INFLUÈNCIA DE COMPONENTS DELS VINS SOBRE EL METABOLISME D'Oenococcus oeni I SOBRE LA SEVA DINÀMICA DE POBLACIONS A LA FERMENTACIÓ MALOLÀCTICALa fermentació malolàctica (FML) del vi és el resultat del metabolisme d'algunes espècies de bacteris làctics que converteix l'àcid L-(-)-màlic en L-(+)-làctic i CO2. L'espècie Oenococcus oeni és la més tolerant a les condicions poc favorables del vi (deficiències nutritives, pH baix, etanol, àcids grassos dels llevats, SO2, etc.) i la que habitualment realitza la FML. A part de la disminució d'acidesa, la FML contribueix a l'estabilització microbiològica del vi i a millorar-ne les qualitats organolèptiques. Alguns paràmetres bioquímics indicadors de l'estat metabòlic cel·lular són l'activitat ATPasa, l'expressió de proteïnes d'estrès i d'exoproteases involucrades en l'obtenció de fonts de nitrogen. D'altra banda, algunes de les condicions desfavorables per al creixement bacterià poden influir sobre la dinàmica de poblacions de bacteris làctics durant la FML, tant a nivell d'espècie com de soca. Els estudis realitzats en aquesta tesi indiquen que l'activitat ATPasa de membrana, deguda principalment a una H+-ATPasa, es veu afectada per concentracions inhibidores de la viabilitat cel·lular d'etanol, SO2, coure i àcids grassos, per la qual cosa es pot establir una relació directa entre la inhibició del creixement d'O. oeni en condicions reals de vinificació i la inhibició de l'activitat ATPasa. Al seu torn, l'etanol no produeix un perfil de proteïnes de membrana excessivament diferent respecte al control, mentre que la incubació en condicions àcides o en presència de l'àcid gras C12 inhibeix, en general, l'expressió proteica.El coure i l'acidesa afavoreixen la sobreexpressió d'una proteïna de membrana, de 40 kDa, així com el SO2, la seqüència N-terminal de la qual correspon a la família de gliceraldehid-3-fosfatdeshidrogenases (GAPDH). El SO2 també inhibeix l'activitat GAPDH citoplasmàtica, i per tant, el mecanisme glucolític d'obtenció d'energia per part d'O. oeni.Mitjançant RT-PCR, s'ha comprovat que els nivells d'expressió gènica d'hsp18 (gen d'una proteïna d'estrès descrita en O. oeni) en resposta al xoc tèrmic són fins a cinquanta vegades superiors que en les condicions controls, mentre que en presència de concentracions de C12, coure o SO2 inhibidores del creixement, únicament s'observa una certa inducció en resposta al coure i en condicions de fase exponencial de creixement. Pel que fa a l'activitat exoproteasa, aquesta no és significativa en les condicions experimentals emprades i en les soques estudiades, excepte al final de la fase exponencial de creixement i en presència de dosis elevades d'etanol (14 %). En condicions de carència nutricional nitrogenada, s'ha observat una relació directa entre la biodisponibilitat de nitrogen α-aminat i la taxa de creixement d'O. oeni.S'assajaren diferents condicions de microvinificació, amb tres soques diferents (CECT 4100, soca tipus; CR1, soca aïllada pel nostre grup de recerca, i Vitilactic, soca comercial). La soca tipus va mostrar menor capacitat d'adaptació, mentre que la soca aïllada s'implantà en la majoria de casos. Per a comprovar-ho, s'empraren tècniques de Biologia Molecular, com ara la PCR i la RAPD-PCR. En vinificacions amb concentracions moderades i elevades de SO2 i lisozim, s'observà un predomini de l'espècie O. oeni ja des de l'inici de la fermentació alcohòlica, i una evolució diferent de les poblacions en presència de lisozim. En tots els casos, una mateixa soca s'imposà durant la FML, i coincideix amb la que s'havia implantat en campanyes anteriors i aïllada pel nostre grup com a CR1. / INFLUENCE OF WINE COMPONENTS OVER THE METABOLISM OF Oenococcus oeni AND OVER THE POPULATION DYNAMICS DURING MALOLACTIC FERMENTATIONMalolactic fermentation (MLF) in wine is carried out by certain lactic bacteria which decarboxylate L-malic acid to L-lactic and CO2. Oenococcus oeni is the most tolerant species under the unfavourable wine conditions (nutrients starvation, low pH, ethanol, fatty acids from yeasts, SO2, etc.) and the main responsible of driving the MLF. As a consequence of the MLF, the wine quality improves because the acidity decreases, the organoleptic characteristics are better and the microbiological stability of wine increases. Some biochemical parameters, indicators of metabolic cellular conditions, are the ATPase activity and the expression of stress proteins and exoproteases involved in the obtention of nitrogen. On the other