthermore, push and pull experiments on the interface responding to a stationary trap, provided another way to address the viscoelastic properties of the interface. The interface kinetics in stationary experiments could fit adequately to a passive viscoelastic model. This model also explained well the linear response to trap amplitude and time period, and formed the basis of estimating interface tension from its amplitude. Moreover, the propagation of the sinusoidal movement to neighbouring interfaces decayed rapidly with minimal phase lag in both experiments and the model. Having established a suitable regime of trapping conditions, where interface deflection is small and linear, the mechanical anisotropy of the epithelium was at the onset of gastrulation. The interface tension increased by 2-3 fold, exhibiting both apico-basal and dorso-ventral polarization of tension, concomitant with polarized accumulation of myosin. The role of myosin was established further through ROCK-inhibition. Perturbation of actin also decreased the interface tension. My work provides a crucial insight into the mechanical behaviour of dynamic epithelia.

Les organismes biologiques ont développé divers mécanismes immunitaires afin de se protéger des pathogènes. Nous développons ici des modèles mathématiques de systèmes immunitaires, adaptés de façon optimale aux statistiques des pathogènes. Au delà des détails moléculaires, ces mécanismes immunitaires diffèrent dans la manière d'acquérir, de réguler et de transmettre une protection immunitaire ; différences qui pourraient s'avérer essentielles pour la survie à long terme. Afin d'expliquer la diversité des stratégies qui sont observées, nous comparons l'adaptation à long terme de populations en fonction de la dynamique des pathogènes à laquelle elles sont confrontées et de la stratégie immunitaire qu'elles adoptent. Nous démontrons que la fréquence et l'échelle de temps caractéristique des pathogènes sont les deux déterminants clés d'une stratégie immunitaire optimale. En fonction de ces deux paramètres, nous identifions des modes d'immunité distincts, comprenant immunités innées, adaptatives, ou ressemblant au système CRISPR, qui récapitulent la diversité de systèmes immunitaires naturels. Nos résultats viennent s'étendre à la question générale de l'évolution dans des environnements variables pour laquelle nous apportons de nouveaux résultats analytiques au sein d'environnements temporairement corrélés. Le système immunitaire adaptatif assure une protection à partir d'un large répertoire de cellules spécifiques à différents pathogènes. Pour prédire des propriétés statistiques de répertoires adaptés, nous étudions quel répertoire minimise au mieux le risque d'infections pour une distribution de pathogènes donnée. La théorie prédit que les cellules spécifiques contre les antigènes rares sont surreprésentées par rapport à la fréquence de leurs rencontres et que les individus, exposés aux mêmes infections, possèdent des répertoires avec des récepteurs largement différents mais exploitent la réactivité croisée afin de parvenir à la même couverture d'antigènes. Nos résultats sont issus d'une opposition entre les statistiques de détection des pathogènes, qui soutiennent l'idée d'une plus large distribution de récepteurs, et les effets de la réactivité croisée, qui tend à concentrer le répertoire optimal sur un petit nombre de clones. Nos prédictions peuvent être testées à partir d'enquêtes à haut débit sur la diversité des récepteurs et de pathogènes. Par la suite, nous examinons explicitement comment le système immunitaire adaptatif peut apprendre de manière bayésienne les statistiques de l'environnement à partir de l'historique des infections précédentes. Nous montrons que les répertoires optimaux peuvent être atteints par prolifération sélective des cellules spécifiques. La perspective bayésienne sur la dynamique des répertoires fournit un cadre conceptuel unificateur qui explique un certain nombre de caractéristiques de la mémoire immunitaire et appelle à des expériences complémentaires. / Biological organisms have evolved diverse immune mechanisms to defend themselves against pathogens. Here we build mathematical models of immune systems optimally tuned to the statistics of pathogens. Beyond molecular details, different immune mechanisms differ in how protection is acquired, processed and passed on to subsequent generations -- differences that may be essential to long-term survival. To explain the observed diversity of strategies we compare the long-term adaptation of populations as a function of the pathogen dynamics that they experience and of the immune strategy that they adopt. We find that the two key determinants of an optimal immune strategy are the frequency and the characteristic timescale of the pathogens. Depending on these two parameters, we identify distinct modes of immunity, including adaptive, innate, bet-hedging and CRISPR-like immunities, which recapitulate the diversity of natural immune systems. Our results carry over to the general question of evolution in fluctuating environments, for which we provide novel analytical results in temporally correlated environments. The adaptive immune system provides protection through a broad repertoire of cells specific to different pathogens. To predict statistical features of well-adapted repertoires we analyze which repertoire minimizes cost of infection for a given distribution of pathogens. The theory predicts that the immune system has more receptors for rare antigens than expected from the frequency of encounters; and individuals exposed to the same infections have sparse repertoires that are largely different, but nevertheless exploit cross-reactivity to provide the same coverage of antigens. Our results follow from a tension between the statistics of pathogen detection, which favor a broader receptor distribution, and the effects of cross-reactivity, which tend to concentrate the optimal repertoire onto a few highly abundant clones. These predictions can be tested in high throughput surveys of receptor and pathogen diversity. We then explicitly consider how the adaptive immune system can learn the statistics of the environments from its past infection history in a Bayesian manner. We show that optimal repertoires can be reached by keeping memory of an infection through the selective proliferation of stimulated cells. The Bayesian perspective on repertoire dynamics provides an unifying conceptual framework to explain a number of features of immunological memory and suggests further experiments.

