Dentre as tecnologias de reprodução assistida (TRAs), a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é a mais amplamente estudada, além de possuir um grande interesse econômico. Entretanto, existem fatores que influenciam negativamente a taxa de produção embrionária e o sucesso da gestação. Sabe-se que embriões provenientes das TRAs apresentam frequentemente alterações epigenéticas, relacionadas principalmente ao microambiente no qual os gametas e embriões se desenvolvem. A suplementação com ácido fólico parece prevenir tais erros epigenéticos, visto que além de ser um importante composto vitamínico, ele pode atuar como doador de grupamentos metil e possui ação antioxidante. A adição de ácido fólico durante a maturação oocitária parece influenciar positivamente a PIVE, além de existir evidências de que ele possa alterar os níveis de metilação do DNA e a expressão de genes importantes ao desenvolvimento embrionário. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo, avaliar a influência de diferentes concentrações de ácido fólico durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos de diferentes qualidades (graus I e III) na produção embrionária e na expressão dos genes IGF2 e LIT1 em blastocistos bovinos. Para tanto, três diferentes concentrações de ácido fólico (10, 30 e 100µM) foram avaliadas durante a MIV, em que 2159 oócitos (1087 oócitos grau I e 1072 oócitos grau III) foram maturados, fertilizados e cultivados por sete dias. Os blastocistos foram avaliados quanto à (1) taxa de produção nos diferentes tratamentos e origem dos oócitos e (2) a expressão dos genes IGF2 e LIT1 foi investigada utilizando a transcrição reversa associada a PCR quantitativa. A análise estatística foi realizada através do teste t de Student. A avaliação da produção embrionária mostrou que a adição de 10µM de ácido fólico influencia positivamente a produção de embriões provenientes de oócitos grau III (p=0,017), enquanto em embriões provenientes de oócitos grau III não foi observada influência. O segundo tratamento mostrou que a adição de 30µM de ácido fólico parece não influenciar tanto embriões provenientes de oócitos grau I quanto grau III. Por outro lado, a adição de 100µM de ácido fólico prejudica o desenvolvimento de embriões provenientes de oócitos grau I (p=0,043), mas parece não influenciar os embriões provenientes de oócitos grau III. Quando avaliada a expressão gênica, o gene IGF2 foi expresso em 25% das amostras, sendo que, com exceção de uma amostra, todas eram provenientes de oócitos grau I. Apesar do gene LIT1 ser expresso em todas as amostras analisadas, não foram observadas diferenças entre os embriões cujos oócitos foram maturados na ausência ou na presença de ácido fólico, independente da concentração adicionada ou origem oocitária (graus I ou III). A adição de ácido fólico durante a maturação de oócitos bovinos parece ser interessante para a PIVE. No entanto, a concentração e a qualidade oocitária parecem ser fatores importantes para a produção embrionária, visto que menores concentrações favorecem oócitos de baixa qualidade enquanto que maiores concentrações prejudicam oócitos de maior qualidade. Por fim, as alterações na produção embrionária devido à adição de ácido fólico parecem não estar relacionada com os níveis de expressão dos genes IGF2 e LIT1. / Among assisted reproductive Technologies (ARTs), in vitro production (IVP) of bovine embryos is the most studied, besides exist a great economic interest. However, there are many factors that negatively influences production rates and pregnancy success. It\'s know that embryos produced by ARTs frequently present epigenetics alterations, related, specially, to the microenvironment where occurs the development of gametes and embryos. Supplementation with folic acid seems to prevent these epigenetics damages, since it is an important component and may act like a methyl donor and has antioxidant action. Folic acid addition during oocitary maturation seems to positively influences embryos IVP, in addition there are evidences that it may alter DNA methylation levels and expression of important genes during embryo development. Thus, this paper had as objective; evaluate different concentrations of folic acid during in vitro maturation (IVM) of different bovine oocytes (Grade I and III) on the embryo production and expression of IGF2 and LIT1 gene in the bovine blastocyst. For this purpose, three different folic acid concentrations (10, 30, and 100µM) were evaluated during IVM, when 2159 oocytes (1087 grade I and 1072 grade III) were matured, fertilized and cultured during seven days. Blastocysts were evaluated for (1) production rates in different treatments and oocyte type and (2) expression of IGF2 and LIT1 was investigated using quantitative reverse transcription PCR. Statistical analysis was realized using student t test. Embryo production analysis revealed that addition of 10µM of folic acid positively influences production of embryos from oocytes grade III (p=0,017), whereas in embryos from oocytes grade I this influence wasn\'t observed. The second treatment showed that 30µM of folic acid didn\'t influence both embryos from oocytes grade I and embryos from oocytes grade III. On the other hand, addition of 100µM of folic acid damages the development of embryos provide from oocytes grade I (p=0,043), but this wasn\'t observed in embryos provide from oocytes grade III. When evaluated gene expression, IGF2 gene were expressed in 25% of all samples, being that, with exception of one sample, all of them were embryos from oocytes grade I. Despite LIT1 expression were detected in all samples, wasn\'t observed statistical difference between embryos whose oocytes were matured in the absence or presence of folic acid, independent of concentration added or oocytes types (grades I ou III). Folic acid addition during bovine oocytes maturation seems to be interesting to embryo IVP. However, folic acid concentration and oocyte quality seems to be important factors to embryo production, since lower concentration its beneficial for lower quality oocytes, while higher folic acid concentration damage better oocytes. Finally, embryos production rates alterations due folic acid addition appears to be unrelated with expression levels of IGF2 and LIT1.

