Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015. / A bananeira (Musa spp.) é cultivada em mais de 100 países, assumindo importante papel social e econômico, visto que é o fruto mais consumido no mundo. A quinta posição no ranking de produção é ocupada pelo Brasil, onde a Sigatoka-amarela é uma doença comum nos cultivos de bananeiras. Mycosphaerellamusicola(R. Leach ex. J. L. Mulder 1979)(Anamorfo: PseudocercosporamusaeZimm. Deighton), agente causal da doença, é a espécie de Mycosphaerellade maior ocorrência no país em relação às demais espécies. Pouco se sabe sobre a diversidade genética desse patógeno. Similarmente, pouco se sabe sobre a sensibilidade de M. musicolaa fungicidas DMI (inibidores da demetilação). Análises da influência de genes efetores LysM na patogênese de membros do gêneroMycosphaerellatambém são reduzidas. Nesse contexto, os objetivos datese foram verificar a ocorrência de recombinação sexual em populações de M. musicola de 13 diferentes zonas produtoras de banana no Brasil, por meio de análises dos genes matingtypes; caracterizar a diversidade genética das populações com base em 19 locos microssatélites; analisar a sensibilidade dos isoladosa fungicidas DMI e correlacionar o resultado com a ocorrência de mutações no gene CYP51 e, como componente adicional do trabalho, caracterizar o efetor de virulência - LysM em Mycosphaerellagraminicola. Com exceção de isolados coletados em uma das áreas do Distrito Federal e no Rio Grande do Norte, as populações mostraram proporção de 1:1 de genes MAT1-1-1 e MAT1-2-1, indicando a ocorrência de recombinação sexual nessas populações. Alto nível de diversidade genética foi observado entre indivíduos dentro das populações, fato que pode ser resultante da recombinação sexual. Um considerável número de migrantes entre populações de diferentes estados foram observados. Isso indica que ações antrópicas, como o transporte de folhas contaminadas, devem ter contribuído para o fluxo gênico e a homogeneização das populações, considerando que a dispersão por ascósporos é incomum a longas distâncias. A alta fração clonal nas populações sugere que a recombinação assexual emprega um importante papel na estrutura genética e apoia as evidências de dispersão conidial dentro das áreas produtoras de banana. Cinco isolados de M. musicolado Distrito Federal exibiram tolerância aos fungicidas tebuconazole, triadimenol e cyproconazole e um ponto de mutação no aminoácido do códon 461 foi observado nos mesmos isolados. Para a caracterização do efetor LysM, a patogenicidade da linhagem B3 de M. graminicolaexpressando GFP (proteína verde fluorescente) foi avaliada em 18 genótipos de trigo o que permitiu predizer que GFP não influencia na colonização do patógeno. A colonização de B3-GFP em folhas de trigo foi acompanhada via microscopiaconfocal de varredura a laser (CLSM) confirmando que GFP é expressa durante todo o ciclo de infecção do patógeno em folhas de trigo suscetíveis. Uma transformação via Agrobacteriumtumefaciensfoi realizada para a obtenção de uma linhagem B3-GFP mutante não funcional para o gene 3LysM. Entretanto, o DNA homólogo de 3LysM não foi integrado ao sítio alvo no genoma, sendo necessários novos experimentos para a obtenção da linhagem esperada. Os resultados obtidos contribuem para otimizar a compreensão sobre a epidemiologia do patógeno e aprimorar as medidas de controle da doença. / Commercial banana varieties (Musa spp.) are cultivated in over 100 countries, assuming important social and economic roles, given that this fruit is the most widely consumed globally. Brazil is the world's fifth largest producer, where yellow Sigatoka is the most common banana disease in production areas. Mycosphaerella musicola (R. Leach ex. J. L. Mulder 1979)(Anamorfo: PseudocercosporamusaeZimm. Deighton), causal organism of the disease, is the most commonly occuring Mycosphaerella species in the country. Limited analysis of genetic diversity of this pathogen has been conducted to date.Similary, little is known regarding fungicide sensitivity of M. musicola to DMI(demethylation inhibitor) fungicides. Analysis of pathogen effector LysM genes and their influence on the pathogenesis of Mycosphaerella members is also limited. In this context, the goals of this study were to verify the occurrence of sexual recombination in M. musicolapopulations from 13 different agroecological zones across Brazil, based on analysis of mating type idiomorphs; characterize population genetic diversity by comparison of 19 microsatellite loci; analyse isolate sensitivity to DMI fungicide and correlate the results with the