Orientador: Ary Fernandes Júnior / Banca: Maria de Lourdes Ribeiro da Cunha / Banca: Rosemeire Cristina Lianhri Rodrigues Pietro / Resumo: A pesquisa por novas drogas antimicrobianas tem aumentado, seja na indústria farmacêutica e também na indústria de alimentos. Isso acontece devido ao aumento no número de bactérias resistentes aos antimicrobianos, e a busca por conservantes alimentares que possibilitem o aumento na vida de prateleira dos alimentos. O interesse por alimentos mais saudáveis, especialmente aqueles sem adição ou com quantidades reduzidas de aditivos químicos, vem aumentando constantemente. Os produtos naturais, especialmente os de origem microbiana e de espécies vegetais são considerados fontes importantes para o desenvolvimento de novos antimicrobianos. O trabalho teve como objetivo avaliar a ação antibacteriana de óleos essenciais de plantas, seus compostos majoritários, a ação antibacteriana da nisina (bacteriocina produzida por Lactococcus lactis) e a ação antibacteriana da combinação desses compostos majoritários com a nisina em meio de cultura e no leite. Inicialmente foi avaliado o potencial antibacteriano com a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos óleos essenciais de orégano (Origanum vulgare), tomilho (Tymus vulgaris), cravo da índia (Syzygium aromaticum) e canela (Cinnamomun zeylanicum) e respectivos compostos majoritários carvacrol, timol, eugenol e cinamaldeído, e da nisina sobre cepas padrões ATCC de bactérias de importância na área de alimentos: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli O157 ATCC 43895, Salmonella Enteritidis ATCC 13076, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Enterococcus faecalis ATCC 10100, Listeria monocytogenes ATCC 15313, Aeromonas hydrophila ATCC 7966 e Lactobacillus rhamnosus ATCC 9595 utilizando a metodologia da microdiluição em meio de Mueller Hinton Caldo (MHC). Em alguns casos a atividade inibidora dos óleos essenciais foi maior que a atividade do seu respectivo composto isolado, e em outros a atividade inibidora do composto isolado foi maior que ... / Abstract: The research for new antimicrobial drugs has increased in a pharmaceutical industry as well as in the food industry. This happens due to the increase in the number of bacteria resistant to antimicrobial agents, and the search for food preservatives which make possible the increase in the shelf life of foods. The interest in healthier foods, especially those without addition or with reduced amounts of chemical additives is increasing constantly. The natural products, especially of microbial origin and plant species are considered important sources for the development of new antimicrobial. This study purpose to evaluate the antibacterial activity of essential oils from plants, their major compounds, the antibacterial action of nisin (bacteriocin produced by Lactococcus lactis) and the antibacterial activity of the combination of these major compounds with nisin in culture medium and in milk. First was evaluated antimicrobial activity with determination of minimum inhibitory concentration (MIC) of the essential oils of oregano (Origanum vulgare), thyme (Tymus vulgaris), clove (Syzygium aromaticum) and cinnamon (Cinnamomun zeylanicum) and their major compounds carvacrol , thymol, eugenol and cinnamaldehyde, and nisin on ATCC strains of bacteria of importance in the food industry: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli O157 ATCC 43895, Salmonella Enteritidis ATCC 13076, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Enterococcus faecalis ATCC 10100, Listeria monocytogenes ATCC 15313, Aeromonas hydrophila ATCC 7966 and Lactobacillus rhamnosus ATCC 9595 using the microdilution method in Mueller Hinton Broth medium (MHC). In some cases the inhibitory activity of essential oils has been higher than the activity of the respective isolated compound, and in others the inhibitory activity of the compound isolate was greater than that of the respective essential oils, whereas nisin was active against Gram-positive bacteria and a lower inhibitory ... / Mestre

Mudanças nos hábitos alimentares dos consumidores têm aumentado a demanda por frutas frescas e polpas de frutas. Com isso, a busca por novos compostos com atividade antimicrobiana é de grande interesse, já que a aplicação de aditivos químicos convencionais em alimentos tem sido reavaliada devido à potencial toxicidade de alguns desses compostos. As bacteriocinas ou BLIS, produzidas por diferentes gêneros bacterianos, têm despertado grande interesse industrial para aplicação em alimentos em processos de bioconservação. No presente trabalho, foram obtidos 3 isolados bacterianos (A, B e C) a partir de polpa de abacaxi, produtores de substância antagonista frente a diferentes linhagens de Listeria monocytogenes e Bacillus sp. A natureza proteica das substâncias antagônicas produzidas pelos isolados foi confirmada pela sensibilidade à enzima ? - quimotripsina. As linhagens foram identificadas através de provas bioquímicas e moleculares como Bacillus cereus, com a colaboração da Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro, Brasil). Para estudos mais detalhados da BLIS foi selecionado o isolado C denominado Bacillus cereus LFB-FIOCRUZ 1640. A melhor condição de incubação para produção da BLIS foi a 30ºC/24 horas, em caldo MRS. A BLIS apresentou estabilidade térmica por até 30 minutos a 80ºC e em ampla faixa de pH frente a L. monocytogenes. A purificação da BLIS foi realizada com resina Amberlite XAD-16 e de troca catiônica SP-Sepharose \"Fast Flow\", tendo o extrato apresentado um fator de purificação de 4,1 vezes e rendimento de 30%. O extrato obtido foi liofilizado e uma alíquota foi analisada por SDS-PAGE, o que permitiu a estimativa da massa molecular da BLIS de 25 kDa. A Concentração Bactericida Mínima (CBM) de 2 mg/mL foi determinada frente ao indicador L. monocytogenes e esta concentração de extrato foi aplicada em sistema modelo contendo polpa de abacaxi. A BLIS teve ação