A ineficiência dos protocolos de criopreservação limita o uso em larga escala da produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação e pelo cultivo embrionário de embriões bovinos produzidos in vitro após a descongelação, avaliando a morfologia, a expressão gênica e o desenvolvimento in vitro antes e após a criopreservação. Complexos cummulusoócitos foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=600) obtidos entre os dias 7 e 9 de cultivo (fecundação D0) foram submetidos a congelação controlada (grupo controlado: 10% de etileno glicol (EG) por 10 minutos, 1,2oC por minuto), congelação rápida (grupo rápido: 10% de EG por 10 minutos , 20% de EG + 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos) ou vitrificação (grupo vitrificação: 10% de EG por 10 minutos, 25% EG + 25% Gli por 30 segundos). Os embriões do grupo controle não foram expostos a crioprotetores e nem a protocolos de criopreservação, sendo avaliado o índice de eclosão 12 dias após a fecundação (46,09%). As palhetas para os protocolos de congelação rápida e vitrificação foram mantidas em vapor de nitrogênio líquido (0,8cm sobre o líquido) por 2 minutos e imersas no nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos em ar e 20 segundos em banhomaria a 25oC. Os embriões foram reidratados em solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de sacarose e em solução de PBS + 0,2% de BSA ambos por 3 minutos. Para avaliar o desenvolvimento, os embriões, após a descongelação, foram co-cultivados com células da granulosa em meio TCM199 ou SOFaa por 4 dias. Os dados foram analisados com o aplicativo PROC MIXED do programa SAS Sistems for Windows®. O grupo controlado apresentou índices de eclosão de 44,65% ± 5,94 e 11,65 ± 3,37 para o meio TCM199 e para o meio SOFaa, respectivamente. Embriões do grupo rápido não apresentaram eclosão, independente do meio de cultivo. O grupo vitrificação apresentou índices de eclosão de 9,43% ± 6,77 e 8,67% ± 4,47, respectivamente, em meio TCM199 e SOFaa. Os valores foram significativos quando p<0,05. O grupo controlado apresentou diferença em relação aos outros grupos em ambos os meios de cultivo. No meio TCM199 os índices de re-expansão e eclosão foram mais altos. Para a análise da expressão gênica, 2 pools de 10 blastocistos expandidos de embriões frescos e criopreservados (congelação controlada) foram utilizados para a extração de RNA. Foi feita reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) e de PCR em Tempo Real. Os resultados da reação de PCR em Tempo Real demonstraram que a quantidade de material não foi suficiente para a amplificação de produtos em todas as reações. Concluindo, o meio de cultivo TCM199 exerce influência sobre o desenvolvimento embrionário após a criopreservação, sendo mais apropriado do que o meio SOFaa. E, para proceder a análise da expressão gênica pela reação de PCR em Tempo Real é necessário número maior de blastocistos expandidos. / The inefficiency of embryo cryopreservation protocols limits the broad use of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The aim of this work was to identify the damage caused by cryopreservation and embryo culture of in vitro produced bovine embryos after thawing by morphological analysis, gene expression and in vitro development before and after cryopreservation. Cummulus-oocyte complexes were in vitro matured, fertilized and cultured. Expanded blastocysts (n= 600) harvested on days 7-9 were submitted controlled freezing [controlled group: 10% ethylene glycol (EG) for 10 minutes and 1.2oC per minute cryopreservation], quick-freezing [quick group: 10% EG for 10 minutes, 20% EG + 20% Glycerol (Gly) for 30 seconds] or vitrification [vitrification group: 10% EG for 10 minutes, 25% EG + 25% Gly for 30 seconds] protocols. The embryos of the control group were not exposed to cryoprotectant or crypreservation method and the hatching rate was evaluated on day12 post-insemination. The straws (quick and vitrification groups) were first placed on nitrogen vapor (0.8 cm over the liquid nitrogen) for 2 minutes and than immersed in liquid nitrogen. Embryos were thawed in air for 10 seconds followed by 25oC water bath for 20 seconds. Embryos were rehydrated in PBS + 0.2% BSA + 0.3M sucrose for 3 minutes and PBS + 0.2% BSA for the same time. In order to evaluate development of frozen-thawed embryos they were cocultured on granulosa cells in TCM 199 or SOFaa for 4 days. Hatching rate of control group was 46.09%. Data was analyzed by PROC MIXED model of SAS Sistems for Windows®. Controlled group hatching rate was 44.65% ± 5.94 and 11.65% ± 3.37 for TCM 199 and in SOFaa, respectively. Embryos submitted to quick group did not hatch regardless of culture condition. Vitrification group showed hatching rates of 9.43% ± 6.77 and 8.67% ± 4.47, respectively, in TCM 199 and SOFaa., and values were significant at p<0.05. The controlled group showed difference between the other groups of cryopreservation in both medium (TCM 199 and SOFaa). However, TCM 199 showed high rates of re-expansion and hatching. To gene expression analysis, 2 pools of 10 expanded blastocysts of fresh and cryopreserved embryos (controlled freezing) was used to RNA extraction, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) was done and submitted to a Real Time PCR. The results of the Real Time PCR showed that the amount of material was not enough to the amplification of products in all reactions. In conclusion, the culture medium influences the embryo development after the cryopreservation being TCM199 more appropriate than SOFaa. And more number of expanded blastocysts is necessary to analysis the gene expression in a Real Time PCR reaction.