occurrence of mutations in the CYP51 gene and, as a additional component of the work, characterize the virulence effector – LysM in Mycosphaerellagraminicola. With the exception of isolates collected in one area of the Distrito Federal and Rio Grande do Norte, populations displayed 1:1 proportions of mating type gene idiomorphs MAT1-1 and MAT1-2, indicating the occurrence of sexual reproduction as an evident process in M. musicolapopulations. Greatest genetic diversity occurred among individuals within populations, which may be the result of sexual recombination. A considerable number of migrants between populations from different states were observed. These results indicate that anthropic action such as transport of contaminated germplasm may be contributing to gene flow and the genetic homogenization of populations, when considering that ascospore dispersal is uncommon over large distances. The high clonal fraction in populations suggests that asexual reproduction plays an important role in the genetic structure, supporting documented evidence of conidial dispersal within banana blocks. Five M. musicolaisolates from Distrito Federal exhibited low sensibility to tebuconazole, triadimenol and cyproconazole fungicides, with one point mutation in an amino acid at codon 461 observed across all these isolates. For LysM effector characterization, the pathogenicity of M. graminicolastrainB3 expressing GFP (green fluorescent protein) was evaluated on 18 wheat genotypes, shown that GFP had no influence on pathogen colonization. Colonization of the B3-GFP in wheat leaves was followed via confocal laser scanning microscopy (CLSM). The results confirmed that GFP is expressed during the whole infection cycle of the pathogen on susceptible wheat leaves. Agrobacterium tumefacienswas used to mediate transformation to generate knockout constructs for 3LysM in B3-GFP. The 3LysM homologous DNA was not integrated in the target genomic site, such that continued experiments are required to develop the desired strain for further analysis of the influence of LysM on M. graminicolapathogenesis. The results contribute to our understanding of pathogen epidemiology and contribute to development of enhanced disease control measures.

The banana is one of the most consumed fruits in the world and is widely consumed in Brazil, but diseases such as yellow and black Sigatoka have been reducing its production, most of ali because of lack of proper production technology. The tissue culture, specifically the micropropagation, is an alternative for the production of seedlings of banana with phitosanitarium and vegetative quality, but presents factors that difficult its application. Among which stands out contamination by fungi and bactéria, associated with oxidation of the explants by the exudation of phenolic compounds that cause rapid browning and death of apical shoots, resulting in great loss in the initial phase of the explants establishment. The objective of this work was to adapt and/or optimize the behavior of different banana cultivates, resistant to diseases, via micropropagation, adjusting the in vitro culture establishment phases, through the control of oxidation and contamination, proliferation / multiplication of shoots and rooting, for the rapid multiplication of plants with superior quality, as much in the phitosanitarium aspect as in the vegetative. The cultivates Bucaneiro (AAAA), Caipira (AAA), Fhia 18 (AAAB), BRS Garantida (AAAB), Japira (AAAB), Pacovan Ken (AAAB), PA 4244 (AAAB), Preciosa (AAAB), PV 03-76 (AAAB), Thap Maeo (AAB) and Tropical (AAAB) proceeding from the city of Baião in the state of Pará and Caipira (AAA), BRS Caprichosa (AAAB), Pacovan Ken (AAAB), Preciosa (AAAB), PV 03- 76 (AAAB), Thap Maeo (AAB) proceeding from the city of Belém in the state of Pará, were subjected to different micropropagation stages. In the study was used the streptomycin sulfate antibiotic and fungicide to reduce contamination in vitro caused by bactéria and fungi, besides the anti-oxidant PVP (polivinilpirrolidona) to control the oxidation. There was contamination reduction with the use of streptomycin sulfate in the concentration of 100 mg.L1 and of oxidation with PVP at 4 gL1. At the stage of proliferation / multiplication of shoots, the different cultivates showed means ranging from 1,67 to 7,0 shoots / explant, with greater proliferation in the initial culture (2,0 to 7,0 shoots / explant).The cultivate Caipira (AAA) stood out from the others with the highest rate of shoot multiplication after three subcultivations, 65 shoots per initial rhizome average, mostly from