Les ondes rétiniennes sont des bursts spontanées d'activité se propageant dans la rétine en développement, jouant un rôle fondamental dans le façonnage du système visuel et des circuits rétiniens. Ils disparaissent complètement à la maturation. Comprendre comment les ondes rétiniennes sont initiées et se propagent dans la rétine pourrait nous permettre de concevoir des protocoles pour déclencher de telles ondes rétiniennes dans la rétine adulte, s'attendant à réintroduire une certaine plasticité dans le tissu rétinien et les projections dans le cerveau. Dans ma thèse, je me suis concentré sur un stade spécifique de développement des ondes, appelé stade II, induit par des cellules spécifiques (SAC) et médiée par le neurotransmetteur acétylcholine. Les SAC immatures présentent un comportement d'éclatement spontané dû aux mécanismes cellulaires intrinsèques, qui disparaissent complètement lors de la maturation. En outre, les SAC immatures sont connectés par des connexions excitatrices, conduisant à des poussées d'activité en propagation. L'esprit général de ce travail de thèse est de proposer un modèle pour les ondes rétiniennes (i) suffisamment proche de la biophysique pour expliquer et proposer des expériences et (ii) suffisamment bien posé mathématiquement pour analyser sa dynamique sur des paramètres biophysiques variables. Dans ce contexte, nous avons voulu élucider les mécanismes qui font éclater les SAC immatures et comment les ondes rétiniennes commencent, se propagent et s'arrêtent. Nous avons proposé un modèle mathématique, fondé sur la biophysique, et à travers la théorie des bifurcations, nous expliquons les mécanismes cellulaires sous-jacents possibles des ondes rétiniennes, en soulignant les paramètres biophysiques pertinents contrôlant la propagation et la disparition des ondes. En plus de cela, nous avons analysé comment l'évolution de la conductance cholinergique due à la maturation des récepteurs nicotiniques modifie considérablement les caractéristiques de l'onde rétinienne. En particulier, il existe un intervalle très étroit de conductance de l'acétylcholine où la taille des ondes rétiniennes obéit à une distribution de loi de puissance, suggérant un mécanisme spécifique (homéostatique) stabilisant temporairement le réseau SAC dans cette gamme spécifique. En résumé, les résultats de cette thèse sont principalement théoriques, mais ils conduisent également à des prédictions expérimentales directement liées à la biologie. / Retinal waves are spontaneous bursts of activity propagating in the developing retina, playing a fundamental role in shaping the visual system and retinal circuitry. They disappear completely upon maturation. Understanding how retinal waves are initiated and propagate in the retina could enable us to design protocols to trigger such retinal waves in the adult retina, expecting to reintroduce some plasticity in the retinal tissue and the projections in the brain. In my thesis, I have focused on a specific stage of development of waves, called stage II, induced by specific cells (SACs) and mediated by the neurotransmitter acetylcholine. Immature SACs exhibit a spontaneous bursting behavior due to intrinsic cellular mechanisms, which disappears completely upon maturation. Also, immature SACs are connected by excitatory connections, leading to propagating bursts of activity. The general spirit of this thesis work, is to propose a model for retinal waves (i) sufficiently close to biophysics to explain and propose experiments and (ii) suffciently well posed mathematically to analyse its dynamics upon varying biophysical parameters. In this context, we wanted to ellucidate the mechanisms causing immature SACs to burst and how retinal waves start, propagate and stop. We proposed a mathematical model, grounded on biophysics, and through bifurcations theory we explain the possible underlying cellular mechanisms of retinal waves, highlighting the relevant biophysical parameters controlling waves propagation and disparition. On top of that, we analyzed how the evolution of cholinergic conductance due to the maturation of nicotinic receptors dramatically changes the retinal wave characteristics. Especially, there is a very narrow interval of acetylcholine conductance where retinal waves size obey a power law distribution, suggesting a specific (homeostatic) mechanism stabilizing temporarily the SACs network in this specific range. To sum up, this thesis results are mainly theoretical, but they also lead to experimental predictions directly linked to biology.