bactericida inibindo completamente L. monocytogenes por 24h/ 37ºC. Neste sentido, a aplicação da BLIS na área de alimentos e outras áreas farmacêuticas poderá ser explorada em outros trabalhos. / Changes in habits of consumers, with preference for healthy foods, have increased the demand for fruits and fruit pulps. Thus, there is great interest in searching new compounds with antimicrobial activity, since the application of conventional additives in foods is of concern due to the toxicity of some of these compounds. The bacteriocins or BLIS, produced by different bacteria genera, have increased the interest for its industrial application in food technology in processes of biopreservation. In this study, three isolates were obtained (A, B and C) from pineapple pulp, which produce antagonistic substances with activity against Listeria monocytogenes and Bacillus sp. The proteinaceous nature of the antagonistic substance produced by the isolates was confirmed by susceptibility to the enzyme ? - chymotrypsin. The strains were identified by biochemical and molecular tests as Bacillus cereus, in collaboration with Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro, Brazil). Isolate C of Bacillus cereus was named LFB-FIOCRUZ 1640. The best condition of incubation for the BLIS production was 30°C for 24 hours in MRS broth. The BLIS was thermostable (up to 30 minutes at 80°C) and it was partially stable in the range of pH 2 to 9. The purification of the BLIS was performed with Amberllite XAD-16 and cation-exchange SP-Sepharose \"Fast Flow\" resins. The extract presented a purification factor of 4.1 times and 30% of yield. The extract was lyophilized and analyzed by SDS-PAGE. The molecular mass of the BLIS was estimated as 25 kDa. The Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of 2 mg/mL was determined with the indicator L. monocytogenes, and this concentration of extract was applied in a model system containing pineapple pulp. The BLIS had bactericidal action which completely inhibited L. monocytogenes for 24h/37°C. The BLIS of B. cereus 1640 presents potential for application as an antimicrobial in food and other pharmaceutical areas.

Além das características tecnológicas das bactérias lácticas para o processamento de alimentos fermentados, novas propriedades são requeridas, como a produção de bacteriocinas. Vários desses compostos protéicos possuem atividade antimicrobiana direcionada à patógenos e apresentam potencial de uso como bioconservadores naturais de alimentos. O objetivo desse trabalho foi avaliar a viabilidade de aplicação de cinco culturas lácticas produtoras de bacteriocinas como bioconservantes em alimentos. Avaliaram-se as propriedades de segurança e probióticas dessas culturas e determinaram-se os parâmetros de produção e purificação parcial das bacteriocinas, bem como os efeitos de fatores limitantes de crescimento (cloreto de sódio e nitrito). Os resultados demonstraram que essas linhagens não possuem atividade de enzimas indicadoras de patogenicidade (termonuclease, -hemolisinas e gelatinases). A tolerância às condições ácidas variou dependendo da linhagem. Lactobacillus plantarum CTC 368 e Enterococcus avium CTC 469 apresentaram maior tolerância a valores de pH 2,0 e 3,0. Lactococcus lactis subsp. cremoris CTC 204 e Enterococcus avium CTC 483 também apresentaram 100% de sobrevivência a pH 3,0 e, mesmo com uma diminuição da tolerância a pH 2,0, a sobrevivência foi cerca de 80%. Com relação à susceptibilidade aos sais de bile, observou-se que a viabilidade variou entre as linhagens em função da concentração e tempo de incubação. Enterococcus avium CTC 469 e Lactococcus lactis subsp. hordinae CTC 484 foram as mais tolerantes e apresentaram sobrevivência de 57% e 58%, respectivamente. As linhagens mostraram excelente sobrevivência tanto a baixos valores de pH, quanto às concentrações de sais biliares indicando potencial probiótico. As características de crescimento e de produção de bacteriocinas foram semelhantes para todas as linhagens e meios avaliados. A viabilidade aumentou durante o período de incubação e a produção de bacteriocinas mostrou uma cinética de metabólito primário. A suplementação do meio MRS com 1,0% de NaCl e 0,1% de NaNO2, não afetou o crescimento de Lc. lactis subsp. cremoris CTC 204, mas promoveu a redução da atividade da bacteriocina de 42,5% e 17,5%, respectivamente. O crescimento de Lactococcus lactis subsp. hordinae CTC 484 foi afetado com a adição de NaCl e NaNO2 ao meio APT, mas ainda reteve 50% da atividade bacteriocigênica. O espectro de atividade das bacteriocinas variou de acordo com a susceptibilidade da linhagem indicadora, a concentração ou atividade da bacteriocina, a viabilidade e/ou presença das células produtoras e os procedimentos de extração das bacteriocinas. Os resultados revelaram que as bacteriocinas de Lactococcus lactis subsp. cremoris CTC 204 e Lactococcus. lactis subsp. hordinae CTC 484 promoveram um efeito bactericida contra Staphylococcus aureus. Concluiu-se que essas duas culturas produtoras de bacteriocinas apresentam propriedades para utilização como bioconservantes em alimentos e que estudos mais aprofundados, relacionados com a purificação da bacteriocina e avaliação de seu uso em alimentos, devem ser realizados. / In addition to the technological characteristics of lactic bacteria for the processing of fermented foods, other properties need to be developed and explored, such as bacteriocin production. Several of these protein-based compounds have antimicrobial activities targeted towards pathogens and have a significant potential for use as natural biopreservatives in processed foods. The objective of this study was to evaluate the viability of using five bacteriocin-producing lactic cultures as biopreservatives in foods. The safety and probiotic properties of these cultures were evaluated, followed by the determination of bacteriocin production and purification parameters and the effect of growth-limiting factors (sodium chloride and