Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-08-24T13:21:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1177730 bytes, checksum: ae33210f9ef99d122bd42327540bae5c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-24T13:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1177730 bytes, checksum: ae33210f9ef99d122bd42327540bae5c (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bactérias ácido lácticas (BAL) foram isoladas do ambiente de produção de leite e avaliadas quanto ao potencial benéfico. Testes preliminares e análise por PCR foram aplicados para selecionar e identificar através de sequenciamento de rRNA 16S 15 cepas de BAL: Lactobacillus (n = 11; Lb. casei MSI1, Lb. casei MSI5, Lb. casei MRUV1, Lb. casei MRUV6, Lb. acidophilus MVA3, Lb. nagelli MSIV4, Lb. harbinensis MSI3, Lb. harbinensis MSIV2, Lb. fermentum SIVGL1, Lb. plantarum MLE5 e Lb. plantarum MSI2), Pediococcus (n = 2; P. pentosaceus MLEV8 e P. acidilactici MSI7) e Weissella (n = 2; W. paramesenteroides MRUV3 e W. paramesenteroides MSAV5). Todas as linhagens selecionadas apresentaram resistência ao baixo pH e à presença de sais biliares. O teste API ZYM foi realizado para caracterizar a atividade enzimática entre as cepas e foi observada elevada atividade β-galactosidase em 13 delas. Todas as cepas apresentaram alta taxa de sobrevivência ao suco gástrico e as condições intestinais simulados, capacidade de auto-agregação e co- agregação com micro-organismos indicadores e alta hidrofobicidade da superfície celular. A maioria das cepas foi positiva para os genes de adesão map e EFTu. Os resultados de deconjugação de sais biliares mostraram forte desconjugação para todas as cepas. Todas as cepas mostraram bons resultados para assimilar lactose. Após esta etapa de caracterização do potencial benéfico, as 15 BAL foram avaliadas quanto ao potencial de virulência e de resistência antimicrobiana. A produção de fatores de virulência (hemólise, gelatinase, lipase, desoxirribonuclease e aminas biogênicas: lisina, tirosina, histidina e a ornitina) foi avaliada por métodos fenotípicos, a 25 °C e 37 °C, bem como a resistência a 17 antibióticos. Os isolados foram também submetidos à análise de PCR para identificar a presença de 49 genes associados a fatores de virulência. Nenhuma das cepas apresentou atividade hemolítica, produção de gelatinase, lipase, desoxirribonuclease e aminas biogênicas. Das 15 cepas selecionadas, para 12 tipos de antibióticos no método de difusão em disco, todas as amostras foram resistentes à oxacilina e sulfa/trimetoprim, 14 foram resistentes a gentamicina, 11 foram resistentes a clindamicina, nove cepas foram resistentes à vancomicina, oito cepas para rifampicina, cinco foram resistentes a eritromicina, quatro foram resistentes à tetraciclina, duas cepas foram resistentes à ampicilina, uma cepa foi resistente ao cloranfenicol e nenhuma apresentou resistência ao imipenem. Para um teste quantitativo do antibiograma, 5 antibióticos em fitas Etest® (bioMérieux) foram selecionados. Todas as 15 cepas foram resistentes à vancomicina, duas para rifampicina, uma para gentamicina e uma para o cloranfenicol. Em relação aos genes relacionados com virulência, 19 dos 49 genes testados estavam presentes em algumas cepas. Após a caracterização do potencial virulento das 15 BAL, estas foram avaliadas quanto ao potencial tecnológico para aplicação na indústria de laticínios. Todas as cepas apresentaram capacidade de acidificação, atingindo valores de pH entre 0.73 e 2.11 em 24 horas: Lb. casei MRUV6 apresentou maior capacidade de acidificação (pH 2.11 após 24 h). Dez cepas foram capazes de produzir diacetil a 37 °C, com exceção de Lb. casei MSI1, Lb. harbinensis MSI3, Lb. fermentum SIVGL1, Lb. plantarum MLE5 e W. paramesenteroides MRUV3. Todas as cepas foram capazes de produzir exopolissacarídeos, e apenas duas cepas apresentaram atividade proteolítica (Lb. casei MSI5 e W. paramesenteroides MSAV5). Com base nessa caracterização, Lb. casei MRUV6 foi selecionado para produzir o leite fermentado, armazenado a 4 °C e 10 °C e monitorado até 35 dias de vida útil. As amostras foram submetidas a métodos fenotípicos e moleculares para avaliar a presença de Lb. casei MRUV6 (plaqueamento convencional e RT-PCR, verificando a expressão de gapdh, um gene housekeeping) e verificar a expressão do gene bsh, relacionado à resistência à sais biliares (RT-PCR). A população de Lb. casei MRUV6 se apresentou estável durante todo o período de armazenamento a 4 °C e 10 °C a níveis em torno de 9.9 log UFC/g e também pelo monitoramento da expressão do controle endógeno GAPDH. No entanto, o gene bsh não foi expresso durante o período de armazenamento. O estudo demonstrou o potencial uso da cepa de Lb. casei MRUV6 isolada de um ambiente lácteo para a produção de um produto lácteo fermentado e sua estabilidade durante o armazenamento a 4 °C e 10 °C. Todos os isolados do estudo apresentaram características benéficas, segurança para utilização em alimentos e potencial tecnológico para utilização na indústria de laticínios. Além disso, os mesmos podem ainda ser submetidos a estudos adicionais para avaliações in vivo e realizar a caracterização como probióticos. / Lactic acid bacteria isolated from dairy environment were evaluated for beneficial potential. Preliminary screening and PCR analysis were applied to select and identified through 16s rRNA sequencing 15 LAB strains: Lactobacillus (n = 11; Lb. casei MSI1, Lb. casei MSI5, Lb. casei MRUV1, Lb. casei MRUV6, Lb. acidophilus MVA3, Lb. nagelli MSIV4, Lb. harbinensis MSI3, Lb. harbinensis MSIV2, Lb. fermentum SIVGL1, Lb. plantarum MLE5 and Lb. plantarum MSI2), Pediococcus (n = 2; P. pentosaceus MLEV8 and P. acidilactici MSI7) and Weissella (n = 2; W. paramesenteroides MRUV3 and W. paramesenteroides MSAV5). All selected strains showed resistance to acidic pH and to presence of bile salt. API ZYM test characterized enzymatic activity of the strains and high β-galactosidase activity was observed in 13 strains. All strains presented high values for survival rate to simulated gastric and intestinal conditions, ability to auto and co-aggregate with indicators microorganisms and high cell surface hydrophobicity. Most of the strains were positive for map and EFTu