Orientadora: Prof. Dra. Marcela Pecorá Milazzotto / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / Diferenças na tensão de oxigênio durante o cultivo in vitro (CIV) interferem diretamente no desenvolvimento embrionário. O cultivo de embriões em elevada tensão de O2 pode induzir o estresse oxidativo pelo acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs), afetando negativamente o desenvolvimento inicial por causar alteração na expressão gênica, fragmentação do DNA, interferência nos estado de pluripotência, apoptose, alterações epigenéticas, entre outros fatores que causam danos às células embrionárias. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de diferentes tensões de oxigênio durante a CIV no desenvolvimento e padrão transcricional de embriões bovinos, avaliando-se os mesmos no estágio de blastocisto e em embriões com 8-16 células, momentos em que a ativação do genoma e reprogramação epigenética aumentam a fragilidade desses embriões. Para esse propósito, embriões bovinos foram produzidos in vitro (PIV) seguindo protocolos convencionais em duas tensões distintas de oxigênio, fisiológica (5%) e atmosférica (20%). Na primeira etapa do trabalho, blastocistos expandidos (BX) foram submetidos à análise de expressão gênica por RT-qPCR pelo Biomark HD System (Fluidigm, US), usando 74 ensaios TaqMan específicos para Bos taurus. A produção embrionária e quantificação de transcritos foram comparadas com a aplicação do Teste-T (=5%). Não houve diferença na taxa de clivagem entre os grupos, mas a taxa de BX foi maior no grupo 5%O2. Diferenças significativas foram observadas em genes relacionados à resposta ao estresse oxidativo, fatores de transcrição dependentes do DNA e relacionados com várias vias funcionais, como desenvolvimento embrionário, pluripotência e diferenciação celular, proliferação celular e apoptose. Para a verificação dos dois últimos efeitos, foi feita a coloração diferencial de BX e contagem do número de células da MCI e TE. O grupo 5%O2 apresentou um maior número total de células, bem como de células da MCI e TE. Foi analisada ainda a concentração de EROs nestes embriões, com uma maior concentração observada nos embriões produzidos em 20% de O2. Na segunda etapa do estudo, foi feita novamente a análise de expressão gênica RT-qPCR pelo Biomark HD System, com o uso de novos ensaios TaqMan, em amostras de embriões sexados de 8-16 células e BX dos dois grupos. Foram observadas diferenças significativas em genes relacionados à resposta ao estresse oxidativo, fatores de transcrição dependentes do DNA e relacionados a mecanismos epigenéticos, nos dois estágios analisados. Considerando os resultados observados nas duas etapas do estudo, podemos concluir que a PIV de embriões bovinos em tensão atmosférica afeta a expressão de genes envolvidos em várias vias da biologia celular embrionária e pode afetar o seu desenvolvimento, qualidade e viabilidade. / Differences in oxygen tension during in vitro culture (IVC) direct impacts the embryo development. Embryo culture in high oxygen (O2) levels can induce oxidative stress through the accumulation of reactive oxygen species (ROS), negatively affecting early embryo development, causing changes in gene expression, DNA fragmentation, interference in pluripotency state, increased apoptosis, among other factors that harm embryo cells. The aim of this study was to evaluate the effect of different O2 tensions during IVC on development and transcriptional status of bovine embryos on blastocysts and 8-16 cells stages, development moments where the genome activation and epigenetic reprogramming increase the fragility of this embryos. For this purpose, bovine embryos were produced in vitro by conventional protocols in two different oxygen tensions, physiological (5%) and atmospheric (20%). In the first phase of this study, expanded blastocysts (BX) were subjected to gene expression analysis by RT-qPCR with Biomark HD System (Fluidigm, San Francisco, CA, US), using 74 TaqMan assays specific for Bos taurus. Embryonic development and quantification of transcripts were compared by Student t-test considering =5%. There was no difference in the cleavage rate between the groups, but the blastocyst rate was higher in the 5% O2 group. A significant difference was observed in genes related to oxidation-reduction processes, DNA-dependent transcription factors and factors related to distinct functional pathways, such as embryo development, pluripotency and cell differentiation, cell proliferation and apoptosis. To verify these last two effects ICM and TE from expanded blastocysts were differentially stained and the number of cells was assessed. The low O2 tension group had a higher number of total cells, as well as TE and ICM cells. DCF staining was also made to evaluate the ROS concentration, with results showing a higher presence of ROS on embryos cultured at 20% O2. In the second phase of the study a new gene expression analysis by RT-qPCR with Biomark HD System was made, using new TaqMan assays, on samples of sexed embryos with 8-16 cells and blastocysts for both groups. Significant differences were observed again in genes related to oxidation-reduction processes, DNA-dependent transcription factors and also in genes related to epigenetic mechanisms in both embryo stages analyzed. Taken together, these results allow us to conclude that the production of IVP embryos at atmospheric O2 tension affects the expression of genes involved in multiple cell biology pathways that can affect embryo development, quality and viability.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Dennys Eduardo Werlichl.pdf: 510119 bytes, checksum: aac5246620094e985b2b81198a4a18fb (MD5) Previous issue date: 2005-12-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to determine the viability of bovine IVP expanded blastocysts (Bx) submitted to four different cryoprotectant solutions (Experiment 1) and two cooling rate speeds (Experiment 2), and vitrified in OPS. Hatching rate was considered as viability parameter. In the first experiment (12 replications), IVP Bx (n=720) were randomly allocated in to groups: Group I (20% EG + 20% DMSO), Group II (25% EG + 25% GLY), Group III (7,0M EG), Group IV (20% EG + 20% PRO) and Group V (control not vitrified). After 72 hours of culture, the hatching rate of control group (84.0%) was higher (P<0.05) than that observed with the vitrified experimental groups. There were no differences among hatching rates observed in Groups I (53.5%), and IV (52.8%), and both were higher than Groups II (38.9%) and III (38.9%). In the second experiment (5 replications) 244 Bx were randomly exposed to EG+DMSO (GI and GII) or EG+PRO (GIII and GIV) solutions in order to evaluate the use of super-cooled liquid nitrogen by vacuum submission. There were no differences among the hatching rates of embryos vitrified with super-cooled (GII = 50.2%; GIV = 54.0%) or normal nitrogen (GI = 50.1%; GIII = 56.0%), independently of the solutions. In conclusion, the EG+DMSO and EG+PRO solution are similar in promoting IVP Bx survival, after vitrification, and they are more efficient than the EG+GLY and EG solutions. The use of super cooled liquid nitrogen does not improve embryo survival after vitrification. / Com o objetivo de determinar a viabilidade de blastocistos expandidos (Bx) bovinos produzidos in vitro (PIV) e vitrificados em OPS, dois experimentos avaliaram o efeito de quatro soluções crioprotetoras e duas velocidades de resfriamento. A taxa de eclosão foi utilizada como parâmetro de viabilidade. No primeiro experimento, 720 Bx (12 repetições) foram aleatoriamente distribuídos em 5 grupos: Grupo I (20% EG + 20% DMSO), Grupo II (25% de EG + 25% de GLI), Grupo III (7,0M EG), Grupo IV (20% de EG + 20% de PRO) e Grupo V (controle não vitrificado). A taxa de eclosão do grupo controle (84%) foi superior (P<0,05) aos grupos vitrificados. Não houve diferença nas taxas de eclosão dos grupos I (53,5%) e IV (52,8%), que foram superiores aos grupos II (38,9%) e III (38,9%). No segundo experimento avaliou-se o uso de nitrogênio líquido super-resfriado por ação de vácuo. Utilizou-se 244 Bx (5 repetições), aleatoriamente distribuídos, usando as soluções EG+DMSO (GI e GII) e EG+PRO (GIII e GIV). Não foram observadas diferenças entre as taxas de eclosão dos embriões vitrificados com nitrogênio super-resfriado (GII = 50,2%; GIV = 54,0%) ou nitrogênio normal (GI = 50,1%; GIII = 56,0%), independente da solução empregada. Conclui-se que a solução EG+DMSO e EG+PRO possibilitam taxas de eclosão similares e são mais eficientes que as soluções EG+GLI e EG. O emprego do nitrogênio superresfriado pelo vácuo não proporciona aumento da viabilidade de blastocistos bovinos PIV vitrificados em OPS.