nitrite). The results demonstrated that these strains do not show activity of marker enzymes of pathogenicity (thermonuclease, - hemolysins and gelatinases). Tolerance to acidic conditions varied depending on the specific strain. Lactobacillus plantarum CTC 368 and Enterococcus avium CTC 469 exhibited greater tolerance to pH values 2,0 and 3,0. Lactococcus lactis subsp. cremoris CTC 204 and En. avium CTC 483 also presented 100% survival at pH 3,0, and even with reduced tolerance at pH 2,0, the survival rate was 80%. Variation in susceptibility to bile salts was observed between the strains as a function of concentration and incubation time. En. avium CTC 469 and Lactococcus lactis subsp. hordinae CTC 484 were found to be the most tolerant, exhibiting survival rates of 57% and 58%, respectively. The strains demonstrated excellent survival not only at low pH values, but also at high bile salt concentrations, thereby indicating probiotic potential. The growth and bacteriocin-producing characteristics were similar for all the strains and culture media evaluated. Bacterial multiplication increased during the incubation period, while bacteriocin production displayed primary metabolite kinetics. The activity spectrum of the bacteriocins varied with the susceptibility of the indicator strain, the concentration or activity of the bacteriocin, the viability and/or presence of bacteriocinproducing cells and the bacteriocin extraction procedures. The results reveal that the bacteriocins produced by Lc. lactis subsp. cremoris CTC 204 and Lc. lactis subsp. hordinae CTC 484 exerted a bactericidal effect against Staphylococcus aureus. Supplementation of the MRS medium with 1,0% NaCl and 0,1% NaNO2, did not affect the growth of Lc. lactis subsp. cremoris CTC 204, but did reduce by 42,5% and 17,5% the activity of the bacteriocin, respectively. Growth of Lc. lactis subsp. hordinae CTC 484 was affected by the addition of NaCl and NaNO2 to the APT medium, but even so still exerted 50% of its bacteriocinogenic activity. It was concluded that Lc. lactis subsp. cremoris CTC 204 and Lc. lactis subsp. hordinae CTC 484 exhibited adequate properties for use as biopreservatives in foods and that more extensive studies related to the purification of bacteriocins and assessment of their use in foods should be conducted.

Peptídeos antimicrobianos são vistos como alternativas promissoras a serem empregadas pela iindústria farmacêutica no controle de infecções causadas por microrganismos, como também na indústria alimentícia, onde podem desempenhar papéis como conservantes naturais de alimentos. Plantaricina149 é um membro deste grupo, sendo composto por 22 resíduos de aminoácidos, com natureza catiônica e atividade inibitória sobre algumas bactérias patogênicas. Neste trabalho, foram sintetizados diferentes peptídeos análogos à Plantaricina149 para investigar suas ações sobre microrganismos (bactérias e fungos), a fim de correlacionar estes estudos com a ação lítica do peptídeo em modelos de membrana diversos (monocamadas e vesículas fosfolipídicas). A interação de Plantaricina149 com estes sistemas foi monitorada pelas espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência, ensaios de tensão superficial, calorimetria e ressonância plasmônica de superfície, e mostrou ser altamente específica para superfícies fosfolipídicas que apresentam densidade de cargas negativas, tais como a membrana celular de bactérias. A interação eletrostática inicial que se estabelece entre o peptídeo e os fosfolipídios é de extrema importância, sendo capaz de induzir uma estruturação helicoidal na região C-terminal do peptídeo, enquanto a região Nterminal contribui com as interações hidrofóbicas necessárias para a penetração do peptídeo nas camadas fosfolipídicas levando a ruptura das mesmas. De forma semelhante, a atividade antimicrobiana de Plantaricina149a (e alguns de seus análogos) também mostrou ser resultado das interações das duas regiões da molécula, e foi afetada com a retirada ou modificação da região N-terminal do peptídeo. Com a deleção desta região, o peptídeo passou a ter somente ação bacteriostática sobre Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, perdendo a capacidade bactericida. / Antimicrobial peptides are seen as promising alternatives to be employed in pharmaceutical industry for controlling infections caused by microorganisms, and also in food industry, where they can play roles as natural food preservatives. Plantaricina149 is a member of this group, constituted of 22 amino acid residues, cationic in nature and presenting inhibitory activity against some pathogenic bacteria. In this work, different Plantaricina149 analog peptides were synthesized to investigate their action against microorganisms (bacteria and fungi), with the aim of correlating these studies with the lytic action of the peptide on several membrane models (phospholipid monolayers and vesicles). The Plantaricina149 interaction with these systems was monitored by circular dichroism and fluorescence spectroscopies, surface tension assays, calorimetry and surface plasmon resonance, and showed to be highly specific to phospholipid surfaces that present negative charge density, such as the bacteria cell membrane. The initial peptide-phospholipids electrostatic interaction is extremely important, and it is capable of inducing a helical structure in the peptide C-terminal region, while the Nterminal region contributes with the hydrophobic interactions needed to the peptide penetration in the phospholipid layers and to the disruption of them. Similarly, the Plantaricina149 antimicrobial activity has also proved to be a result of the interactions from the two regions of the molecule, and it was strongly affected by the removal or modification of the peptide N-terminal region. Promoting the deletion of this region has left the peptide only with a bacteriostatic action against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, removing its bactericide ability.