beneficial genes. Strong bile salts deconjugation was applied for all strains and all strains showed good results for assimilating lactose. After this first part of the study, the 15 BAL were evaluated for potential virulence and antimicrobial resistance. The production of virulence factors (hemolysis, gelatinase, lipase, deoxyribonuclease and biogenic amines: lysine, tyrosine, histidine and ornithine) was assessed by phenotypic methods at 25 °C and 37 °C, as well as the resistance to 17 antimicrobials. The isolates were also subjected to PCR to identify the presence of 49 genes associated with virulence factors. None of the strains presented hemolytic activity or the production of gelatinase, lipase, deoxyribonuclease and tested biogenic amines. Of the 15 selected cultures, for 12 types of antibiotics in the disc diffusion method, all strains were resistant for oxacillin and sulfa/trimethoprim, 14 were resistant to gentamicin, 11 were resistant to clindamycin, nine strains were resistant to vancomycin, eight strains to rifampicin, five were resistant to erythromycin, four were resistant to tetracycline, two strains were resistant to ampicillin, one strain was resistant to chloramphenicol and none was resistant for imipenem. For a quantitative test of the antibiogram, five antibiotics were selected in Etest ® strips (bioMérieux). All 15 strains were resistant to vancomycin, two for rifampicin, one for gentamicin and one for chloramphenicol. Regarding the virulence related genes, 19 genes from 49 tested were present in some strains. Results showed that five cultures showed the presence of the int gene, four cultures showed the presence of the ant(4')-Ia gene, three cultures were positive for vanC2, cpd and tdc, two cultures for vanA, tet(K), tet(S), ermA, bcrR, mur-2ed, asa1 and ccf, and one culture was positive for vanC1, ermB, aph(3')-IIIa, aac(6’)-le-aph(2”)-Ia, bcrB and hyl. After characterizing the virulent potential of the 15 BAL, these strains were evaluated for the technological potential for application in the dairy industry. All strains presented acidification capacity, reaching pH values between 0.73 and 2.11 in 24 hours: Lb. casei MRUV6 presented the highest acidification ability (pH 2.11 after 24 h). Ten strains were able to produce diacetyl at 37 °C, except by Lb. casei MSI1, Lb. harbinensis MSI3, Lb. fermentum SIVGL1, Lb. plantarum MLE5 and W. paramesenteroides MRUV3. All strains were able to produce exopolysaccharides, and only two strains presented proteolytic activity (Lb. casei MSI5 and W. paramesenteroides MSAV5). Based on this characterization, Lb. casei MRUV6 was selected for producing fermented milk, stored at 4 °C and 10 °C and monitored until 35 days of shelf life. Samples were subjected to phenotypical and molecular methods to quantify the presence of Lb. casei MRUV6 (conventional plating and RT-PCR, by checking the expression of gapdh, a housekeeping gene) and to verify the expression of bsh gene, related to resistance to bile salts (RT-PCR). Lb. casei MRUV6 population was stable during storage period at 4 and 10 °C at levels around 9.9 log CFU/g, and by monitoring the expression of gapdh gene. However, bsh gene was not expressed during storage period. The study demonstrated the potential use of the beneficial strain Lb. casei MRUV6 isolated from a dairy environment for the production of a fermented milk product, and its stability during storage at 4 and 10 °C. All isolates from the study presented beneficial characteristics, safety for use in food and technological potential for use in the dairy industry. In addition, they may further be subjected to further studies for in vivo evaluations and characterization as probiotics.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-21T15:03:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1299382 bytes, checksum: 25fc4d8303ddcd9bca8411b22d10cc7b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-21T15:03:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1299382 bytes, checksum: 25fc4d8303ddcd9bca8411b22d10cc7b (MD5) Previous issue date: 2018-07-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os produtos lácteos possuem uma microbiota autóctone bastante diversificada, na qual o grupo das Bactérias Ácido Lácticas (BAL) é de notável relevância devido às suas características benéficas, tecnológicas e bioconservantes, atraindo o interesse para sua utilização em diversos segmentos biotecnológicos, em especial na indústria de alimentos. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar BAL bacteriocinogênicas de queijos artesanais, caracterizando aspectos ligados à produção e purificação das bacteriocinas, inocuidade, potencial benéfico dos isolados e propriedades inibitórias contra Listeria spp. As cepas bacteriocinogênicas Enterococcus hirae ST57ACC e Pediococcus pentosaceus ST65ACC foram isoladas a partir da técnica de tripla camada e identificadas por metodologias fenotípicas e moleculares. As bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC demostraram estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura, e foram inativadas após tratamento com enzimas proteolíticas, comprovando sua natureza proteica. Tratamentos com EDTA, SDS, NaCl e Tween 80 não afetaram a atividade das bacteriocinas. Os sobrenadantes de ambos os isolados foram capazes de inibir Listeria innocua e diversas cepas de L. monocytogenes pertencentes à diferentes sorogrupos e obtidas de fontes distintas, inibindo completamente o desenvolvimento de L. monocytogenes após 12 h. Em co-culturas das cepas bacteriocinogênicas com a cepa indicadora L. monocytogenes 422 em leite desnatado, observou-se que E. hirae ST57ACC foi capaz de controlar a multiplicação do patógeno após 48 h. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus não apresentaram resultados positivos para 25 genes relacionados a bacteriocinas conhecidas, indicando que podem produzir novas bacteriocinas. As cepas de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram também avaliadas quanto ao seu potencial benéfico e segurança: ambos os isolados permaneceram viáveis após tratamento em condições gastrointestinais simuladas, exibindo altos níveis de auto e co-agregação com L. monocytogenes e níveis variados de hidrofobicidade, demonstrando que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC podem prevenir potencialmente o estabelecimento de infecções pelo patógeno. Por meio da metodologia de agar-spot, avaliou-se a possibilidade de interferência de 33 medicamentos comerciais, de diferentes grupos sobre a multiplicação de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC, revelando que apenas antiinflamatórios e medicamentos contendo loratadina e cloridrato de propranolol apresentaram atividade inibitória sobre as cepas. Testes fenotípicos para determinação da susceptibilidade antimicrobiana demonstraram que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram resistentes à vancomicina, oxacilina e sulfa/trimetoprim dentre os 11 antibióticos testados pelo método de disco difusão. Com relação à PCR, poucos genes relacionados à resistência a antibióticos foi foram identificados. Nenhum dos isolados amplificou genes de produção de aminas biogênicas e nem apresentou produção das mesmas. A expressão de diferentes elementos do sistema de transporte ABC e metabolismo de açúcares foi identificada para ambos os isolados. Variações na proporção de inóculo não influenciaram a taxa de multiplicação de E. hirae ST57ACC nem de P. pentosaceus ST65ACC, no entanto, a produção de bacteriocinas foi detectada apenas 9 horas após a inoculação das cepas, quando inoculadas nas proporções de 5% e 10%. Adicionalmente, verificou-se que a densidade celular das cepas bacteriocinogênicas esteve correlacionada à produção de bacteriocinas em sistemas de fermentação tradicional e fermentação com controle de pH a 5,5 e agitação. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram capazes de se multiplicar e produzir bacteriocinas na presença de xilo-oligossacarídeos após 6 horas de incubação, porém em níveis reduzidos quando comparados ao cultivo em meio MRS. Por fim, as bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram purificadas a partir de diferentes metodologias. A bacteriocina produzida por P. pentosaceus ST65ACC foi purificada em duas etapas, com rendimento final de 101,33 revelando- se um peptídeo com massa molecular de 3,5 a 8,5 kDa, determinado por SDS-PAGE. Em contrapartida, um protocolo de três etapas foi empregado na purificação da bacteriocina produzida por E. hirae ST57ACC, com rendimento final de 3,05. Adicionalmente, uma fração semi-purificada foi testada com a linhagem celular HT- 29, demonstrando que a bacteriocina não apresenta efeitos citotóxicos contra células humanas, sendo considerada segura neste aspecto. Os dados obtidos neste trabalho indicam que os isolados E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST57ACC podem ser considerados importantes ferramentas biotecnológicas na produção de bacteriocinas de interesse ao controle de L. monocytogenes e na biopreservação de alimentos. / Dairy products present a rich and diverse autochthonous microbiota, in which Lactic Acid Bacteria (LAB) are relevant, due to their beneficial, technological and biopreservative features, attracting the interest for their biotechnological application, in food industry, pharmaceutic area and human and veterinary medicine fields. The aim of this study was to isolate and to identify bacteriocinogenic LAB from artisanal cheeses, characterizing some aspects linked to bacteriocin production and purification, safety and beneficial potential of the isolates, as well as their inhibitory properties against Listeria spp. Bacteriocinogenic strains Enterococcus hirae ST57ACC and Pediococcus pentosaceus ST65ACC were isolated by using the triple- layer technique and identified by phenotypical and molecular methods. Bacteriocins produced by E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were stable in a wide range of pH and temperature, losing their activity after treatment with proteolytic enzymes, confirming their proteinaceous nature. Treatments with EDTA, SDS, NaCl and Tween 80 did not affect bacteriocin activity. Cell-free supernatants from both isolates were able to inhibit Listeria innocua and several L. monocytogenes strains, from different serogroups obtained from diverse sources, eliminating L. monocytogenes after 12 h. In co-culture experiments conducted in skimmed milk with the bacteriocinogenic isolates and the target strain L. monocytogenes 422, E. hirae ST57ACC controlled the target strain growth after 48 h. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC did not present positive results for 25 known bacteriocin related genes, indicating that they might express new bacteriocins. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC were also evaluated for their beneficial and safety features: both isolates remained viable after treatment replicating gastrointestinal conditions, showing high levels of auto and co-aggregation with L. monocytogenes and diverse levels of hydrophobicity, demonstrating that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC might prevent the establishment of infections caused by this pathogen. Interference of 33 commercial drugs from different groups on growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC was tested by agar-spot method, revealing that only anti-inflammatories and drugs containing loratadine and propranolol hydrochloride influenced the growth of bacteriocinogenic strains. Phenotypical tests employed to determine antibiotic susceptibility have shown that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were resistant to vancomycin, oxacillin and sulfa/trimethoprim out of 11 antibiotics tested by disk-diffusion test, nonetheless low number of antibiotic resistance genes was observed by PCR analysis. None of the isolates amplified biogenic amines encoding genes neither presented phenotypical evidence of their production. Expression of different ABC transporters linked to bacteriocin export and sugar metabolism was detected, for both isolates. Changes in inoculum size did not influenced the growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC; however, bacteriocin production was affected, and bacteriocins were detected only after 9 h with inoculation at 5% and 10% of bacteriocinogenic strains. Additionally, it was observed that cell density of both bacteriocinogenic strains was linked to bacteriocin production in traditional and pH at 5.5 and agitation controlled fermentation continuous. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were capable to grow and produce bacteriocins in the presence of xylo-oligossacharides after 6 h of incubation, but in lower levels than those obtained with cultivation in MRS broth. Finally, E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were purified from different methods. The bacteriocin produced by P. pentosaceus ST65ACC was purified in two-steps, with final yield of 101.33, recognized as a 3.5 to 8.5 kDa peptide, determined by Tricine-SDS-PAGE. In contrast, a three-step-protocol was used to purify the bacteriocin produced by E. hirae ST57ACC, with final yield of 3.05. Moreover, a semi-purified fraction of E. hirae ST57ACC bacteriocin was tested in HT-29 cell-line, demonstrating no-cytotoxic effects in human cells, which means the bacteriocin can be considered safe in this aspect. Obtained data from this study indicate that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST57ACC may be considered as important biotechnological tools for bacteriocin production to control L. monocytogenes and as biopreservatives in food.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-24T11:56:18Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1299382 bytes, checksum: 25fc4d8303ddcd9bca8411b22d10cc7b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-24T11:56:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1299382 bytes, checksum: 25fc4d8303ddcd9bca8411b22d10cc7b (MD5) Previous issue date: 2018-07-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os produtos lácteos possuem uma microbiota autóctone bastante diversificada, na qual o grupo das Bactérias Ácido Lácticas (BAL) é de notável relevância devido às suas características benéficas, tecnológicas e bioconservantes, atraindo o interesse para sua utilização em diversos segmentos biotecnológicos, em especial na indústria de alimentos. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar BAL bacteriocinogênicas de queijos artesanais, caracterizando aspectos ligados à produção e purificação das bacteriocinas, inocuidade, potencial benéfico dos isolados e propriedades inibitórias contra Listeria spp. As cepas bacteriocinogênicas Enterococcus hirae ST57ACC e Pediococcus pentosaceus ST65ACC foram isoladas a partir da técnica de tripla camada e identificadas por metodologias fenotípicas e moleculares. As bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC demostraram estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura, e foram inativadas após tratamento com enzimas proteolíticas, comprovando sua natureza proteica. Tratamentos com EDTA, SDS, NaCl e Tween 80 não afetaram a atividade das bacteriocinas. Os sobrenadantes de ambos os isolados foram capazes de inibir Listeria innocua e diversas cepas de L. monocytogenes pertencentes à diferentes sorogrupos e obtidas de fontes distintas, inibindo completamente o desenvolvimento de L. monocytogenes após 12 h. Em co-culturas das cepas bacteriocinogênicas com a cepa indicadora L. monocytogenes 422 em leite desnatado, observou-se que E. hirae ST57ACC foi capaz de controlar a multiplicação do patógeno após 48 h. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus não apresentaram resultados positivos para 25 genes relacionados a bacteriocinas conhecidas, indicando que podem produzir novas bacteriocinas. As cepas de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram também avaliadas quanto ao seu potencial benéfico e segurança: ambos os isolados permaneceram viáveis após tratamento em condições gastrointestinais simuladas, exibindo altos níveis de auto e co-agregação com L. monocytogenes e níveis variados de hidrofobicidade, demonstrando que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC podem prevenir potencialmente o estabelecimento de infecções pelo patógeno. Por meio da metodologia de agar-spot, avaliou-se a possibilidade de interferência de 33 medicamentos comerciais, de diferentes grupos sobre a multiplicação de E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC, revelando que apenas antiinflamatórios e medicamentos contendo loratadina e cloridrato de propranolol apresentaram atividade inibitória sobre as cepas. Testes fenotípicos para determinação da susceptibilidade antimicrobiana demonstraram que E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram resistentes à vancomicina, oxacilina e sulfa/trimetoprim dentre os 11 antibióticos testados pelo método de disco difusão. Com relação à PCR, poucos genes relacionados à resistência a antibióticos foi foram identificados. Nenhum dos isolados amplificou genes de produção de aminas biogênicas e nem apresentou produção das mesmas. A expressão de diferentes elementos do sistema de transporte ABC e metabolismo de açúcares foi identificada para ambos os isolados. Variações na proporção de inóculo não influenciaram a taxa de multiplicação de E. hirae ST57ACC nem de P. pentosaceus ST65ACC, no entanto, a produção de bacteriocinas foi detectada apenas 9 horas após a inoculação das cepas, quando inoculadas nas proporções de 5% e 10%. Adicionalmente, verificou-se que a densidade celular das cepas bacteriocinogênicas esteve correlacionada à produção de bacteriocinas em sistemas de fermentação tradicional e fermentação com controle de pH a 5,5 e agitação. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram capazes de se multiplicar e produzir bacteriocinas na presença de xilo-oligossacarídeos após 6 horas de incubação, porém em níveis reduzidos quando comparados ao cultivo em meio MRS. Por fim, as bacteriocinas produzidas por E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC foram purificadas a partir de diferentes metodologias. A bacteriocina produzida por P. pentosaceus ST65ACC foi purificada em duas etapas, com rendimento final de 101,33 revelando- se um peptídeo com massa molecular de 3,5 a 8,5 kDa, determinado por SDS-PAGE. Em contrapartida, um protocolo de três etapas foi empregado na purificação da bacteriocina produzida por E. hirae ST57ACC, com rendimento final de 3,05. Adicionalmente, uma fração semi-purificada foi testada com a linhagem celular HT- 29, demonstrando que a bacteriocina não apresenta efeitos citotóxicos contra células humanas, sendo considerada segura neste aspecto. Os dados obtidos neste trabalho indicam que os isolados E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST57ACC podem ser considerados importantes ferramentas biotecnológicas na produção de bacteriocinas de interesse ao controle de L. monocytogenes e na biopreservação de alimentos. / Dairy products present a rich and diverse autochthonous microbiota, in which Lactic Acid Bacteria (LAB) are relevant, due to their beneficial, technological and biopreservative features, attracting the interest for their biotechnological application, in food industry, pharmaceutic area and human and veterinary medicine fields. The aim of this study was to isolate and to identify bacteriocinogenic LAB from artisanal cheeses, characterizing some aspects linked to bacteriocin production and purification, safety and beneficial potential of the isolates, as well as their inhibitory properties against Listeria spp. Bacteriocinogenic strains Enterococcus hirae ST57ACC and Pediococcus pentosaceus ST65ACC were isolated by using the triple- layer technique and identified by phenotypical and molecular methods. Bacteriocins produced by E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were stable in a wide range of pH and temperature, losing their activity after treatment with proteolytic enzymes, confirming their proteinaceous nature. Treatments with EDTA, SDS, NaCl and Tween 80 did not affect bacteriocin activity. Cell-free supernatants from both isolates were able to inhibit Listeria innocua and several L. monocytogenes strains, from different serogroups obtained from diverse sources, eliminating L. monocytogenes after 12 h. In co-culture experiments conducted in skimmed milk with the bacteriocinogenic isolates and the target strain L. monocytogenes 422, E. hirae ST57ACC controlled the target strain growth after 48 h. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC did not present positive results for 25 known bacteriocin related genes, indicating that they might express new bacteriocins. E. hirae ST57ACC e P. pentosaceus ST65ACC were also evaluated for their beneficial and safety features: both isolates remained viable after treatment replicating gastrointestinal conditions, showing high levels of auto and co-aggregation with L. monocytogenes and diverse levels of hydrophobicity, demonstrating that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC might prevent the establishment of infections caused by this pathogen. Interference of 33 commercial drugs from different groups on growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC was tested by agar-spot method, revealing that only anti-inflammatories and drugs containing loratadine and propranolol hydrochloride influenced the growth of bacteriocinogenic strains. Phenotypical tests employed to determine antibiotic susceptibility have shown that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were resistant to vancomycin, oxacillin and sulfa/trimethoprim out of 11 antibiotics tested by disk-diffusion test, nonetheless low number of antibiotic resistance genes was observed by PCR analysis. None of the isolates amplified biogenic amines encoding genes neither presented phenotypical evidence of their production. Expression of different ABC transporters linked to bacteriocin export and sugar metabolism was detected, for both isolates. Changes in inoculum size did not influenced the growth of E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC; however, bacteriocin production was affected, and bacteriocins were detected only after 9 h with inoculation at 5% and 10% of bacteriocinogenic strains. Additionally, it was observed that cell density of both bacteriocinogenic strains was linked to bacteriocin production in traditional and pH at 5.5 and agitation controlled fermentation continuous. E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were capable to grow and produce bacteriocins in the presence of xylo-oligossacharides after 6 h of incubation, but in lower levels than those obtained with cultivation in MRS broth. Finally, E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST65ACC were purified from different methods. The bacteriocin produced by P. pentosaceus ST65ACC was purified in two-steps, with final yield of 101.33, recognized as a 3.5 to 8.5 kDa peptide, determined by Tricine-SDS-PAGE. In contrast, a three-step-protocol was used to purify the bacteriocin produced by E. hirae ST57ACC, with final yield of 3.05. Moreover, a semi-purified fraction of E. hirae ST57ACC bacteriocin was tested in HT-29 cell-line, demonstrating no-cytotoxic effects in human cells, which means the bacteriocin can be considered safe in this aspect. Obtained data from this study indicate that E. hirae ST57ACC and P. pentosaceus ST57ACC may be considered as important biotechnological tools for bacteriocin production to control L. monocytogenes and as biopreservatives in food.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-12-15T14:55:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 399989 bytes, checksum: b78aa7781df8301e72ce7e0ff6bdfbdc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-15T14:55:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 399989 bytes, checksum: b78aa7781df8301e72ce7e0ff6bdfbdc (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Capítulo 1 - Foram conduzidos dois experimentos para avaliar os efeitos de tipo silagem e níveis de proteína bruta (PB) na dieta de bovinos Nelore. As dietas experimentais foram constituídas por silagem de Stylosanthes (SSt) ou silagem de milho (SM) com dois níveis de PB, 110 e 130 g PB/kg de dieta na matéria seca (MS). A relação volumoso: concentrado foi de 50:50 com base na MS. No Experimento 1, foram utilizados quatro bovinos com média de peso corporal inicial de 450 ± 37,9 kg, canulados no rúmen e abomaso. Os animais foram distribuídos em um quadrado latino 4 × 4, em esquema fatorial 2 × 2, com quatro períodos de 16 dias. Neste experimento, foram coletadas amostras de líquido ruminal, digesta abomasal, fezes, urina e sangue. Além disso, foram estimados os parâmetros cinéticos de degradação da MS, PB e fibra em detergente neutro (FDN). No Experimento 2, 40 bovinos com média de peso corporal inicial de 374 ± 16,5 