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-10-11T14:31:19Z No. of bitstreams: 2 Tese - Tiago Omar Diesel - 2018.pdf: 2037910 bytes, checksum: e5037a6e126e6597f8f92b2754602731 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-15T11:00:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Tiago Omar Diesel - 2018.pdf: 2037910 bytes, checksum: e5037a6e126e6597f8f92b2754602731 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-15T11:00:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Tiago Omar Diesel - 2018.pdf: 2037910 bytes, checksum: e5037a6e126e6597f8f92b2754602731 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-09-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Chemical delipidation has been used as an alternative to improve the cryotolerance of in vitro produced embryos (IVP). The aim of this study was evaluate the effect of L-carnitine (LC) on the development and survival of vitrified IVP bovine embryos by the Cryotop method in the first assay, and in the second trial the effect of LC and Forskolin on Cryotop cryopreserved embryos Experiment 1), or by modified slow freezing (Experiment 2), so mitochondrial activity, intracytoplasmic lipid (LI) content, cellular apoptosis (NCA) and hatching after heating were evaluated. In the first essay LC was used at the concentration of 0,6 mg/mL in maturation culture medium (IVM), embryo culture (IVC) and / or post-thawing (REC), in four treatments: without LC (Control), LC added to CIV (LCiv), LC to CIV + LC to REC (LCivR), and LC to MIV / CIV + LC to REC (LMivCR). The addition of LC increased the production of blastocysts in D7 by 28.6% (LCiv) and the amount of embryos grade I by 36.9% (LCivR), the re-expansion rate in 22,7% and hatching in 20.1% (LCiv), and mitochondrial activity was 1.9 times higher (P <0.001) (LCivR) than Control. The LI quantity was 29% lower in LCiv and LCivR and 50.2% in LMivCR compared Control (P <0.001). In the second experiment the embryos were cultured without addition of delipidators (Control), in the presence of 10μM of Forskolin added to the IVC in D5 (FORSK) or L-carnitine (0.6 mg / mL) added to the IVC and in post-thawing (LC). LC supplementation increased the production of blastocysts in D7 by 22.0% and grade I embryos by 30.1% (P <0.05), in relation to Control and FORSK. In Experiment 1, the re-expansion rate in LC increased (P <0.05) 28.9% in relation to FORSK. In Experiment 2, two Control treatments were used for slow freezing (Classic and Modified). Hatching after 48 hours was greater (P <0.05) in LC compared to FORSK and Classical and Modified Controls (77.5%, 41.9%, 40.5%, 40.8% respectively). In the LC treatment, there was a decrease (P <0.05) of 64.7% in the degenerate embryo rate in relation to the Classical Control. Treatment with delipidators reduced LI content (P <0.001) by 2.2 fold in FORSK and four times in the LC compared to Control. The addition of 0.6 mg / mL of L-carnitine to the culture medium and the post-thawing increased the rate of in vitro production of bovine embryos acting positively on mitochondrial potential, reducing the amount of intracellular lipids and cellular apoptosis and increasing cryotolerance of embryos submitted to the modified slow freezing protocol. / A delipidação química tem sido utilizada como alternativa para a melhoria da criotolerância em embriões produzidos in vitro (PIV). Este estudo foi realizado objetivando avaliar o efeito da Lcarnitina (LC) sobre o desenvolvimento e a sobrevivência de embriões bovinos PIV vitrificados pelo método Cryotop no primeiro ensaio, e no segundo ensaio o efeito comparado da LC e Forskolin em embriões criopreservados por Cryotop (Experimento 1), ou por congelamento lento modificado (Experimento 2). Para isto foram avaliadas a atividade mitocondrial, o conteúdo de lipídeos intracitoplasmático (LI), a apoptose celular e a eclosão após o aquecimento. No primeiro ensaio a LC foi utilizada na concentração de 0,6 mg/mL no meio para maturação (MIV), cultivo (CIV) e/ou recultivo embrionário (REC), em quatro tratamentos: sem LC (Controle), LC adicionado ao CIV (LCiv), LC ao CIV+LC ao REC (LCivR), e LC ao MIV/CIV+ LC ao REC (LMivCR). A adição de LC aumentou (P <0,05) a produção de blastocistos em D7 em 28,6% (LCiv), a quantidade de embriões grau I em 36,9% (LCivR), a taxa de re-expansão em 22,7%, a eclosão em 20,1% (LCiv) e a atividade mitocondrial foi 1,9 vezes maior (P <0,001) (LCivR) em relação ao Controle. A quantidade LI foi 29% menor em LCiv e LCivR e 50,2% em LMivCR comparado Controle (P <0,001). No segundo ensaio os embriões foram cultivados sem adição de delipidadores (Controle), na presença de 10µM de Forskolin adicionado ao CIV no D5 (FORSK) ou L-carnitina (0,6 mg/mL) adicionada ao CIV e ao recultivo (LC). A suplementação com LC aumentou a produção de blastocistos em D7 em 22,0% e de embriões grau I em 30,1% (P <0,05), em relação ao Controle e ao FORSK. No Experimento 1 a taxa de re-expansão no LC aumentou (P <0,05) 28,9% em relação ao FORSK. No Experimento 2 foram utilizados dois tratamentos Controle para congelamento lento (Clássico e Modificado). A eclosão após 48 horas foi maior (P < 0,05) no LC em comparação ao FORSK e aos Controles Clássico e Modificado (77,5%, 41,9%, 40,5%, 40,8% respectivamente). No tratamento LC foi observada diminuição (P < 0,05) de 64,7% na taxa de embriões degenerados em relação ao Controle Clássico. O tratamento com delipidadores reduziu o conteúdo de LI (P < 0,001) em 2,2 vezes em FORSK e quatro vezes no LC comparados ao Controle. A adição de 0,6 mg/mL de L-carnitina aos meios de cultivo e recultivo aumentou a taxa de produção in vitro de embriões bovinos atuando positivamente sobre a atividade mitocondrial, reduzindo a quantidade de lipídeos intracelulares e a apoptose e aumentando a criotolerância dos embriões submetidos ao protocolo de congelamento lento modificado.