Xylella fastidiosa é o agente causal de uma série de doenças que ocorrem em plantas economicamente importantes como laranjeiras, videiras e cafeeiros, causando no Estado de São Paulo prejuízos relevantes à indústria citrícola. Esta bactéria Gram-negativa é restrita ao xilema das plantas e à porção anterior do trato digestório dos insetos vetores das famílias Cicadellidae e Cercopidae, conhecidos como cigarrinhas. Tentativas de elucidar os mecanismos de virulência e patogenicidade adotados por esta bactéria apontam a formação do biofilme como etapa fundamental para o estabelecimento da infecção e o consequente desenvolvimento da doença na planta, mas fatores adicionais parecem contribuir, tais como a produção de toxinas. As bacteriocinas são proteínas com atividade antibiótica contra cepas próximas à espécie produtora e que já foram associadas à virulência e patogenicidade de outras bactérias. Uma varredura in silico no genoma de X. fastidiosa 9a5c revelou 13 sequências codificadoras de microcinas putativas no cromossomo. Transcritos de todos esses genes foram detectados por RT-qPCR em culturas de X. fastidiosa 9a5c, e análises comparativas com genomas públicos (cepas Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 e GB514) e recém sequenciados por nosso grupo de pesquisa (cepas U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x e Fb7) revelaram que cada cepa possui seu próprio arsenal de bacteriocinas. Diferenças encontradas in silico entre os loci de bacteriocinas nas cepas foram demonstradas experimentalmente. Nossos resultados comprovam a variabilidade predita nos quatro clusters de bacteriocinas que identificamos, o que é esperado para genes relacionados à adaptação e patogenicidade. Destes loci, três foram detectados por RT-PCR como transcritos policistrônicos. Nossa tentativa de detectar essas proteínas em culturas de X. fastidiosa (através de sequenciamento de polipeptídeos por HPLC-MS/MS) foi capaz de identificar uma das bacteriocinas putativas e, portanto, o conjunto de nossas observações apóia a continuidade dos estudos para elucidar o papel das bacteriocinas na fisiopatologia de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of diseases that affect several economically important crops such as sweet orange trees, grapevines and coffee trees, causing in the State of São Paulo considerable losses mainly to the citrus industry. This Gram-negative bacterium is restricted to the plant xylem and to the upper gastrointestinal tract of its insect vectors, the sharpshooters from the Cicadellidae and Cercopidae families. Attempts to elucidate the virulence and pathogenicity pathways employed by this bacterium point the biofilm formation as a fundamental step for the establishment of the infection and the consequent development of the plant disease, but additional factors seem to contribute to these processes, such as the production of toxins. Bacteriocins are proteinaceous antibiotics that act against closely-related species and have been previously associated with virulence and pathogenicity in other bacteria. An in silico screening of the X. fastidiosa 9a5c genome revealed 13 coding sequences as putative microcins in the chromosome. Transcripts from all those genes were detected through RT-qPCR in X. fastidiosa 9a5c cultures, and comparative analyses on the public genomes (Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 and GB514) plus the ones recently sequenced by our group (U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x and Fb7) revealed that each strain possesses its own arsenal of bacteriocins. Differences found in silico among the loci in all strains were experimentally confirmed. Our results demonstrated the predicted variability in the four bacteriocins clusters as expected for adaptation and pathogenicity-related genes. Three out of the four bacteriocins loci were detected by RT-PCR as polycistronic transcripts. Our attempt to detect these proteins in X. fastidiosa cultures (using HPLC-MS/MS polypeptide sequencing) identified one of the putative bacteriocins, and therefore our observations warrant further efforts to elucidate the role of bacteriocins in the X. fastidiosa physiopathology.