the rhizomes proceeding from Baião. The culture médium with half concentration of MS salts was effective in shoots rooting as much for PV 03-76 cultivate as for Pacovan to Ken cultivate. / A bananeira é uma das frutas mais consumidas no mundo, sendo amplamente consumida no Brasil, porém doenças como as Sigatokas negra e amarela vem reduzindo a sua produção, principalmente por falta de uma adequada tecnologia de produção. A cultura de tecidos, especificamente a micropropagação, é uma alternativa para a produção de mudas de bananeira com qualidade fitossanitária e vegetativa, mas apresenta fatores que dificultam sua aplicação. Dentre os quais, destaca-se a contaminação, por fungos e bactérias, associada à oxidação dos explantes pela exsudação de compostos fenólicos que provocam o rápido escurecimento e morte de ápices caulinares, resultando em grande perda na fase inicial de estabelecimento dos explantes. O objetivo desse trabalho foi adaptar e/ou otimizar o comportamento de diferentes cultivares de bananeira, resistentes a doenças, via micropropagação, ajustando as fases de estabelecimento da cultura in vitro, por meio do controle de oxidação e contaminação, proliferação/multiplicação de brotos e enraizamento, para a multiplicação rápida de plantas com qualidade superior, tanto no aspecto fitossanitário quanto vegetativo. As cultivares Bucaneiro (AAAA), Caipira (AAA), Fhia 18 (AAAB), BRS Garantida (AAAB), Japira (AAAB), Pacovan Ken (AAAB), PA 4244 (AAAB), Preciosa (AAAB), PV 03-76 (AAAB), Thap Maeo (AAB) e Tropical (AAAB) provenientes do município de Baião do estado do Pará e Caipira (AAA), BRS Caprichosa (AAAB), Pacovan Ken (AAAB), Preciosa (AAAB), PV 03-76 (AAAB), Thap Maeo (AAB), provenientes do município de Belém do Estado do Pará foram submetidas às diferentes fases do processo de micropropagação. No estudo foram utilizados o antibiótico sulfato de estreptomicina e um fungicida visando reduzir a contaminação in vitro provocada por bactérias e fungos, além do anti-oxidante PVP (polivinilpirrolidona) para controlar a oxidação. Houve redução da contaminação com uso do sulfato de estreptomicina à concentração de 100 mg.L'1 e da oxidação com PVP a 4 g.L'1. Na fase de proliferação/multiplicação de brotos, as diferentes cultivares apresentaram médias que variaram de 1,67 a 7,0 brotos/explante, com maior proliferação no cultivo inicial (2,0 a 7,0 brotos/explante). A cultivar caipira (AAA) destacou-se das demais com a maior taxa de multiplicação de brotos após os três subcultivos, média de 65 brotos por rizoma inicial, principalmente a partir dos rizomas provenientes de Baião. O meio de cultura com metade da concentração dos sais de MS foi eficiente no enraizamento de brotos tanto para a cultivar PV 03-76 quanto para a cultivar Pacovan Ken.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-01-14T16:24:56Z No. of bitstreams: 1 2015_ NancyEuniceNiñoCastañeda.pdf: 7740594 bytes, checksum: 31b928be0bd73c18fdd2d5a4ceb2eac9 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-01-21T20:53:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ NancyEuniceNiñoCastañeda.pdf: 7740594 bytes, checksum: 31b928be0bd73c18fdd2d5a4ceb2eac9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-21T20:53:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ NancyEuniceNiñoCastañeda.pdf: 7740594 bytes, checksum: 31b928be0bd73c18fdd2d5a4ceb2eac9 (MD5) / Na cultura da bananeira (Musa spp.) o nematoide das galhas Meloidogyne incognita é uma das espécies predominantes principalmente no subgrupo Cavendish, causando perdas consideráveis em algumas regiões do Brasil. Meloidogyne ncognita é também considerado um dos fitoparasitas de ampla importância na agricultura mundial por sua adaptabilidade ao ambiente e ampla gama de hospedeiras. Com as limitações do melhoramento convencional no desenvolvimento de variedades resistentes de bananeiras a nematoides, o uso da genômica é uma alternativa importante para entender os mecanismos moleculares envolvidos na resposta de defesa da planta ao parasitismo. O genótipo de Musa acuminata 4279-06 foi classificado em estudos anteriores como resistente ao nematoide das galhas, e foi selecionado para este estudo com o genótipo Cavendish Grande Naine (GN), utilizado como padrão de suscetibilidade. Assim o objetivo deste trabalho foi estudar a interação M. acuminata - M. incognita a fim de identificar genes associadas ao parasitismo do nematoide e genes de defesa da planta. Inicialmente verificou-se que o ciclo de vida de M. incognita em banana GN, desde a inoculação dos J2 até a formação de fêmeas com ovos, foi de 24 dias a 25º C. Na análise