AU COURS DE LA THESE, L'ETUDE DU TRANSCRIPTOME DE SOUCHES GARDEL ET SENEGAL VIRULENTES ET ATTENUEES D'E. RUMINANTIUMA ETE REALISEE. UNE ANALYSE DU TRANSCRIPTOME A DIFFERENTS STADES DE DEVELOPPEMENT, A D'ABORD ETE EFFECTUEE POUR LA SOUCHE GARDEL VIRULENTE. AU STADE CORPS RETICULE (FORME INTRACELLULAIRE NON INFECTIEUSE), UNE SUREXPRESSION DES GENES CODANT POUR DES PROTEINES IMPLIQUEES DANS LE METABOLISME, LE TRANSPORT ET L'ECHANGE DE NUTRIMENTS ET DANS LA RESISTANCE AU STRESS OXYDATIF ETAIT OBSERVEE. IL SEMBLERAIT QUEE. RUMINANTIUMMETTE EN PLACE UN PANEL DE MECANISMES POUR SA SURVIE ET SON DEVELOPPEMENT A L'INTERIEUR DE LA CELLULE HOTE. AU STADE CORPS ELEMENTAIRE (FORME EXTRACELLULAlRE INFECTIEUSE), LE GENE DKSA CODANT POUR UN FACTEUR DE TRANSCRIPTION ETAIT SUREXPRIME. CE GENE A ETE MONTRE COMME ETANT IMPLIQUE DANS LA REGULATION DE FACTEURS DE VIRULENCE. IL SEMBLERAIT . DONC, QU'AU STADE CORPS ELEMENTAIRE, IL Y AIT UNE INDUCTION DE MECANISMES DE VIRULENCE. LA COMPARAISON DE L'EXPRESSION DES GENES AU STADE CORPS ELEMENTAIRE ENTRE SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES A AUSSI ETE EFFECTUEE. NOS RESULTATS ONT MONTRE UNE MODIFICATION IMPORTANTE DE LA MEMBRANE POUR LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. POUR LES SOUCHES ATTENUEES, IL A ETE MONTRE UNE SUREXPRESSION DES GENES IMPLIQUES DANS LA BIOGENESE MEMBRANAlRE ET UNE SOUS-EXPRESSION·DES PROTEINES DE LA FAMILLE MULTIGENIQUE MAP. CES RESULTATS SUGGERENT QUE LES PROTEINES MAP JOUENT UN ROLE DE LEURRE VIS-A-VIS DE LA REPONSE IMMUNITAIRE PROTECTRICE. DES PROTEINES MEMBRANAlRES HYPOTHETIQUES SONT SUREXPRIMEES A LA FOIS CHEZ LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. CERTAINES D'ENTRE ELLES SUREXPRIMEES CHEZ LES SOUCHES ATTENUEES SEMBLENT ETRE DE BONS CANDIDATS VACCINAUX ET DEVRAIENT ETRE ETUDIEES / Transcriptomic study of gardel and senegal both virulent and attenuated e. ruminantium strains was conducted during my phd. an analysis of transcriptome at different stages of development has been first conducted for virulent gardel strain. at reticulate body stage (intracellular form non-infectious), over-expression of genes coding for proteins involved in metabolism, transport and exchange of nutrients and resistance to oxidative stress was observed. at this stage of development, e. ruminantium seems to activate mechanisms for its survival and development within the host cell. at elementary body stage, dksa the gene encoding for a transcription factor was over-expressed. this gene has been shown to be involved in the regulation of virulence factors. it seems, therefore, at the elementary body stage, e. ruminantium induces its virulence factors. secondly, we compare the transcriptome of elementary body between virulent and attenuated strains. our results showed an important membrane modification of attenuated and virulent strains. for attenuated strains, we observed an over-expression of genes involved in membrane biogenesis and a diminution of expression of map multigenic family. it seems that map proteins subvert the protective immune response. hypothetical membrane proteins are over-expressed in both virulent and attenuated strains. some over-expressed proteins in attenuated strains seem to be good vaccine candidates and willstudied.