O charque é um produto cárneo tipicamente brasileiro, salgado e seco ao sol, ainda produzido de maneira artesanal. Durante sua produção há uma etapa de fermentação, realizada pela microbiota naturalmente presente na matéria-prima, o que dificulta a padronização do produto, e pode influenciar negativamente em suas características sensoriais e qualidade microbiológica. O controle da etapa de fermentação do charque seria uma alternativa para minimizar este problema e, neste contexto, as bactérias láticas produtoras de bacteriocinas se enquadram de forma interessante. A microbiota autóctone de charque inclui principalmente bactérias láticas e micro-organismos halofílicos e halotolerantes, sendo assim, este produto apresenta potencial como fonte para o isolamento de novas bactérias láticas produtoras de bacteriocinas. Assim, este trabalho teve por objetivo isolar e identificar culturas de bactérias láticas produtoras de bacteriocinas naturalmente presentes no charque, caracterizar parcialmente as bacteriocinas produzidas por essas culturas, avaliar seu potencial de aplicação neste produto para a melhoria de sua qualidade microbiológica e avaliar seu efeito na ecologia microbiana do charque, nas diferentes etapas de sua fabricação. Através da técnica de tripla camada em ágar foi isolada uma cepa de Lactococcus lactis subsp. lactis apresentando o gene codificador para nisina Z e com capacidade de inibir, in vitro, micro-organismos medianamente e altamente halotolerantes isolados de charque, além de outros micro-organismos deteriorantes e patogênicos importantes em alimentos, como Lactobacillus spp., Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus. A bacteriocina produzida pela cepa isolada neste estudo também possui características interessantes para sua aplicação na bioconservação de alimentos, como resistencia ao calor, presença de agente químicos e altos teores de NaCl, além de não ser afetada pelo pH. A aplicação dessa cepa em charque modelo resultou na redução de até 2 ciclos log na população de micro-organismos halotolerantes, indicando apresentar um potencial de aplicação como agente de bioconservação do produto. Os ensaios de avaliação da ecologia microbiana, empregando DGGE, indicaram que a fermentação natural do charque ocorreu com a participação de bactérias láticas dos gêneros Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus e de micro-organismos halotolerantes do gênero Staphylococcus. Além disso, os estudos referentes à dinâmica populacional demonstraram que a adição da cepa bacteriocinogênica ao charque não influenciou, de forma qualitativa, as populações presentes no produto. / Charqui is a Brazilian traditional meat product, salted and sun-dried, still manufactured without control of the fermentation step, which is performed by the indigenous microbiota. This fact interferes on the standardization of the product and can negatively affect the sensorial properties and microbiological quality. The application of a known microbiota would be an alternative to minimize this problem and the bacteriocin-producing lactic acid bacteria can can fit in this purpose. The charqui indigenous microbiota mainly includes lactic acid bactéria and halophilic and halotolerant microorganisms, therefore, this product presents a potencial as a source for the isolation of new bacteriocin-producing lactic acid bacteria. The aim of the present work was to isolate and identify bacteriocin-producing lactic acid bacteria from charqui, characterize the bacteriocins produced by the isolated culture, evaluate its potential as biopreservative in charqui and its influence on the microbial populations during the manufacture of the product. A bacteriocinogenic Lactococcus lactis subsp. lactis strain was isolated from charqui through the triple-layer agar technique. This strain produces a nisin-like bacteriocin capable to inhibit in vitro medium and highly halotolerant bacteria isolated from charqui and other food-borne pathogenic and spoilage microorganisms. The application of this strain for charqui manufacturing caused a reduction of up to 2 log in the halotolerant bacteria population, evidencing its potential application for charqui biopreservation. Studies in the populational dynamics using DGGE indicated that the presence of the bacteriocinogenic strain did not affect the microbial populations in the product.

O presunto cozido é um dos embutidos cárneos mais consumidos no Brasil, sendo também um dos mais sensíveis à deterioração por bactérias ácido láticas (BAL) e a contaminação por Listeria monocytogenes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana da nisina (Nisaplin®) aplicada em presunto cozido, a fim de controlar L. monocytogenes e BAL. Para tanto, presuntos cozidos foram preparados e fatiados individualmente pelas empresas DuPont e Marsul. No ensaio 1, o presunto foi injetado com salmoura contendo 12,5 mg de nisina por kg (dosagem aprovada no Brasil para queijos fundidos). O potencial bioconservante da nisina foi avaliado contaminando artificialmente as fatias do presunto com um pool composto por 5 cepas de L. monocytogenes. Os resultados do ensaio 1 demonstraram que o tratamento com nisina não teve efeito significativo sobre a população de L. monocytogenes. Já as BAL foram inibidas por 2 dias. No ensaio 2, a adição da nisina na mesma dosagem foi feita no tambleamento, inibindo a população de L. monocytogenes por 6 dias e BAL por 10 dias Em vista dos resultados obtidos nos 2 primeiros ensaios foi determinada a concentração mínima bactericida (CMB) do pool e dos isolados de L. monocytogenes, a fim de verificar a sensibilidade das cepas individualmente e em conjunto e o efeito da nisina sem a matriz cárnea. Além disso, também foi avaliado o efeito sinérgico ou antagônico da salmoura sobre a ação bactericida da nisina. Pôde-se constatar que as