kg, distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 × 2, com dez repetições. O experimento teve duração de 99 dias, dividido em um período inicial de 15 dias de adaptação e um período de 84 dias de coleta de dados. No Experimento 2, foram avaliados o consumo, a digestibilidade dos nutrientes e o desempenho dos animais. As frações potencialmente degradáveis da MS, PB e FDN da SSt foram inferiores em relação a SM (P<0,004). As dietas contendo SSt apresentaram menor digestibilidade ruminal da matéria orgânica (MO) e menor digestibilidade total da MO, PB e FDN em comparação com as dietas contendo SM (P<0,050). As dietas contendo SSt apresentaram valores mais elevados de pH ruminal em comparação com dietas contendo SM (P=0,010). A concentração ruminal de N-NH 3 foi mais elevada para o nível de 130 g PB/kg de dieta, em comparação com 110 g PB/ kg de dieta (P<0,001). Os níveis de PB das dietas afetaram o nitrogênio ureico no sangue (P<0,001) e na urina (P=0,017), e em ambas as dietas contendo SSt e SM foram superiores para o nível de 130 g de PB/kg de dieta. As dietas contendo SSt apresentaram maior consumo de MS, MO, PB, FDN e fibra em detergente neutro indigestível (FDNi) em comparação dietas contendo SM (P<0,008). No entanto, a quantidade de nutrientes digeridos (kg/dia) foi semelhante entre os tratamentos (P>0,050). O tipo de silagem e nível de PB na dieta não apresentaram efeito sobre o desempenho produtivo (P>0,050), porém as dietas contendo SSt tenderam a diminuir a eficiência alimentar (P=0,085). Contudo, a SSt e o nível de 110 g PB/kg de dieta podem ser utilizados para alimentação na terminação de bovinos confinados. Capítulo 2 - Foram isoladas cento e cinquenta e uma cepas de bactérias do acido lático (BAL) da silagem de planta inteira de milho. As identificações foram baseadas na análise da sequência de rDNA 16S. As espécies predominantes foram Lactobacillus plantarum 53,0%, Pediococcus pentosaceus 11,9%, Lactobacillus buchneri 9,9%, Lactobacillus pentosus 5,3%, Weissella cibaria 4,6%, e Lactobacillus brevis 4,0%. As estirpes de Lactobacillus buchneri foram predominantes no dia 56 de ensilagem. Oito estirpes de L. buchneri foram pré-selecionadas de um total de 15 estirpes com base na taxa de crescimento e na produção de metabólitos. As estirpes selecionadas foram avaliadas na fermentação e estabilidade aeróbia de silagens de milho e cana-de-açúcar. Não houve melhoria no teor de MS, população de mofo e leveduras, perdas de MS e estabilidade aeróbia da silagem de milho (P>0,050) inoculadas com as estirpes 56.22, 56.27, 56.28, e 56.29. Enquanto as estirpes 56.1, 56.4 e a comercial 40788, quando inoculadas em silagem de cana-de-açúcar, apresentaram os maiores teores de MS e menores de perda de MS em comparação com a silagem contole (P<0,050). A estirpe comercial apresentou a menor população de mofos e leveduras após 90 dias de ensilagem (P = 0,024). No entanto, a estabilidade aeróbia não foi afetada. Após a exposição ao ar, todas as silagens deterioram e apresentaram elevada população de mofos e leveduras. A pré- seleção de estirpes de L. buchneri com base na produção de ácido acético apresentou os melhores resultados no processo de ensilagem. Assim, as estirpes 56.1 e 56.4 são promissoras para utilização como inoculante para silagem de cana-de-açúcar. / Chapter 1 - Two trials were conducted to evaluate the effects of silage crop and levels of dietary crude protein (CP) in Nellore beef cattle. The experimental diets consisted of Stylosanthes (StS) or corn silage (CS) with two levels of dietary CP, 110 and 130 g CP/kg diet on dry matter (DM) basis. The forage to concentrate ratio was 50:50 on a DM basis. In Experiment 1, four bulls were used, with an average initial body weight (BW) of 450 ± 37.9 kg, surgically cannulated in the rumen and abomasum. The bulls were assigned to a 4 × 4 Latin square with a 2 × 2 factorial design of treatments, and four 16-day periods. In this experiment, we collected ruminal fluid, abomasal digesta, feces, urine, and blood. In addition, the kinetic parameters of DM, CP and neutral detergent fiber (NDF) degradation were estimated. In Experiment 2, 40 bulls with an average initial BW of 374 ± 16.5 kg were distributed into a 2 × 2 factorial in a randomized design with ten replicates. The trial lasted 99 days and was divided into a 15-day period for adaptation and an 84-day period for data collection. The intake and digestibility of nutrients, as well as animal performance were evaluated in Experiment 2. The potentially degradable fractions of DM, CP, and NDF of StS were lower than CS (P<0.004). The diets containing StS showed lower ruminal digestibility of organic matter (OM) and lower total digestibility of OM, CP, and NDF than diets containing CS (P<0.050). The StS-based diets showed higher values for ruminal pH in comparison with CS-based diets (P=0.010). The ruminal NH 3 -N concentration was higher for the level of 130 g CP/kg diet in comparison with 110 g CP/kg diet (P<0.001). The dietary CP level affected urea nitrogen in blood (P<0.001) and urine (P=0.017), which in the diets containing StS and CS were higher at the level of 130 g CP/kg diet. The diets containing StS showed higher intake of DM, OM, CP, NDF, and indigestible neutral detergent fiber (iNDF) than diets containing CS (P<0.008). However, the amount of digested nutrients (kg/d) was similar between treatments (P>0.050). The silage crop and dietary CP levels had no effect on productive performance (P>0.050), but the StS-based diet tended to decrease feed efficiency (P=0.085). Thus, StS, as well as the level of 110 g CP/kg diet, can be used to feed finishing beef cattle. Chapter 2 - One hundred and fifty-one LAB strains were isolated from whole-plant corn silage in tropical weather. Their identifications were based on sequence analysis of 16S rDNA. The predominant species were Lactobacillus plantarum 53.0%, Pediococcus pentosaceus 11.9%, Lactobacillus buchneri 9.9%, Lactobacillus pentosus 5.3%, Weissella cibaria 4.6%, and Lactobacillus brevis 4.0%. Lactobacillus buchneri strains were predominant at day 56 of ensiling. Eight L. buchneri strains from a total of 15 were preselected, based on growth rate and metabolites production. The strains selected were evaluated on