hand, some unfavourable conditions for bacterial growth can modify the bacterial population dynamics during MLF by effects over species and strains of the same species. The studies performed in this work show that ATPase-membrane activity principally corresponds to an H+-ATPase, which is affected by cellular viability inhibitory concentrations of ethanol, SO2, copper and fatty acids. So, a direct relationship between growth inhibition of O. oeni in real cellar conditions and ATPase activity inhibition is stablished. The stress protein profile produced by ethanol is not significantly different from the control's one, whereas the incubation in acidic conditions or in the presence of C12 fatty acid inhibits the protein expression in general. Copper and low pH induce the overexpression of a proteinic band close to 40 kDa, as SO2 does, which N-terminal sequence shows a significant identity with the family of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases (GAPDH). In his turn, SO2 inhibits the cytoplasmatic GAPDH activity also. Using RT-PCR, it has been shown that gene expression levels of hsp18 (the gene of a heat-shock protein found in O. oeni) as a response to the heat shock are near fifty-fold greater than in normal conditions. On the other hand, in contact with inhibitory concentrations of C12, copper or SO2, it only appears weak induction as a response to copper. About the exoprotease activity, this one is not significative in the strains studied, except for final exponential growth phase in the presence of high ethanol levels (14 %). Under conditions of nitrogen starvation, it's observed a direct relationship between the bioavailability of α-amino nitrogen and growth rate of O. oeni. Different microvinification conditions were assayed using three different strains (CECT 4100 as the type strain; CR1, an strain isolated by our research group, and Vitilactic, a commercial strain). The type strain showed fewer ability for adaptation, whereas the isolated strain was the responsible for performing the FML the most times. To demonstrate that, we used Molecular Biology techniques, like specific PCR and RAPD-PCR. In cellar vinifications with normal and high levels of SO2 and lysozyme, it was observed a dominance of O. oeni species from the beginning of the alcoholic fermentation, and a different evolution of the populations in the presence of lysozyme. In all the cases, it's the same strain which performs FML and it coincides with that one imposed in other campaigns and isolated by our group as CR1.

La sangre obtenida en el matadero es un producto altamente contaminado que requiere un procesamiento inmediato si se pretende utilizarla como insumo alimentario en la fabricación de productos destinados al consumo humano. Si bien es cierto que los sistemas de higienización podrían ser muy eficientes desde el punto de vista de calidad microbiológica, su instalación en la línea de sacrificio comportaría muchas dificultades desde el punto de vista técnico y en algún caso sería muy costoso. La bioconservación podría ser una alternativa para mejorar la calidad microbiológica de la sangre, alargar su vida útil y reducir las posibilidades de procesamiento inmediato. El presente estudio nos permitiría formular la posibilidad de aplicar la bioconservación en sangre de cerdo procedente de matadero industrial, utilizando bacterias ácido lácticas (BAL) como cultivo bioprotector, para lo cual se aislaron cepas de BAL autóctonas y se confeccionaron dos colecciones una de BAL mesófilas y otra de psicrótrofas.Se evaluó el potencial antagonista de la colección de BAL mesófilas y psicrótrofas a 30ºC y a 15ºC respectivamente frente a bacterias contaminantes habituales de este subproducto. Las BAL que demostraron antagonismo en placa (7,1% a 30ºC y 11% a 15ºC) fueron seleccionadas para evaluar el potencial antagonista en sangre, donde el efecto inhibitorio se vio favorecido por la adición de un 2% glucosa. S.aureus y P. fluorescens fueron los indicadores más inhibidos por las cepas mesófilas, en algunos casos con reducciones superiores a 7 unidades logarítmicas. En condiciones psicrótrofas la bacteria más sensible a la presencia de BAL fue Bacillus sp., donde 8 de las 11 BAL ensayadas permitieron reducciones superiores a 4 logs y 1cepa incluso superiores a 7 logs; se obtuvieron reducciones máximas de 3 logs de E.coli y Pseudomonas fue inhibida por todas las BAL ensayadas, en algún caso con reducciones superiores a 5 logs.Las 5 que cepas que presentaron