A ineficiência dos protocolos de criopreservação limita o uso em larga escala da produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação e pelo cultivo embrionário de embriões bovinos produzidos in vitro após a descongelação, avaliando a morfologia, a expressão gênica e o desenvolvimento in vitro antes e após a criopreservação. Complexos cummulusoócitos foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=600) obtidos entre os dias 7 e 9 de cultivo (fecundação D0) foram submetidos a congelação controlada (grupo controlado: 10% de etileno glicol (EG) por 10 minutos, 1,2oC por minuto), congelação rápida (grupo rápido: 10% de EG por 10 minutos , 20% de EG + 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos) ou vitrificação (grupo vitrificação: 10% de EG por 10 minutos, 25% EG + 25% Gli por 30 segundos). Os embriões do grupo controle não foram expostos a crioprotetores e nem a protocolos de criopreservação, sendo avaliado o índice de eclosão 12 dias após a fecundação (46,09%). As palhetas para os protocolos de congelação rápida e vitrificação foram mantidas em vapor de nitrogênio líquido (0,8cm sobre o líquido) por 2 minutos e imersas no nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos em ar e 20 segundos em banhomaria a 25oC. Os embriões foram reidratados em solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de sacarose e em solução de PBS + 0,2% de BSA ambos por 3 minutos. Para avaliar o desenvolvimento, os embriões, após a descongelação, foram co-cultivados com células da granulosa em meio TCM199 ou SOFaa por 4 dias. Os dados foram analisados com o aplicativo PROC MIXED do programa SAS Sistems for Windows®. O grupo controlado apresentou índices de eclosão de 44,65% ± 5,94 e 11,65 ± 3,37 para o meio TCM199 e para o meio SOFaa, respectivamente. Embriões do grupo rápido não apresentaram eclosão, independente do meio de cultivo. O grupo vitrificação apresentou índices de eclosão de 9,43% ± 6,77 e 8,67% ± 4,47, respectivamente, em meio TCM199 e SOFaa. Os valores foram significativos quando p<0,05. O grupo controlado apresentou diferença em relação aos outros grupos em ambos os meios de cultivo. No meio TCM199 os índices de re-expansão e eclosão foram mais altos. Para a análise da expressão gênica, 2 pools de 10 blastocistos expandidos de embriões frescos e criopreservados (congelação controlada) foram utilizados para a extração de RNA. Foi feita reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) e de PCR em Tempo Real. Os resultados da reação de PCR em Tempo Real demonstraram que a quantidade de material não foi suficiente para a amplificação de produtos em todas as reações. Concluindo, o meio de cultivo TCM199 exerce influência sobre o desenvolvimento embrionário após a criopreservação, sendo mais apropriado do que o meio SOFaa. E, para proceder a análise da expressão gênica pela reação de PCR em Tempo Real é necessário número maior de blastocistos expandidos. / The inefficiency of embryo cryopreservation protocols limits the broad use of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The aim of this work was to identify the damage caused by cryopreservation and embryo culture of in vitro produced bovine embryos after thawing by morphological analysis, gene expression and in vitro development before and after cryopreservation. Cummulus-oocyte complexes were in vitro matured, fertilized and cultured. Expanded blastocysts (n= 600) harvested on days 7-9 were submitted controlled freezing [controlled group: 10% ethylene glycol (EG) for 10 minutes and 1.2oC per minute cryopreservation], quick-freezing [quick group: 10% EG for 10 minutes, 20% EG + 20% Glycerol (Gly) for 30 seconds] or vitrification [vitrification group: 10% EG for 10 minutes, 25% EG + 25% Gly for 30 seconds] protocols. The embryos of the control group were not exposed to cryoprotectant or crypreservation method and the hatching rate was evaluated on day12 post-insemination. The straws (quick and vitrification groups) were first placed on nitrogen vapor (0.8 cm over the liquid nitrogen) for 2 minutes and than immersed in liquid nitrogen. Embryos were thawed in air for 10 seconds followed by 25oC water bath for 20 seconds. Embryos were rehydrated in PBS + 0.2% BSA + 0.3M sucrose for 3 minutes and PBS + 0.2% BSA for the same time. In order to evaluate development of frozen-thawed embryos they were cocultured on granulosa cells in TCM 199 or SOFaa for 4 days. Hatching rate of control group was 46.09%. Data was analyzed by PROC MIXED model of SAS Sistems for Windows®. Controlled group hatching rate was 44.65% ± 5.94 and 11.65% ± 3.37 for TCM 199 and in SOFaa, respectively. Embryos submitted to quick group did not hatch regardless of culture condition. Vitrification group showed hatching rates of 9.43% ± 6.77 and 8.67% ± 4.47, respectively, in TCM 199 and SOFaa., and values were significant at p<0.05. The controlled group showed difference between the other groups of cryopreservation in both medium (TCM 199 and SOFaa). However, TCM 199 showed high rates of re-expansion and hatching. To gene expression analysis, 2 pools of 10 expanded blastocysts of fresh and cryopreserved embryos (controlled freezing) was used to RNA extraction, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) was done and submitted to a Real Time PCR. The results of the Real Time PCR showed that the amount of material was not enough to the amplification of products in all reactions. In conclusion, the culture medium influences the embryo development after the cryopreservation being TCM199 more appropriate than SOFaa. And more number of expanded blastocysts is necessary to analysis the gene expression in a Real Time PCR reaction.