Suite à la découverte des antibiotiques, les succès thérapeutiques ont laissé présager un avenir où les maladies infectieuses d’origine bactérienne seraient éradiquées. Cependant, en moins d’un siècle, l’utilisation massive des antibiotiques à large spectre a conduit à l’émergence de résistances réduisant ainsi les options thérapeutiques. Mon projet de recherche vise à comprendre les altérations métaboliques et morphologiques bactériennes induites précocement par les antibiotiques et à contribuer au développement de tests diagnostiques rapides et fiables pour favoriser la mise en place d’antibiothérapies plus ciblées. Grâce au suivi des modifications des divers paramètres métaboliques et morphologiques des bactéries après traitement aux antibiotiques, nous avons montré l’intérêt des marqueurs de viabilité tels que le DiBAC4(3), le TOPRO®-3 ou encore l’Alexa FluorTM Hydrazide pour la détection rapide (<3h) de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. Nous avons notamment montré, pour la première fois, que la carbonylation des protéines, qui est induite dans des conditions de stress oxydatif et de vieillissement cellulaire, est un marqueur précoce universel de la sensibilité aux antibiotiques bactéricides. Suite à cette première partie de l’étude, nous avons souhaité comprendre les mécanismes mis en jeu par les bactéries en réponse au stress létal causé pas les antibiotiques. Au cours de nos expériences, il a été observé que lorsque les conditions ne permettaient plus la survie de l’organisme, un signal de fluorescence intrinsèquement lié à la bactérie permettait de prédire l’issue fatale après seulement 2 heures d’incubation avec l’antibiotique. En effet, suite à un traitement avec un antibiotique bactéricide ciblant la synthèse du peptidoglycane bactérien (ampicilline), nous avons observé une fluorescence maximale des cellules à la dose d’antibiotique correspondant à la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI). L’augmentation de la fluorescence des cellules bactériennes a aussi été observé lors du traitement létal avec un agent biocide (hypochlorite de sodium). Cependant, ce phénomène n’est plus observable avec des antibiotiques bactériostatiques ou bactéricides qui inhibent la synthèse protéique indiquant l’importance d’un métabolisme bactérien actif. Les corrélations de propriétés spectrales nous ont permis de suspecter les molécules de flavines comme étant responsables du phénomène d’autofluorescence observé. De plus, nous avons montré une suractivation de la voie de biosynthèse des cofacteurs de type flavines et des flavoprotéines en présence d’ampicilline. Finalement, nous avons effectué des expériences de tri et de survie cellulaire de populations bactériennes traitées à l’ampicilline. Nos résultats ont montré que les cellules très fluorescentes ont une survie moyenne 5 fois supérieure aux cellules peu fluorescentes. Ceci suggère que le signal de fluorescence observé est une réponse cellulaire médiée par les composés flavonoïdes pour tenter de survivre au traitement antibiotique. Des travaux exploratoires suggèrent que le phénomène étudié chez les bactéries est conservé chez les levures et chez les cellules humaines. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension de la physiologie bactérienne, l’étude de la réponse bactérienne face à un stress exogène et la surveillance rapide de la viabilité des cellules. / Following the discovery of antibiotics, the therapeutic successes foreshadowed a future where infectious diseases of bacterial origin would be eradicated. However, in less than a century, the massive use of broad-spectrum antibiotics led to the emergence of resistance thus reducing therapeutic options. My research project aims to understand early bacterial metabolic and morphological changes induced by antibiotics and to contribute to the development of rapid and reliable diagnostic tests to promote the implementation of more targeted antibiotic treatments. By monitoring changes in various metabolic and morphological parameters of bacteria after antibiotic treatment, we have shown the interest of viability markers such as DiBAC4(3), TOPRO®-3 or Alexa FluorTM Hydrazide for rapid detection (<3h) of bacterial susceptibility to antibiotics. In particular, we have shown for the first time that protein carbonylation, which is induced under conditions of oxidative stress and cellular aging, is a universal early marker of bactericidal antibiotic susceptibility. Following this first part of the study, we wanted to understand the mechanisms involved in bacterial response to lethal stress caused by antibiotics. Following this first part of the study, we wanted to understand the bacterial mechanisms involved in response to lethal stress caused by antibiotics. In our experiments, it was observed that when the conditions no longer allowed the organism survival, a fluorescence signal intrinsically linked to the bacterium allowed to predict the fatal outcome after only 2 hours of incubation. Indeed, following a treatment with a bactericidal antibiotic targeting the synthesis of bacterial peptidoglycan (ampicillin), we observed a maximum fluorescence of the cells at the dose of antibiotic corresponding to the Minimum Inhibitory Concentration (MIC). The fluorescence increase of bacterial cells was also observed during the lethal treatment with a biocidal agent (sodium hypochlorite). However, this phenomenon is no longer observable with bacteriostatic or bactericidal antibiotics that inhibit protein synthesis indicating active bacterial metabolism importance. The correlations of spectral properties allowed us to suspect the flavin molecules as responsible for the observed autofluorescence phenomenon. In addition, we showed an overactivation of the biosynthesis pathway of flavin-type cofactors and flavoproteins occurring during ampicillin treatment. Finally, we performed cell sorting and cell survival experiments of ampicillin-treated bacterial populations. Our results showed that highly fluorescent cells have an average survival 5 times higher than low fluorescent cells. This suggests that the fluorescence signal observed is a cellular response mediated by flavonoid compounds in an attempt to survive to antibiotic treatment. Exploratory work suggests that the phenomenon studied in bacteria is conserved among yeasts and human cells. These results open new perspectives in bacterial physiology understanding, the study of bacterial response to exogenous stress and the rapid monitoring of cell viability.