fermentation and aerobic stability of corn and sugarcane silages, four strains in each crop. There was no improvement of the inoculation with the strains 56.22, 56.27, 56.28, and 56.29 on the DM content, yeast and molds population, DM losses, and aerobic stability of corn silage (P > 0.050). Inoculated silages had lower concentration of acetic acid and higher ethanol in comparison with the control silage (P < 0.050). While the strains 56.1, 56.4, and 40788 showed highest DM content, and lowest DM losses when applied in sugarcane silage. At day 90 of ensiling, the commercial strain showed lowest population of yeasts and molds in sugarcane silage. However, the aerobic stability was not affected. After air exposure, all silages deteriorate and had high population of yeast and molds. Preselection of L. buchneri strains based on acetic acid production showed the best results on silage fermentation. Thus, the strains 56.1 and 56.4 are promising for use as an inoculant in sugarcane silages.

Bacteriocins are peptides produced by various species of bacteria, especially lactic acid bacteria (LABs), which exhibit a large spectrum of action against spoilage bacteria and foodborne pathogens. However, when this bacteriocin has not been completely characterized regarding its amino acid and the nucleotide sequences of the corresponding gene, the qualified term bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) is recommended. In order to increase the antimicrobial activity of bacteriocins, the ability of probiotics LABs, such as Pediococcus pentosaceus, to ferment different carbon and nitrogen sources has been studied. For the development of an improved culture medium, carbon and nitrogen sources must be considered as nutrients responsible for cell growth and bacteriocin production. The best condition, after 48 h of cultivation, for growth (3.420 g/L) and for BLIS production by Pediococcus pentosaceus ATCC 43200 was in Man, Rogosa and Sharp (MRS) culture medium supplemented with 1.5% peptone, initial pH 6.0 and under the following culture conditions: anaerobiosis, 30oC and agitation of 200 rpm. Compared with control (MRS without supplement), the growth of Pediococcus was significantly lower (1.995 g/L) as well as it reduced significantly its generation time from 2.05 h (control) to 1.28 h (MRS supplemented), a reduction of approximately 62.5%. Moreover, addiction of peptone to MRS medium promoted reduction of 4 h to the Pediococcus exponential phase onset. Regarding BLIS antimicrobial activity, addition of nitrogen source to MRS medium was also quite significant. Through the agar diffusion method, BLIS showed inhibition halos between 12.50 and 19.50 mm against LABs strains (Lactobacillus sakei ATCC 15521, Lactobacillus plantarum CECT 221 and Carnobacterium piscicola CECT 4020). Against Listeria strains (Listeria innocua NCTC 111288 and Listeria seeligeri NCTC 11289), their antimicrobial activity was better detected in liquid medium assay, evaluating the minimal inhibitory concentration of 50%. BLIS was able to inhibit 60 and 100% of L. seeligeri and L. innocua, respectively, as well as, diluted 1x (v/v) in water was able to inhibit 100% growth of both Listeria. BLIS 17 showed also good results as food preservative when applied in ready-to-eat pork ham artificially contaminated with L. seeligeri in vacuum-package at 4oC during shelf life of 10 days. BLIS was able to maintain low Listeria multiplication, lower samples weight loss, low lipid peroxidation and good color parameters during samples storage. Results demonstrated the importance of optimizing the culture medium to increase microbial mass, to produce and to improve the activity of this antimicrobial molecule. Moreover, results also suggest the possible application of BLIS as a natural food preservative. / Bacteriocinas são peptídeos produzidos por várias espécies de bactérias, especialmente bactérias ácido-láticas (BALs) e apresentam um amplo espectro de ação contra bactérias deteriorantes e patógenos de origem alimentar. Entretanto, quando estas bacteriocinas não foram completamente caracterizadas quanto a sequência de seus nucleotídeos e do seu gene correspondente, é recomendada a denominação de substância semelhante a bacteriocina (BLIS). Para aumentar a atividade antimicrobiana de bacteriocinas, a habilidade de BALs probióticas, como Pediococcus pentosaceus, em fermentar diferentes fontes de carbono e nitrogênio tem sido estudado. Para o desenvolvimento de um meio de cultura melhorado, fontes de carbono e nitrogênio devem ser consideradas como nutrientes responsáveis pelo crescimento celular e pela produção de bacteriocina. A melhor condição, após 48 h de cultivo, para o crescimento (3,420 g/L) e para a produção de BLIS por P. pentosaceus ATCC 43200 foi em meio de cultivo Man, Rogosa e Sharp (MRS) suplementado com 1,5% de peptona, pH inicial 6,0 e sob as seguintes condições de cultivo: anaerobiose, 30oC e agitação de 200 rpm. Comparado ao controle (MRS sem suplementação), o crescimento de Pediococcus foi significativamente menor (1,995 g/L) assim, como também, reduziu significativamente o tempo de geração de 2,05 h (controle) para 1,28 h (MRS suplementado), uma redução de aproximadamente 62,5%. Além disso, a adição de peptona ao meio MRS promoveu redução de 4 h para o início da fase exponencial de Pediococcus. Quanto a atividade antimicrobiana de BLIS, a adição de fonte de nitrogênio ao meio MRS também foi bastante significativa. Através do método ágar difusão, BLIS apresentou halos de inibição entre 12,50 a 19,50 mm contra cepas de BALs (Lactobacillus sakei ATCC 15521, Lactobacillus plantarum CECT 221 e Carnobacterium piscicola CECT 4020). Contra cepas de Listeria (Listeria innocua NCTC 11288 e Listeria seeligeri NCTC 11289), a sua atividade inibitória foi melhor detectada em meio líquido, através da determinação da concentração mínima inibitória de 50%. BLIS sem diluição foi capaz de inibir 60 e 100% de L. seeligeri e L. innocua, 15 respectivamente, assim como, diluído 1x (v/v) em água foi capaz de inibir 100% o crescimento de ambas Listeria. BLIS também apresentou bons resultados como conservante de alimento quando aplicado em presunto contaminado artificialmente com L. seeligeri e armazenado a 4oC a vácuo por 10 dias. BLIS foi capaz de manter baixa a multiplicação de Listeria, menor perda de peso das amostras, baixa peroxidação lipídica e bons parâmetros de cor durante o armazenamento das amostras. Os resultados demonstraram a importância de se otimizar meio de cultivo tanto para o aumento da massa microbiana como para a produção e melhoramento da atividade desta molécula antimicrobiana. Além disso, os resultados também sugerem a possível aplicação de BLIS como conservante natural de alimentos.