Dentre as tecnologias de reprodução assistida (TRAs), a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é a mais amplamente estudada, além de possuir um grande interesse econômico. Entretanto, existem fatores que influenciam negativamente a taxa de produção embrionária e o sucesso da gestação. Sabe-se que embriões provenientes das TRAs apresentam frequentemente alterações epigenéticas, relacionadas principalmente ao microambiente no qual os gametas e embriões se desenvolvem. A suplementação com ácido fólico parece prevenir tais erros epigenéticos, visto que além de ser um importante composto vitamínico, ele pode atuar como doador de grupamentos metil e possui ação antioxidante. A adição de ácido fólico durante a maturação oocitária parece influenciar positivamente a PIVE, além de existir evidências de que ele possa alterar os níveis de metilação do DNA e a expressão de genes importantes ao desenvolvimento embrionário. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo, avaliar a influência de diferentes concentrações de ácido fólico durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos de diferentes qualidades (graus I e III) na produção embrionária e na expressão dos genes IGF2 e LIT1 em blastocistos bovinos. Para tanto, três diferentes concentrações de ácido fólico (10, 30 e 100µM) foram avaliadas durante a MIV, em que 2159 oócitos (1087 oócitos grau I e 1072 oócitos grau III) foram maturados, fertilizados e cultivados por sete dias. Os blastocistos foram avaliados quanto à (1) taxa de produção nos diferentes tratamentos e origem dos oócitos e (2) a expressão dos genes IGF2 e LIT1 foi investigada utilizando a transcrição reversa associada a PCR quantitativa. A análise estatística foi realizada através do teste t de Student. A avaliação da produção embrionária mostrou que a adição de 10µM de ácido fólico influencia positivamente a produção de embriões provenientes de oócitos grau III (p=0,017), enquanto em embriões provenientes de oócitos grau III não foi observada influência. O segundo tratamento mostrou que a adição de 30µM de ácido fólico parece não influenciar tanto embriões provenientes de oócitos grau I quanto grau III. Por outro lado, a adição de 100µM de ácido fólico prejudica o desenvolvimento de embriões provenientes de oócitos grau I (p=0,043), mas parece não influenciar os embriões provenientes de oócitos grau III. Quando avaliada a expressão gênica, o gene IGF2 foi expresso em 25% das amostras, sendo que, com exceção de uma amostra, todas eram provenientes de oócitos grau I. Apesar do gene LIT1 ser expresso em todas as amostras analisadas, não foram observadas diferenças entre os embriões cujos oócitos foram maturados na ausência ou na presença de ácido fólico, independente da concentração adicionada ou origem oocitária (graus I ou III). A adição de ácido fólico durante a maturação de oócitos bovinos parece ser interessante para a PIVE. No entanto, a concentração e a qualidade oocitária parecem ser fatores importantes para a produção embrionária, visto que menores concentrações favorecem oócitos de baixa qualidade enquanto que maiores concentrações prejudicam oócitos de maior qualidade. Por fim, as alterações na produção embrionária devido à adição de ácido fólico parecem não estar relacionada com os níveis de expressão dos genes IGF2 e LIT1. / Among assisted reproductive Technologies (ARTs), in vitro production (IVP) of bovine embryos is the most studied, besides exist a great economic interest. However, there are many factors that negatively influences production rates and pregnancy success. It\'s know that embryos produced by ARTs frequently present epigenetics alterations, related, specially, to the microenvironment where occurs the development of gametes and embryos. Supplementation with folic acid seems to prevent these epigenetics damages, since it is an important component and may act like a methyl donor and has antioxidant action. Folic acid addition during oocitary maturation seems to positively influences embryos IVP, in addition there are evidences that it may alter DNA methylation levels and expression of important genes during embryo development. Thus, this paper had as objective; evaluate different concentrations of folic acid during in vitro maturation (IVM) of different bovine oocytes (Grade I and III) on the embryo production and expression of IGF2 and LIT1 gene in the bovine blastocyst. For this purpose, three different folic acid concentrations (10, 30, and 100µM) were evaluated during IVM, when 2159 oocytes (1087 grade I and 1072 grade III) were matured, fertilized and cultured during seven days. Blastocysts were evaluated for (1) production rates in different treatments and oocyte type and (2) expression of IGF2 and LIT1 was investigated using quantitative reverse transcription PCR. Statistical analysis was realized using student t test. Embryo production analysis revealed that addition of 10µM of folic acid positively influences production of embryos from oocytes grade III (p=0,017), whereas in embryos from oocytes grade I this influence wasn\'t observed. The second treatment showed that 30µM of folic acid didn\'t influence both embryos from oocytes grade I and embryos from oocytes grade III. On the other hand, addition of 100µM of folic acid damages the development of embryos provide from oocytes grade I (p=0,043), but this wasn\'t observed in embryos provide from oocytes grade III. When evaluated gene expression, IGF2 gene were expressed in 25% of all samples, being that, with exception of one sample, all of them were embryos from oocytes grade I. Despite LIT1 expression were detected in all samples, wasn\'t observed statistical difference between embryos whose oocytes were matured in the absence or presence of folic acid, independent of concentration added or oocytes types (grades I ou III). Folic acid addition during bovine oocytes maturation seems to be interesting to embryo IVP. However, folic acid concentration and oocyte quality seems to be important factors to embryo production, since lower concentration its beneficial for lower quality oocytes, while higher folic acid concentration damage better oocytes. Finally, embryos production rates alterations due folic acid addition appears to be unrelated with expression levels of IGF2 and LIT1.