Les acides gras libres et liés, comprenant les acides monocarboxyliques saturés et insaturés, les acides dicarboxyliques, les (α, β, ω, et ω-1) hydroxyacides et les acides phénoliques, ont été analysés le long d'une carotte sédimentaire de Cadagno (Suisse) dans le but de déterminer les variations des sources et des conditions de déposition de la matière organique en fonction de la profondeur. Les résultats montent que des événements épisodiques tels que les avalanches, glissements de terrains, crues torrentielles, sont plus fréquents entre 0 et 51 cm. Par contre, entre 51 et 245 cm, la sédimentation était plus calme, faible et caractérisée par une contribution plus élevée de la matière organique des plantes supérieures. L'étude microscopique de la matière organique confirme aussi ces résultats. Des acides gras branchés iso- et anteiso- ayant un nombre d'atomes de carbone entre C21 et C29 non mentionnés dans la littérature géochimique jusqu'à présent, ont été détectés dans les fractions liées. Ils proviennent probablement des bactéries spécifiques à ce lac. Finalement, il a été démontré que la source des α- et β-hydroxyacides sédimentaires ayant un nombre d'atomes de carbone < c10 est la même que celles de leurs homologues supérieurs, c.à.d., les bactéries gram-négatives.

Ce travail avait pour but : 1) de vérifier l'existence d'une relation entre espèces génomiques et écotypes associés aux plantes chez Agrobacterium spp.; 2) d'identifier les zones génomiques impliquées dans la différentiation en écotypes et, partant, en espèces génomiques dans ce taxon. Nous avons d'abord cherché et caractérisé au niveau génomique (par AFLP) des écotypes non-pathogènes et pathogènes (hébergeant un plasmide Ti), dans différents biotopes. Nos résultats montrent que la plante sélectionne des écotypes spécifiques au sein de la communauté des agrobactéries du sol. De plus, il apparaît que c'est parmis les écotypes spécifiques d'une plante donnée que sont recrutées certaines agrobactéries pathogènes isolées des tumeurs. L'AFLP prédictive réalisée sur le génome de la souche C58 nous a ensuite permis d'identifier les fragments AFLP caractéristiques de l'espèce G8. Les gènes et fonctions ainsi révèlées pourraient effectivement concerner des relations plantes-bactéries.

Les répétitions en tandem sont constituées de successions de motifs d'ADN. Ces structures présentes dans tous les organismes, procaryotes comme eucaryotes, ont des applications dans de nombreux domaines. Depuis quelques années seulement, les répétitions en tandem sont étudiées chez les bactéries. Le polymorphisme associé à ces séquences peut être utilisé pour le génotypage de bactéries pathogènes, permettant une identification précise au niveau de la souche. Le polymorphisme des séquences répétées est de deux types : polymorphisme de longueur et mutations internes aux motifs. Les génomes des deux bactéries pathogènes responsables d'infections nosocomiales, Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa, ont été étudiés dans le but d'identifier des séquences répétées polymorphes. Un ensemble de marqueurs polymorphes a été validé expérimentalement pour ces deux espèces permettant un typage dit MLVA (pour « Multiple Locus VNTR Analysis »). Le travail plus classique de typage par la taille de la répétition a été complété par un travail de séquençage de certains allèles. Les résultats obtenus montrent comment le typage « MLVA » complété si nécessaire par le séquençage d'allèles, pourraient constituer de nouvelles méthodes peu coûteuses participant au contrôle des infections bactériennes.