diferentes cepas de L. monocytogenes demonstraram perfis de sensibilidade diferentes e que o pool de cepas foi menos sensível ao efeito da nisina. Os resultados obtidos conduziram a avaliação de dosagem maior de nisina no presunto cozido. No ensaio 3, 32 mg/kg de nisina foram adicionadas a salmoura do presunto cozido e testados contra o pool de L. monocytogenes e a cepa ATCC 7644, separadamente. Os resultados demonstraram que a nova dosagem de nisina inibiu significativamente a multiplicação do pool de L. monocytogenes e da cepa ATCC 7644, durante 10 dias, sugerindo ser uma barreira efetiva no controle de L. monocytogenes em presunto cozido. / Precooked ham is one of the most consumed meats in Brazil. It is also one of the most sensitive to spoilage by lactic acid bacteria (LAB) and contamination by Listeria monocytogenes. The objective of this study is to evaluate the antimicrobial activity of Nisin (Nisaplin®) when applied to precooked ham, in order to control the growth of L. monocytogenes and LAB. For the purposes of this study, the precooked ham prepared and sliced individually by the DuPont and Marsul company was used. For trial 1, brine containing 12.5 mg of nisin was injected per kg of ham (dosage approved in Brazil for processed cheese). The biopreservative potential of nisin was evaluated by artificially contaminating slices of control and test ham with a pool of 5 different strains of L. monocytogenes. The results of this first trial showed that treatment with this amount of nisin had no significant effect on the growth of the L. monocytogenes population. However, the LAB population was indeed inhibited by 2 days. In trial number 2, the addition of nisin to the same amount of precooked ham by tumbling inhibited the growth of the L. monocytogenes population by 6 days and of the LAB population by 10 days. In light of the results obtained in these first 2 trials, the minimum bactericidal concentration (MBC) pool and L. monocytogenes isolates were determined in order to verify the sensitivity of the strains individually and together as well as the effects of nisin without the meat matrix Additionally, the synergistic or antagonistic effects of brine on the antimicrobial properties of nisin were also evaluated. Results suggest that different strains of L. monocytogenes have different sensitivity profiles and that the pool of strains was less sensitive to the effects of the nisin. These results prompted an increase in the dosage of nisin added to the precooked ham in trial number 3. In this trial, 32mg/kg of nisin was added to the brine of the precooked ham and tested against the L. monocytogenes pool and ATCC 7644 strain, separately. Results demonstrated that this increase in amount of nisin significantly reduced the growth of the L. monocytogenes pool and of the ATCC strain for 10 days. This suggests that nisin can be an effective barrier against the growth of L. monocytogenes in precooked ham.

Além das características tecnológicas das bactérias lácticas para o processamento de alimentos fermentados, novas propriedades são requeridas, como a produção de bacteriocinas. Vários desses compostos protéicos possuem atividade antimicrobiana direcionada à patógenos e apresentam potencial de uso como bioconservadores naturais de alimentos. O objetivo desse trabalho foi avaliar a viabilidade de aplicação de cinco culturas lácticas produtoras de bacteriocinas como bioconservantes em alimentos. Avaliaram-se as propriedades de segurança e probióticas dessas culturas e determinaram-se os parâmetros de produção e purificação parcial das bacteriocinas, bem como os efeitos de fatores limitantes de crescimento (cloreto de sódio e nitrito). Os resultados demonstraram que essas linhagens não possuem atividade de enzimas indicadoras de patogenicidade (termonuclease, -hemolisinas e gelatinases). A tolerância às condições ácidas variou dependendo da linhagem. Lactobacillus plantarum CTC 368 e Enterococcus avium CTC 469 apresentaram maior tolerância a valores de pH 2,0 e 3,0. Lactococcus lactis subsp. cremoris CTC 204 e Enterococcus avium CTC 483 também apresentaram 100% de sobrevivência a pH 3,0 e, mesmo com uma diminuição da tolerância a pH 2,0, a sobrevivência foi cerca de 80%. Com relação à susceptibilidade aos sais de bile, observou-se que a viabilidade variou entre as linhagens em função da concentração e tempo de incubação. Enterococcus avium CTC 469 e Lactococcus lactis subsp. hordinae CTC 484 foram as mais tolerantes e apresentaram sobrevivência de 57% e 58%, respectivamente. As linhagens mostraram excelente sobrevivência tanto a baixos valores de pH, quanto às concentrações de sais biliares indicando potencial probiótico. As características de crescimento e de produção de bacteriocinas foram semelhantes para todas as linhagens e meios avaliados. A viabilidade aumentou durante o período de incubação e a produção de bacteriocinas mostrou uma cinética de metabólito primário. A suplementação do meio MRS com 1,0% de NaCl e 0,1% de NaNO2, não afetou o crescimento de Lc. lactis subsp. cremoris CTC 204, mas promoveu a redução da atividade da bacteriocina de 42,5% e 17,5%, respectivamente. O crescimento de Lactococcus lactis subsp. hordinae CTC 484 foi afetado com a adição de NaCl e NaNO2 ao meio APT, mas ainda reteve 50% da atividade bacteriocigênica. O espectro de atividade das bacteriocinas variou de acordo com a susceptibilidade da linhagem indicadora, a concentração ou atividade da bacteriocina, a viabilidade e/ou presença das células produtoras e os procedimentos de extração das bacteriocinas. Os resultados revelaram que as bacteriocinas de Lactococcus lactis subsp. cremoris CTC 204 e Lactococcus. lactis subsp. hordinae CTC 484 promoveram um efeito bactericida contra Staphylococcus aureus. Concluiu-se que essas duas culturas produtoras de bacteriocinas apresentam