Cryopreservation is currently the universal method for embryo storage, transport, sanitary control and trading. The conventional bovine embryo freezing method still has some drawbacks such as the freezing period and costs of the freezing equipment. In order to decrease costs and time, the effect of thealose on ultra-rapid freezing with ethylene glycol was evaluated. Ninety seven in vivo produced bovine embryos were randomly distributed in two treatments for ultra-rápid deep freezing with 3.M ethylene glycol (T1; n= 46) and 3.M ethylene glycol + 0.3M trehalose (T2; n= 51). In T1, embryos were exposed to a 3.0M ethylene glycol in Emcare® (ICP) holding media and in T2 to a 3.0M ethylene glycol plus 0.3M trehalose in Emcare® holding media. Embryos of both treatments were kept for 2 minutes in the freezing solutions; loaded in 0,25cc straws and there after they were exposed to N2 vapor during 20 seconds to be plunged immediately into liquid nitrogen. After thawing, embryos were transferred to previously synchronized recipients resulting at 28 days in 7 (15.21%) pregnancies in T1 and also 7 (13.72%) in T2. No significant difference was detected between treatments (P>0.05). The trehalose and ethylene glycol solution is suitable for direct transfer of bovine embryos. However, the conception rate obtained in this study do not allow its indication for commercial embryo freezing. / A criopreservação tem fundamental importância na armazenagem, transporte, controle sanitário e comércio de embriões. O método de congelamento rápido convencional de embriões bovinos ainda apresenta entraves como o tempo de execução e o alto valor comercial do equipamento. Com a finalidade de minimizar tempo de congelamento e os custos, avaliou-se o efeito da trealose no congelamento ultra-rápido de embriões bovinos com etilenoglicol. Noventa e sete (n=97) embriões bovinos produzidos in vivo foram congelados pelo método ultra-rápido com 3,0M de etilenoglicol e 3,0M de etilenoglicol + 0,3M de trealose. Os embriões foram distribuídos aleatóriamente em dois tratamentos. No tratamento 1 (T1) quarenta e seis (n= 46) embriões foram expostos à solução de 3,0M de etilenoglicol em solução de manutenção Emcare®(ICP) e cinqüenta e um (n= 51) embriões foram congelados com 3,0M de etilenoglicol associado a 0,3M de trealose em solução de manutenção Emcare®. Os embriões foram mantidos na solução de congelamento por 2 minutos, envasados em palhetas de 025cc, expostos ao vapor de nitrogênio por 20 segundos e submersos no nitrogênio líquido. Após o descongelamento, os embriões foram transferidos para receptoras previamente sincronizadas, resultando aos 28 dias, em 7 (15,21%) gestações no T1 e 7 (13,72%) no T2. Não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos. O acréscimo de trealose ao etilenoglicol mostrou-se viável para a transferência direta dos embriões, porém o índice de concepção obtido ainda não permite sua indicação no congelamento comercial de embriões bovinos.

Apesar da melhoria no sistema de produção e cultivo dos embriões in vitro, cerca de 60% dos oócitos que entram no sistema, não atingem o estágio de blastocisto e a qualidade dos embriões obtidos é bastante variável quando comparadas com embriões produzidos in vivo. Este bloqueio pode ser afetado por íons inorgânicos, tampões, aminoácidos e composição da atmosfera gasosa. Partindo-se da premissa que há influência da mitocôndria sobre a ativação da morte celular programada levou-nos a formular a hipótese que ausência de fragmentação nuclear nos embriões antes das 72 hpi está relacionada com a ausência do potencial de membrana mitocondrial e a inibição da OXPHOS pela utilização de bloqueadores leva a manutenção de baixos níveis de potencial de membrana mitocondrial e baixas taxas de fragmentação nuclear nos embriões. Embriões foram produzidos in vitro mediante maturação durante 22 horas, fecundação e cultivo 18 horas após a inseminação (hpi). Decorridas 24hpi realizou-se o cultivo com 0% de oxigênio, a fim de bloquear o processo de OXPHOS. Após 48 hpi realizou-se o feeding do meio de cultivo (SOF) com inibidores da OXPHOS (antimicina A e/ou oligomicina, cianeto de potássio) em diferentes doses. O número de embriões 8 células foi determinado às 80 hpi, mesmo momento em que foram realizadas as técnicas de JC-1 e TUNEL. Verificou-se as 168 hpi o efeito dos tratamentos no desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos com a inibição da OXPHOS após 48 hpi com oligomicina e/ou antimicina A nas doses utilizadas não alterou a capacidade do embrião atingir o estádio de 8 células. Entretanto, esta inibição inviabilizou o desenvolvimento até o estádio de blastocisto. O tratamento com KCN permitiu o desenvolvimento até o estádio de 8 células e a blastocisto em taxas semelhantes ao controle. A inibição do cultivo na ausência do O2 inviabilizou o processo de cultivo. Já os resultados obtidos quanto ao &#936;mm e TUNEL evidenciam que os tratamentos dos embriões antimicina e/ou oligomicina levaram a um aumento do &#936;mm e fragmentação nuclear na maioria dos embriões testados. Portanto, não foi possível testar a hipótese de que o &#936;mm é necessário para o estabelecimento da MCP, todavia, foi observada uma correlação positiva entre &#936;mm e fragmentação nuclear. / Although in vitro embryo production has been improved in the last 2 decades, about 60% of the oocytes do not reach the blastocyst stage and embryo quality is very variable when compared with in vivo produced embryo. This developmental block can be affected by inorganic ions, buffers, aminoacids and gaseous atmosphere composition. The knowledge that there influence of mitochondria on the activation of the programmed cellular death led to formulate the hypothesis that nuclear fragmentation absence in embryos before 72 post insemination is related with absence of mitochondrial membrane potential and OXPHOS blockage by inhibiting agents, would cause the maintenance of low levels of mitochondrial membrane potential and low rates of embryo nuclear fragmentation. Embryos were cultured in vitro for 18 hours post insemination (hpi) and after 24 hpi, they were submitted to 0% oxygen culture, in order to block the OXPHOS process. At 48 hpi, feeding was performed with SOF medium containing OXPHOS inhibitors (antimycin A and/or oligomycin, potassium cyanide) in different concetrations. The numbers of 8 cell embryos were estimated at 80 hpi, the same moment that they were submitted to JC-1 probes and TUNEL for mitochondrial membrane potential and DNA damages evaluation, respectively. At 168 hpi the effect of the treatments was verified on embryonic development. The results obtained with the OXPHOS inhibition after 48 after hpi using oligomycin and/or antimycin A did not modify embryo capacity to reach 8 cell stage. However, this inhibition prevented development to the blastocyst stage. KCN treatment allowed development up to the 8 cell stage and blastocyst similar to controls. The absence of O2 prevented embryo development. The &#936;mm and TUNEL results showed that antimycin and/or oligomycin treatment increased &#936;mm and nuclear fragmentation in the majority of the embryos tested. In conclusion, it was not possible to test the hypothesis that &#936;mm is necessary to the establishment of MCP, but a positive correlation between &#936;mm and nuclear fragmentation was observed.