La détection, voire l'identification, de bactéries dans l'air trouve une large application dans le domaine civil (diagnostic médical, surveillance de la qualité des aliments, de l'eau, de l'air ou du sol,...) et militaire (défense biologique). L'objectif principal de cette thèse a été, d'une part, d'étudier la diversité génétique de Bacillus anthracis et, d'autre part, d'analyser la composition bactérienne de prélèvements atmosphériques. L'identification précise de souches de B. anthracis (étude de la diversité de cette espèce bactérienne) repose, d'une part, sur une approche par typage de répétitions en tandem et, d'autre part, sur une approche par typage de mutations ponctuelles. Les résultats obtenus par ces deux méthodes indépendantes sont en accord. Cependant, les répétitions en tandem apportent une bien meilleure résolution. L'étude de la composition bactérienne de l'air participe à la validation d'un système de détection. Celui-ci doit être capable de caractériser en moins d'une heure, la présence de quelques bactéries par litre d'air de l'environnement. Le protocole développé ici permet de détecter 1 pg d'ADN pur en moins de deux heures, sans faire appel à une étape d'amplification génique. L'analyse du bruit de fond atmosphérique tire parti de ce protocole, à l'exception de quelques modifications qui permettent d'analyser un plus grand nombre d'échantillons. Les résultats de quatre collectes soulignent que le bruit de fond atmosphérique peut varier de demi-heure en demi-heure. Le seuil de sensibilité de la méthode est d'environ 100 bactéries par litre d'air.

Grâce à leurs propriétés particulières dues à leur petite taille, les nanomatériaux (dimension < 100 nm) sont utilisés dans de nombreuses applications grand public (cosmétique, matériaux nanostructurés,...). Cependant, leur présence grandissante inquiète car leur impact potentiel sur les humains et l'environnement reste mal connu. Cette étude est consacrée à une compréhension approfondie des interactions physicochimiques et biologiques entre deux modèles cellulaires présents dans l'environnement : Synechocystis (cyanobactérie contribuant au maintien de la biosphère) et Escherichia coli (bactérie des intestins des mammifères) avec des nanoparticules d'oxyde de cérium (abondance environnementale croissante, ex : additif au diesel). <br />La complexité de l'étude des nanoparticules nécessite une approche différente (multidisciplinaire) de celle des tests de toxicité utilisés pour les composés classiques. En effet, nous montrons que les paramètres physicochimiques (stabilité, agrégation, dissolution et état de surface) des nanoparticules dans le milieu de contact, influencent fortement la toxicité observée sur les cellules. De plus, les interactions physicochimiques (floculation, adsorption, mécanismes redox) sont liées au modèle biologique, en particulier à la présence d'exopolysaccharides (chez Synechocystis) comme barrière naturelle entre la paroi cellulaire et les nanoparticules. La composition du milieu de dispersion des nanoparticules (notamment son pH) a aussi une influence majeure sur la toxicité (survie et intégrité membranaire). Tandis que pour E. coli, ce sont majoritairement les nanoparticules qui provoquent la mortalité (confirmé par analyses métabonomiques par RMN).

L'urbanisation accroît l'imperméabilisation des surfaces, donc augmente les volumes et les charges polluantes des eaux pluviales. Dans l'Est lyonnais, celles-ci sont traitées via des techniques alternatives, les bassins d'infiltration. Les polluants s'accumulent à la surface des bassins, mais leur devenir à long terme est peu connu. En particulier, les bactéries sont susceptibles de faciliter le transfert des métaux lourds à travers la zone non-saturée du sol vers la nappe phréatique sous-jacente. Le présent travail se propose donc d'étudier les mécanismes et les conditions de mobilisation et de transfert de trois cations métalliques (Zn, Cd, Cu) et des colloïdes bactériens, dans les conditions hydrodynamiques subies par les bassins d'infiltration in situ. <br />La mobilisation du cuivre depuis l'horizon pollué dépend fortement du transfert de la solution de sol et des conditions hydrodynamiques initiales et aux limites, tandis que les autres éléments sont dissous depuis une gangue organo-minérale commune, en quantités similaires quelles que soient les conditions expérimentales. Les concentrations en bactéries dans les effluents, enfin, ne dépendent ni de la teneur en eau initiale ni des conditions de flux. Les quantités de cuivre et de colloïdes organiques et minéraux potentiellement mobilisables depuis les horizons pollués sont élevées. Le sol sain sous-jacent retient partiellement la matière dissoute et particulaire, mais les chemins préférentiels et le transfert colloïdal, qui dépendent des conditions hydrodynamiques, favorisent le transfert des métaux. Par conséquent, un curage régulier des bassins et une rétention des particules en amont des bassins sont préconisés.