histológica dos genótipos GN e 4279-06, entre 2-7 dias após de inoculação (DAI) observaram se os J2 de M. incognita penetrando pelo ápice das raízes e migrando pelo córtex até o cilindro central e aos 9 DAI já haviam estabelecido sítios de alimentação. Utilizando microscopia de fluorescência não foi observada resposta hipersensível (RH) no genótipo 4279-06, sendo que o nematoide concluiu o ciclo de vida entre 27- 30 dias, com 3-6 dias de atraso em comparação ao genótipo GN (24 dias). Foi realizada análise de transcritoma aos 3, 7 e 10 DAI nos dois genótipos, com base nos dados histológicos, utilizando a tecnologia de sequenciamento massal de RNA por Illumina e análise de bioinformática para identificar genes diferencialmente expressos relacionados ao parasitismo do nematoide e a resposta de defesa. O sequenciamento gerou um total de 510.937.976 sequências paired-end. Na análise de gene ontology (GO), um total de 320.113 termos de GO foram encontrados e relacionados às 27.604 sequências anotadas distribuídos em três categorias principais: processos biológicos (27.551 sequências), função molecular (25.362 sequências) e componente celular (25.487 sequências). Na análise de expressão diferencial, 680 genes apresentaram expressão diferencial significante. Dentre estes, 474 genes foram modulados no genótipo 4279-06 e 235 genes no genótipo GN, evidenciando uma maior regulação da expressão gênica na interação em 4279-06. Os genótipos apresentaram 29 genes comumente regulados, 445 genes exclusivamente modulados em 4279-06 e 206 em GN. Na resposta de Musa acuminata à infecção por M. incognita, foi evidente o grande envolvimento de genes ligados a fatores de transcrição das famílias MYB e WRKY, e de hormônios. Pouca resposta de defesa relacionadas ao Ácido Salicílico (de resposta a parasitas biotróficos) foi encontrada, mas sim uma ampla resposta pela via do etileno. Também foram encontrados genes que aumentam os níveis de auxinas e citocininas e que estão associados à formação de células gigantes, assim como expansinas e proteínas de domínio NAC. Proteínas da família bHLH, calose e endotransglucosilase xiloglucano foram expressas exclusivamente no genótipo 4279-06. Os resultados deste trabalho contribuem para uma maior compreensão dessa complexa interação molecular. / In banana crop (Musa spp.), the root-knot nematode Meloidogyne incognita is one of the predominant species, mainly in Cavendish (GN), causing considerable losses in some regions of Brazil. Meloidogyne incognita, also considered one of the plant parasites of wide importance in world agriculture for their adaptability to the environment and wide host range. With the difficulties of the traditional breeding programs in search for resistant varieties of bananas to nematodes, the use of genomics is an important alternative to understand the molecular mechanisms involved in plant defense response to parasitism. The banana genotype 4279-06 was classified in previous studies as resistant to the root-knot nematode, and was selected for this study, with the Cavendish Grande Naine genotype (GN) used as susceptibility standard. So the aim of this work was to study the interaction Musa acuminata - Meloidogyne incognita in order to identify genes associated with parasitism of nematode and plant defense genes. Initially, the life cycle of M. incognita in banana (NG), from the inoculation of J2 to the formation of females with eggs was 24 days at 25oC. On histological analysis of both genotypes GN and 4279-06, between 2-7 days after inoculation (DAI) it was observed that J2 of M. incognita penetrated at the roots tips and moved through the cortex to the central cylinder, and that at 9 DAI had already feeding sites established. Using fluorescence microscopy, no hypersensitive response (HR) was observed in 4279-06 genotype, and its life cycle has completed between 27- 30 days after inoculation, with 3-6 days delay in comparison with the GN genotype (24 days). Transcriptome analysis was performed at 3, 7 and 10 DAI, based on histological data, using RNA mass sequencing technology by Ilumina and bioinformatics analysis to identify differentially expressed genes related to the banana defense response in nematode interaction with the two genotypes. Sequencing generated a total of 510,937,976 sequences paired-end. In ontology gene analysis (GO), a total of 320,113 terms of GO were found and related to 27,604 annotated sequences divided into three main categories: biological processes (27,551 sequences), molecular function (25,362 sequences) and cellular component (25,487 sequences). In the analysis of