Apesar da melhoria no sistema de produção e cultivo dos embriões in vitro, cerca de 60% dos oócitos que entram no sistema, não atingem o estágio de blastocisto e a qualidade dos embriões obtidos é bastante variável quando comparadas com embriões produzidos in vivo. Este bloqueio pode ser afetado por íons inorgânicos, tampões, aminoácidos e composição da atmosfera gasosa. Partindo-se da premissa que há influência da mitocôndria sobre a ativação da morte celular programada levou-nos a formular a hipótese que ausência de fragmentação nuclear nos embriões antes das 72 hpi está relacionada com a ausência do potencial de membrana mitocondrial e a inibição da OXPHOS pela utilização de bloqueadores leva a manutenção de baixos níveis de potencial de membrana mitocondrial e baixas taxas de fragmentação nuclear nos embriões. Embriões foram produzidos in vitro mediante maturação durante 22 horas, fecundação e cultivo 18 horas após a inseminação (hpi). Decorridas 24hpi realizou-se o cultivo com 0% de oxigênio, a fim de bloquear o processo de OXPHOS. Após 48 hpi realizou-se o feeding do meio de cultivo (SOF) com inibidores da OXPHOS (antimicina A e/ou oligomicina, cianeto de potássio) em diferentes doses. O número de embriões 8 células foi determinado às 80 hpi, mesmo momento em que foram realizadas as técnicas de JC-1 e TUNEL. Verificou-se as 168 hpi o efeito dos tratamentos no desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos com a inibição da OXPHOS após 48 hpi com oligomicina e/ou antimicina A nas doses utilizadas não alterou a capacidade do embrião atingir o estádio de 8 células. Entretanto, esta inibição inviabilizou o desenvolvimento até o estádio de blastocisto. O tratamento com KCN permitiu o desenvolvimento até o estádio de 8 células e a blastocisto em taxas semelhantes ao controle. A inibição do cultivo na ausência do O2 inviabilizou o processo de cultivo. Já os resultados obtidos quanto ao &#936;mm e TUNEL evidenciam que os tratamentos dos embriões antimicina e/ou oligomicina levaram a um aumento do &#936;mm e fragmentação nuclear na maioria dos embriões testados. Portanto, não foi possível testar a hipótese de que o &#936;mm é necessário para o estabelecimento da MCP, todavia, foi observada uma correlação positiva entre &#936;mm e fragmentação nuclear. / Although in vitro embryo production has been improved in the last 2 decades, about 60% of the oocytes do not reach the blastocyst stage and embryo quality is very variable when compared with in vivo produced embryo. This developmental block can be affected by inorganic ions, buffers, aminoacids and gaseous atmosphere composition. The knowledge that there influence of mitochondria on the activation of the programmed cellular death led to formulate the hypothesis that nuclear fragmentation absence in embryos before 72 post insemination is related with absence of mitochondrial membrane potential and OXPHOS blockage by inhibiting agents, would cause the maintenance of low levels of mitochondrial membrane potential and low rates of embryo nuclear fragmentation. Embryos were cultured in vitro for 18 hours post insemination (hpi) and after 24 hpi, they were submitted to 0% oxygen culture, in order to block the OXPHOS process. At 48 hpi, feeding was performed with SOF medium containing OXPHOS inhibitors (antimycin A and/or oligomycin, potassium cyanide) in different concetrations. The numbers of 8 cell embryos were estimated at 80 hpi, the same moment that they were submitted to JC-1 probes and TUNEL for mitochondrial membrane potential and DNA damages evaluation, respectively. At 168 hpi the effect of the treatments was verified on embryonic development. The results obtained with the OXPHOS inhibition after 48 after hpi using oligomycin and/or antimycin A did not modify embryo capacity to reach 8 cell stage. However, this inhibition prevented development to the blastocyst stage. KCN treatment allowed development up to the 8 cell stage and blastocyst similar to controls. The absence of O2 prevented embryo development. The &#936;mm and TUNEL results showed that antimycin and/or oligomycin treatment increased &#936;mm and nuclear fragmentation in the majority of the embryos tested. In conclusion, it was not possible to test the hypothesis that &#936;mm is necessary to the establishment of MCP, but a positive correlation between &#936;mm and nuclear fragmentation was observed.