propriedades para utilização como bioconservantes em alimentos e que estudos mais aprofundados, relacionados com a purificação da bacteriocina e avaliação de seu uso em alimentos, devem ser realizados. / In addition to the technological characteristics of lactic bacteria for the processing of fermented foods, other properties need to be developed and explored, such as bacteriocin production. Several of these protein-based compounds have antimicrobial activities targeted towards pathogens and have a significant potential for use as natural biopreservatives in processed foods. The objective of this study was to evaluate the viability of using five bacteriocin-producing lactic cultures as biopreservatives in foods. The safety and probiotic properties of these cultures were evaluated, followed by the determination of bacteriocin production and purification parameters and the effect of growth-limiting factors (sodium chloride and nitrite). The results demonstrated that these strains do not show activity of marker enzymes of pathogenicity (thermonuclease, - hemolysins and gelatinases). Tolerance to acidic conditions varied depending on the specific strain. Lactobacillus plantarum CTC 368 and Enterococcus avium CTC 469 exhibited greater tolerance to pH values 2,0 and 3,0. Lactococcus lactis subsp. cremoris CTC 204 and En. avium CTC 483 also presented 100% survival at pH 3,0, and even with reduced tolerance at pH 2,0, the survival rate was 80%. Variation in susceptibility to bile salts was observed between the strains as a function of concentration and incubation time. En. avium CTC 469 and Lactococcus lactis subsp. hordinae CTC 484 were found to be the most tolerant, exhibiting survival rates of 57% and 58%, respectively. The strains demonstrated excellent survival not only at low pH values, but also at high bile salt concentrations, thereby indicating probiotic potential. The growth and bacteriocin-producing characteristics were similar for all the strains and culture media evaluated. Bacterial multiplication increased during the incubation period, while bacteriocin production displayed primary metabolite kinetics. The activity spectrum of the bacteriocins varied with the susceptibility of the indicator strain, the concentration or activity of the bacteriocin, the viability and/or presence of bacteriocinproducing cells and the bacteriocin extraction procedures. The results reveal that the bacteriocins produced by Lc. lactis subsp. cremoris CTC 204 and Lc. lactis subsp. hordinae CTC 484 exerted a bactericidal effect against Staphylococcus aureus. Supplementation of the MRS medium with 1,0% NaCl and 0,1% NaNO2, did not affect the growth of Lc. lactis subsp. cremoris CTC 204, but did reduce by 42,5% and 17,5% the activity of the bacteriocin, respectively. Growth of Lc. lactis subsp. hordinae CTC 484 was affected by the addition of NaCl and NaNO2 to the APT medium, but even so still exerted 50% of its bacteriocinogenic activity. It was concluded that Lc. lactis subsp. cremoris CTC 204 and Lc. lactis subsp. hordinae CTC 484 exhibited adequate properties for use as biopreservatives in foods and that more extensive studies related to the purification of bacteriocins and assessment of their use in foods should be conducted.

O presunto cozido é um dos embutidos cárneos mais consumidos no Brasil, sendo também um dos mais sensíveis à deterioração por bactérias ácido láticas (BAL) e a contaminação por Listeria monocytogenes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana da nisina (Nisaplin®) aplicada em presunto cozido, a fim de controlar L. monocytogenes e BAL. Para tanto, presuntos cozidos foram preparados e fatiados individualmente pelas empresas DuPont e Marsul. No ensaio 1, o presunto foi injetado com salmoura contendo 12,5 mg de nisina por kg (dosagem aprovada no Brasil para queijos fundidos). O potencial bioconservante da nisina foi avaliado contaminando artificialmente as fatias do presunto com um pool composto por 5 cepas de L. monocytogenes. Os resultados do ensaio 1 demonstraram que o tratamento com nisina não teve efeito significativo sobre a população de L. monocytogenes. Já as BAL foram inibidas por 2 dias. No ensaio 2, a adição da nisina na mesma dosagem foi feita no tambleamento, inibindo a população de L. monocytogenes por 6 dias e BAL por 10 dias Em vista dos resultados obtidos nos 2 primeiros ensaios foi determinada a concentração mínima bactericida (CMB) do pool e dos isolados de L. monocytogenes, a fim de verificar a sensibilidade das cepas individualmente e em conjunto e o efeito da nisina sem a matriz cárnea. Além disso, também foi avaliado o efeito sinérgico ou antagônico da salmoura sobre a ação bactericida da nisina. Pôde-se constatar que as diferentes cepas de L. monocytogenes demonstraram perfis de sensibilidade diferentes e que o pool de cepas foi menos sensível ao efeito da nisina. Os resultados obtidos conduziram a avaliação de dosagem maior de nisina no presunto cozido. No ensaio 3, 32 mg/kg de nisina foram adicionadas a salmoura do presunto cozido e testados contra o pool de L. monocytogenes e a cepa ATCC 7644, separadamente. Os resultados demonstraram que a nova dosagem de nisina inibiu significativamente a multiplicação do pool de L. monocytogenes e da cepa ATCC 7644, durante 10 dias, sugerindo ser uma barreira efetiva no controle de L. monocytogenes em presunto cozido. / Precooked ham is one of the most consumed meats in Brazil. It is also one of the most sensitive to spoilage by lactic acid bacteria (LAB) and contamination by Listeria monocytogenes. The objective of this study is to evaluate the antimicrobial activity of Nisin (Nisaplin®) when applied to precooked ham, in order to control the growth of L. monocytogenes and LAB. For the purposes of this study, the precooked ham prepared and sliced individually by the DuPont and Marsul