el espectro de inhibición más amplio en condiciones mesófilas y 7 en condiciones psicrótrofas frente a los microorganismos indicadores contaminantes de sangre de matadero se identificaron mediante técnicas moleculares por comparación de la secuencias correspondientes al gen que codifica la síntesis de 16S ARNr (16S ADNr) con las secuencias publicadas en las bases de datos. De las 7 cepas antagonistas en condiciones psicrótrofas 5 se identificaron como Lactococcus garvieae y 2 como Enterococcus malodoratus/gilvius raffinosus. Todas las BAL con potencial antagonista en condiciones mesófilas pertenecían al género Lactobacillus, 3 de elllas se identificaron como Lactobacillus murinus/animalis y una se identificó como Lactobacillus reuteri. TA20 que tuvo un gran espectro de inhibición a ambas temperaturas se identificó como Lactococcus garvieae.En este estudio se evaluaron tres métodos de conservación a largo plazo de las cepas que mostraron potencial antagonista. Se comparó la liofilización, la atomización frente a la congelación a -80ºC que era método que se había utilizado hasta el momento para conservar ambas colecciones de BAL. En general, los métodos de deshidratación (atomización y liofilización) y mantenimiento en refrigeración a 5ºC de los cultivos deshidratados se han mostrado más eficaces que la congelación. / Blood from slaughtered animals is a product with a high contamination level that requires an immediately processing after collection if the object is to use it as a food ingredient destined to human consumption. Nevertheless, even if hygienic collection systems used in abattoirs were be efficient enough to control the microbiological quality, their installation in the slaughtered line would be technically complicate and in some case would be so expensive.Bioconservation is an alternative to improve microbiological quality, to extend its shelf life and reducing the possibility of immediate processing after collection.The present study would permit us to formulate the possibility to applicate bioconservation in porcine blood from industrial abattoirs, using lactic acid bacteria (LAB) strains as biopreservative cultures. So a mesophylic and a psicrotrophyc LAB strains collections were confectioned.The antagonistic capacity toward usual contaminant bacteria in blood of the mesophylic and psicrotrophyc collections at 30ºC and 15ºC respectively were investigated. The LAB that demonstrated the widest inhibitory spectrum in agar plate evaluation (7,1% at 30ºC and 11% at 15ºC) were screened in order to evaluate their inhibitory activity in blood, where was observed that the addition of glucose at 2% had a positive effect in the inhibitory levels. The most sensible indicators to the mesophylic LAB were S. aureus and P. fluorescens. In some cases it was obtained reductions of 7 logarithmic units. In psicotrophic conditions the most sensible bacteria to LAB presence was Bacillus spp. where 8 of the 11 strains assayed inhibited in more than 4 logarithmic units and 1 of them inhibited this indicator in 7 logarithmic units..It was obtained maxim reductions of 3 logs versus E. coli. P. fluorescens was inhibited by all the assayed strains and in some case it was obtained reductions superior to 5 logs.The 5 mesophylic and 7 psictrophyc strains that demonstrated the widest inhibitory spectrum toward the indicators microorganisms from abattoir blood were identified using molecular techniques though comparison of the gene sequences that codify the synthesis of 16S RNAr (16S DNAr) with the sequences in the data base.5 from the 7 strains with antagonistic capacity in psicotrophyc conditions were identified like Lactococcus garvieae and the other two strains were identified like Enterococcus malodoratus/gilvius/raffinosus. All the antagonistic LAB in mesophylic conditions belonged to genus Lactobacillus, 3 of them were identified like Lactobacillus murinus/animalis and one of them as Lactobacillus reuteri. TA20 that had a widest spectrum at both assay temperatures was identified as Lactococcus garvieae.In this study there were evaluated three methods of conservation of cultures belonged to those LAB that demonstrated antagonistic capacity. It was compared freeze-drying, spray drying against freezing at -80ºC, that is the method used to conserve both LAB collections. Generally, the dehydration methods (freeze-drying and spray drying) and maintaining in refrigeration at 5ºC of dehydrated cultures showed to be better than freezing at -80ºC.