Bacteriocins are peptides produced by various species of bacteria, especially lactic acid bacteria (LABs), which exhibit a large spectrum of action against spoilage bacteria and foodborne pathogens. However, when this bacteriocin has not been completely characterized regarding its amino acid and the nucleotide sequences of the corresponding gene, the qualified term bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) is recommended. In order to increase the antimicrobial activity of bacteriocins, the ability of probiotics LABs, such as Pediococcus pentosaceus, to ferment different carbon and nitrogen sources has been studied. For the development of an improved culture medium, carbon and nitrogen sources must be considered as nutrients responsible for cell growth and bacteriocin production. The best condition, after 48 h of cultivation, for growth (3.420 g/L) and for BLIS production by Pediococcus pentosaceus ATCC 43200 was in Man, Rogosa and Sharp (MRS) culture medium supplemented with 1.5% peptone, initial pH 6.0 and under the following culture conditions: anaerobiosis, 30oC and agitation of 200 rpm. Compared with control (MRS without supplement), the growth of Pediococcus was significantly lower (1.995 g/L) as well as it reduced significantly its generation time from 2.05 h (control) to 1.28 h (MRS supplemented), a reduction of approximately 62.5%. Moreover, addiction of peptone to MRS medium promoted reduction of 4 h to the Pediococcus exponential phase onset. Regarding BLIS antimicrobial activity, addition of nitrogen source to MRS medium was also quite significant. Through the agar diffusion method, BLIS showed inhibition halos between 12.50 and 19.50 mm against LABs strains (Lactobacillus sakei ATCC 15521, Lactobacillus plantarum CECT 221 and Carnobacterium piscicola CECT 4020). Against Listeria strains (Listeria innocua NCTC 111288 and Listeria seeligeri NCTC 11289), their antimicrobial activity was better detected in liquid medium assay, evaluating the minimal inhibitory concentration of 50%. BLIS was able to inhibit 60 and 100% of L. seeligeri and L. innocua, respectively, as well as, diluted 1x (v/v) in water was able to inhibit 100% growth of both Listeria. BLIS 17 showed also good results as food preservative when applied in ready-to-eat pork ham artificially contaminated with L. seeligeri in vacuum-package at 4oC during shelf life of 10 days. BLIS was able to maintain low Listeria multiplication, lower samples weight loss, low lipid peroxidation and good color parameters during samples storage. Results demonstrated the importance of optimizing the culture medium to increase microbial mass, to produce and to improve the activity of this antimicrobial molecule. Moreover, results also suggest the possible application of BLIS as a natural food preservative. / Bacteriocinas são peptídeos produzidos por várias espécies de bactérias, especialmente bactérias ácido-láticas (BALs) e apresentam um amplo espectro de ação contra bactérias deteriorantes e patógenos de origem alimentar. Entretanto, quando estas bacteriocinas não foram completamente caracterizadas quanto a sequência de seus nucleotídeos e do seu gene correspondente, é recomendada a denominação de substância semelhante a bacteriocina (BLIS). Para aumentar a atividade antimicrobiana de bacteriocinas, a habilidade de BALs probióticas, como Pediococcus pentosaceus, em fermentar diferentes fontes de carbono e nitrogênio tem sido estudado. Para o desenvolvimento de um meio de cultura melhorado, fontes de carbono e nitrogênio devem ser consideradas como nutrientes responsáveis pelo crescimento celular e pela produção de bacteriocina. A melhor condição, após 48 h de cultivo, para o crescimento (3,420 g/L) e para a produção de BLIS por P. pentosaceus ATCC 43200 foi em meio de cultivo Man, Rogosa e Sharp (MRS) suplementado com 1,5% de peptona, pH inicial 6,0 e sob as seguintes condições de cultivo: anaerobiose, 30oC e agitação de 200 rpm. Comparado ao controle (MRS sem suplementação), o crescimento de Pediococcus foi significativamente menor (1,995 g/L) assim, como também, reduziu significativamente o tempo de geração de 2,05 h (controle) para 1,28 h (MRS suplementado), uma redução de aproximadamente 62,5%. Além disso, a adição de peptona ao meio MRS promoveu redução de 4 h para o início da fase exponencial de Pediococcus. Quanto a atividade antimicrobiana de BLIS, a adição de fonte de nitrogênio ao meio MRS também foi bastante significativa. Através do método ágar difusão, BLIS apresentou halos de inibição entre 12,50 a 19,50 mm contra cepas de BALs (Lactobacillus sakei ATCC 15521, Lactobacillus plantarum CECT 221 e Carnobacterium piscicola CECT 4020). Contra cepas de Listeria (Listeria innocua NCTC 11288 e Listeria seeligeri NCTC 11289), a sua atividade inibitória foi melhor detectada em meio líquido, através da determinação da concentração mínima inibitória de 50%. BLIS sem diluição foi capaz de inibir 60 e 100% de L. seeligeri e L. innocua, 15 respectivamente, assim como, diluído 1x (v/v) em água foi capaz de inibir 100% o crescimento de ambas Listeria. BLIS também apresentou bons resultados como conservante de alimento quando aplicado em presunto contaminado artificialmente com L. seeligeri e armazenado a 4oC a vácuo por 10 dias. BLIS foi capaz de manter baixa a multiplicação de Listeria, menor perda de peso das amostras, baixa peroxidação lipídica e bons parâmetros de cor durante o armazenamento das amostras. Os resultados demonstraram a importância de se otimizar meio de cultivo tanto para o aumento da massa microbiana como para a produção e melhoramento da atividade desta molécula antimicrobiana. Além disso, os resultados também sugerem a possível aplicação de BLIS como conservante natural de alimentos.