Des forces intermoléculaires sur lesquelles nous avons peu de connaissances préalables sont souvent essentielles à la stabilité et à l'évolution des assemblages biologiques. Dans cette thèse, nous nous concentrons sur deux de ces forces qui sont impliquées de façon critique dans la déformation soit des biopolymères, soit des membranes. Nous déduisons ces forces en conciliant la géométrie d'une telle déformation avec des modèles mécaniques simples. Dans la première partie de la thèse, nous examinons la force d'attraction entre les molécules d'ADN médiées par des cations multivalents. Cette attraction est nécessaire pour compenser la rigidité de l'ADN lors du confinement de grandes quantités d'ADN dans des environnements relativement petits, tels que les noyaux des spermatozoïdes. In vitro, les cations multivalents causent la condensation de l'ADN en faisceaux toroïdaux denses. Grâce à des données sur la géométrie de ces faisceaux, nous pouvons étudier la compétition entre les forces attractives et la rigidité de l'ADN. Nous inférons telles forces et proposons que la courbure toroïdale affaiblisse l'adhésion entre les molécules d'ADN. Dans la deuxième partie de la thèse, nous nous intéressons à la force de liaison d'un complexe protéique de remodelage membranaire, ESCRT-III, aux membranes cellulaires. Les protéines ESCRT-III s'assemblent en polymères qui remodèlent la membrane au cours de nombreux processus cellulaires, allant du bourgeonnement du VIH à la cytokinèse. Le mécanisme par lequel les polymères ESCRT-III déforment les membranes n'est toujours pas clair. In vitro, les polymères ESCRT-III peuvent transformer des vésicules membranaires sphériques en tubes hélicoïdaux. Nous proposons que les tubes hélicoïdaux résultent du positionnement particulier des sites de liaison membranaire sur la surface des polymères ESCRT-III. De plus, nous déduisons la force de liaison entre les monomères ESCRT-III et la membrane à partir de la géométrie des tubes hélicoïdaux. / Inter-molecular forces on which we have poor prior knowledge are often essential for the stability and evolution of biological assemblies. In this thesis, we focus on two such forces that are critically involved in the deformation of either biopolymers or membranes. We infer these forces by reconciling the geometry of such deformation with simple mechanical models. In the first part of the thesis, we consider the attractive force between DNA molecules mediated by multivalent cations. This attraction is required to compensate DNA bending rigidity when packaging large quantities of DNA in comparatively small environments, such as the nuclei of sperm cells. In vitro, multivalent cations drive DNA condensation into dense toroidal bundles. Geometrical data on DNA toroidal bundles give access to the competition between inter-helical attraction and DNA bending rigidity. From these data, we infer inter-helical forces and argue that the toroid curvature weakens the adhesion between DNA molecules. In the second part of the thesis, we turn to the binding force of a membrane remodeling protein complex, ESCRT-III, to cellular membranes. ESCRT-III proteins assemble into membrane-remodeling polymers during many cellular processes, ranging from HIV budding to cytokinesis. The mechanism by which ESCRT-III polymers deform membranes is still unclear. In vitro, ESCRT-III polymers can reshape spherical membrane vesicles into helical tubes. We argue that helical tubes result from the peculiar positioning of membrane-binding sites on the surface of ESCRT-III polymers. Furthermore, we infer the binding force between ESCRT-III and membrane from the geometry of helical tubes.

Ce travail de thèse a démontré la possibilité de mesurer la relaxation d'un complexe biomoléculaire ainsi que son hétérogénéité structurale, en associant la microfluidique et la fluorescence résolue en temps (FRT). Je présente de quelle façon la FRT permet d'obtenir une information sur la structure d'une molécule et comment on la mesure, notamment grâce à une caméra à balayage de fente. J'introduis ensuite la microfluidique de gouttes, permettant de mélanger deux réactifs en quelques millisecondes et de suivre la relaxation du complexe au cours de la propagation des micro-réacteurs. Puis, la mesure d'une cinétique avec un couple de molécules modèle démontre la preuve de principe, faisant l'objet d'un article soumis. Enfin la mesure de FRT par comptage de photons uniques dans des gouttes uniques est décrite. Elle ouvre une perspective d'application pour le criblage à haut débit : un brevet a été déposé.