De nombreux métaux et métalloïdes sont indispensables au développement des sociétés humaines, qui ont exploité les gisements de divers éléments stratégiques depuis des siècles, voire des millénaires. Cependant, les êtres vivants dits " supérieurs " sont sensibles à la toxicité des métaux et métalloïdes : ces derniers peuvent causer des dommages importants à la santé des populations exposées, ainsi qu'à l'ensemble des écosystèmes contaminés. Les milieux riches en métaux et métalloïdes offrent cependant des niches écologiques favorables au développement de certains micro-organismes. La microflore de ces environnements est capable de résister à de fortes concentrations en métaux, et de nombreuses bactéries peuvent utiliser des métaux et des métalloïdes en tant que donneurs ou accepteurs d'électrons. Elles participent ainsi activement aux cycles biogéochimiques de ces éléments. Le présent mémoire est une synthèse des travaux réalisés par l'auteur entre 1990 et 2010 dans le domaine des biotechnologies et de la biogéochimie. Ces études ont été focalisées sur des processus bactériens de solubilisation ou d'immobilisation des métaux et/ou métalloïdes, en milieu neutre, modérément acide ou très acide. Les principaux sujets de recherche abordés ont été les suivants : * la biolixiviation acidophile des minerais sulfurés, et les interactions entre bactéries et fer dissous, * l'oxydation biologique de l'arsenic dans les environnements miniers, et l'application de ce phénomène dans le domaine du traitement des eaux, * l'utilisation de l'As(III) comme source d'énergie par des bactéries isolées, * les phénomènes de bio-réduction et bio-précipitation de métaux et métalloïdes, en particulier du chrome et de l'arsenic, en conditions de sulfato-réduction. Les différents travaux évoqués dans le présent mémoire ont porté soit sur la biogéochimie d'environnements pollués, soit sur la mise au point de procédés de bioremédiation. Le projet de recherche proposé pour les années à venir conservera cette dualité processus/procédés. Il sera focalisé sur les réactions qui modifient les formes des métaux et métalloïdes en présence de catalyseurs microbiens, et s'efforcera de quantifier le bénéfice potentiel tiré de ces réactions par les micro-organismes, en fonction des conditions physico-chimiques. Cette démarche permettra de cibler la recherche de niches écologiques où des métabolismes bactériens originaux, potentiellement exploitables en termes de procédés, pourraient être mis en évidence.

Les métaux sont omniprésents sur la planète et sont devenus nécessaires à tous les organismes vivants au cours de l'évolution. Cependant, la quantité de métal présent dans les cellules doit être très finement régulée car une quantité trop importante de métaux peut générer une toxicité. Pour assurer cette homéostasie, les cellules doivent être capables de réguler l'import et l'efflux des métaux par l'expression dynamique de protéines spécifi ques impliquées dans ces flux ioniques. Chez la bactérie modèle Escherichia coli, la toxicité du nickel et du cobalt est neutralisée par l'action de la pompe RcnA, protéine membranaire capable d'exporter les ions Ni2+ et Co2+ hors de la cellule. La production de RcnA est contrôlée par le métallorégulateur RcnR capable de détecter ces ions en cas d'excès et d'induire, en réponse à ce signal, l'expression du gène rcnA. Récemment, notre équipe a identi fié un nouveau gène que nous avons rebaptisé rcnB (précédemment yohN ). Ce gène fait partie de l'opéron rcnAB et est, comme rcnA, impliqué dans l'homéostasie des ions Ni2+ et Co2+. A l'inverse de rcnA, une souche mutante délétée de rcnB est plus résistante au nickel et au cobalt et cela est directement corrélée à une plus faible accumulation de métal dans les cellules. Le gène rcnB code pour une petite protéine monomérique de 10 kDa localisée dans le périplasme et ne possédant pas d'homologues décrits à l'heure actuelle. Aucune fixation des ions Ni2+ et Co2+ n'a été mise en évidence pour la protéine RcnB. Elle peut en revanche interagir avec les ions Cu+ et Cu2+ aussi bien in vitro que in vivo et un lien avec les systèmes de résistance au cuivre de E. coli a été mis en évidence. Or, le cuivre confère des propriétés d'oxydo-réduction particulières aux protéines qui pourraient être directement liées à la fonction de RcnB. Des investigations complémentaires sont nécessaires pour préciser la fonction exacte de RcnB, mais ce travail a mis en évidence le premier membre d'une nouvelle famille de protéines accessoires associées aux pompes d'efflux des ions métalliques.