company was used. For trial 1, brine containing 12.5 mg of nisin was injected per kg of ham (dosage approved in Brazil for processed cheese). The biopreservative potential of nisin was evaluated by artificially contaminating slices of control and test ham with a pool of 5 different strains of L. monocytogenes. The results of this first trial showed that treatment with this amount of nisin had no significant effect on the growth of the L. monocytogenes population. However, the LAB population was indeed inhibited by 2 days. In trial number 2, the addition of nisin to the same amount of precooked ham by tumbling inhibited the growth of the L. monocytogenes population by 6 days and of the LAB population by 10 days. In light of the results obtained in these first 2 trials, the minimum bactericidal concentration (MBC) pool and L. monocytogenes isolates were determined in order to verify the sensitivity of the strains individually and together as well as the effects of nisin without the meat matrix Additionally, the synergistic or antagonistic effects of brine on the antimicrobial properties of nisin were also evaluated. Results suggest that different strains of L. monocytogenes have different sensitivity profiles and that the pool of strains was less sensitive to the effects of the nisin. These results prompted an increase in the dosage of nisin added to the precooked ham in trial number 3. In this trial, 32mg/kg of nisin was added to the brine of the precooked ham and tested against the L. monocytogenes pool and ATCC 7644 strain, separately. Results demonstrated that this increase in amount of nisin significantly reduced the growth of the L. monocytogenes pool and of the ATCC strain for 10 days. This suggests that nisin can be an effective barrier against the growth of L. monocytogenes in precooked ham.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 632591 bytes, checksum: 583db37e08ebd748e5a8eb2a9c7accb2 (MD5) Previous issue date: 2011-02-17 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Lactic acid bacteria (LAB) occur naturally as indigenous microbiota in raw milk, and play an important role in the microbial ecology of this product due to their antimicrobial activity against spoilage and pathogenic microorganisms, such as Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus. Several LAB species were already isolated and identified as producers of some bacteriocins. However, researches should be conducted to optimize the antimicrobial substances production to control the development of foodborne pathogens and spoilage microorganisms. Considering the bacteriocins application viability in the food industry, the aim of this work was to verify the proteinaceus nature and the culture conditions interference on production of antimicrobial substances by Lactic Acid Bacteria (LAB) cultures isolated from raw milk and cheese. The antimicrobial substance produced were characterized for sensibility of different enzymes, for antimicrobial action against Listeria spp., Staphylococcus spp. and LAB cultures, and the effect of eight variations of culture media (MRS, modified MRS - mMRS, M17, and BHI, added or not with cistein solution) and eight combinations of time and temperature of incubation (25 and 35 °C for 12, 24, 48 and 72h) were evaluated. The antimicrobial substances produced by 80 LAB cultures presented a proteinaceous nature, indicating the bacteriocin production. Lactococcus spp. was the genera with better antimicrobial activity and Listeria spp. was the most sensitive genera. The culture media MRS and mMRS and the incubation conditions of 25 °C for 24h, and to 35 °C for 12h presented better antimicrobial activity performance. Considering the obtained results, it was possible to understand some important aspects in relation to the bacteriocin production by some genera of LAB, leading further studies to their future application in dairy products. / Bactérias ácido láticas (BAL) são constituintes naturais da microbiota do leite cru, exercendo importante papel na segurança alimentar, devido ação antimicrobiana sobre microrganismos deteriorantes e patógenos, como Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus. Várias espécies de BAL já foram isoladas e identificadas como produtoras de diversas bacteriocinas. Porém, pesquisas devem ser conduzidas a fim de otimizar a utilização e a produção dessas substâncias antimicrobianas, visando o controle de patógenos e deteriorantes. Considerando a viabilidade de aplicação das bacteriocinas em indústrias de alimentos, este trabalho teve como objetivo verificar a natureza protéica e a interferência de condições de incubação na produção de substâncias antimicrobianas por isolados de Bactérias Ácido Láticas (BAL) de leite cru e queijo. As substâncias antimicrobianas produzidas foram caracterizadas quanto à sensibilidade enzimática, atividade antimicrobiana contra diferentes cepas de Listeria spp., Staphylococcus spp. e BAL, e avaliadas quanto à interferência de oito variações de meios de cultura (MRS, MRS modificado - MRSm, M17, e BHI, adicionados ou não de solução de cisteína) e oito combinações de tempo e temperatura de incubação (25 e 35 °C por 12, 24, 48 e 72h). As substâncias antimicrobianas produzidas por 80 isolados de BAL apresentaram natureza protéica, as caracterizando como bacteriocinas. Lactococcus spp. foi o gênero que apresentou melhor desempenho de atividade antimicrobiana e Listeria spp. foi o gênero mais sensível. Os meios de cultura MRS e MRSm e a combinação de 25 °C por 24h, e a 35 °C por 12h de incubação, foram as condições que apresentaram melhor performance de atividade antimicrobiana. Assim, foi possível conhecer alguns aspectos relevantes em relação à produção de bacteriocinas por alguns gêneros de BAL, direcionando estudos complementares para sua futura aplicação em produtos lácteos.