differential expression, 680 genes showed significant differential expression. Of these, 474 genes were modulated in genotype 4279-06 and 235 genes in GN genotype, showing greater regulation of gene expression in the interaction with 4279-06. The genotypes showed 29 commonly regulated genes, 445 genes uniquely modulated in 4279-06 and 206 in GN. In Musa acuminata response to infection with M. incognita, was evident the great involvement of genes linked to the MYB transcription factors and WRKY families, and hormones. Little defense response related to salicylic acid (response to biotróficos parasites) was observed, but a broad response for the ethylene pathway. They have also found genes that increase the levels of cytokinins and auxins and that are associated with the formation of giant cells, like expansins and NAC domain proteins. Proteins bHLH family, callose and xyloglucan endotransglucosilase were exclusively expressed in the genotype 4279-06. These results contribute to a better understanding of this complex molecular interaction.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-22T14:08:21Z No. of bitstreams: 1 2014_FlaviaLeonelEmediato.pdf: 10358008 bytes, checksum: e76a51d9ed66c88a8b913916507e4c5d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-17T12:48:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_FlaviaLeonelEmediato.pdf: 10358008 bytes, checksum: e76a51d9ed66c88a8b913916507e4c5d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-17T12:48:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_FlaviaLeonelEmediato.pdf: 10358008 bytes, checksum: e76a51d9ed66c88a8b913916507e4c5d (MD5) / Cultivares comerciais de bananeira (Musa spp) são cultivados em muitos países de ambientes tropicais e subtropicais. A reprodução assexuada da espécie resultou em uma base genética restrita, sem resistência a pragas e doenças, tornando as estratégias de melhoramento convencional muito limitadas devido a esterilidade de muitos cultivares comerciais. As estratégias de melhoramento não-convencionais, como a transformação e seleção assistida por marcadores, oferecem uma abordagem alternativa para a introgressão de genes de resistência em cultivares comerciais. Genes de resistência (R) em plantas codificam receptores de proteínas que reconhecem assinaturas moleculares de efetores de patógenos de plantas, desencadeando mecanismos de defesa como a imunidade disparada por efetores (ETI). Essa resistência pode ser perdida durante a co-evolução do hospedeiro e patógeno, favorecendo a evolução das novas raças patogênicas. Neste contexto, o desenvolvimento contínuo de cultivares de plantas resistentes é necessária, a fim de acompanhar a evolução de patógenos. O objetivo geral deste estudo foi identificar genes potencialmente envolvidos em respostas a estresses bióticos, que servirão como fonte de recursos para análises de expressão diferencial durante a interação de Musa acuminata com o patógeno Mycosphaerella musicola e o desenvolvimento de marcadores SSR para busca de polimorfismos em genótipos de M. acuminata. Dessa forma, foram identificados 14 unigenes expressando proteínas NBS-LRR em tecidos foliares de Calcutta 4 e 25 em Cavendish Grande Naine, ambos infectados e nãoinfectados. O mapeamento desses unigenes com modelos que contêm o domínio NB-ARC no genoma de referência de M. acuminata ssp. malaccensis var. Pahang (DH Pahang) identificou 38 contigs unigenes mapeando a 40 modelos de genes completos em Calcutta 4 e 43 contigs unigenes mapeando em 40 modelos de genes em Cavendish Grande Naine. Foram desenvolvidos 156 marcadores icrossatélites para os genes alvo derivados de diferentes fontes: sequências de transcritoma de folhas da interação M. acuminata e M. musicola, mapeadas em sequências de clones de BAC de M . acuminata Calcutta 4 contendo análogos a genes de resistência NB-ARC (RGAs); Sequências do genoma completo de M. acuminata DH Pahang contendo domínios conservados NB-ARC e outros genes R; e transcritos da interação entre M. acuminata e M. musicola minerados para genes de defesa. Destes locos SSR identificados, 21 (13,46%) foram polimórficos, com alelos por loco variando de 2 a 4, e o conteúdo de informação de polimorfismo variando de 0,31 a 0,67. As análises de expressão de 51 genes alvo demonstraram que 19 obtiveram especificidade na reação de PCR em tempo real e que a maioria dos genes envolvidos em processos de defesa não foram modulados, com exceção do gene da corismato sintase e NAC. O gene NPR1 foi expresso apenas no cultivar suscetível e os RGAs 37, 43, M09A31, M09A21, B03A51 e B03A11 tiveram um aumento de expressão quando inoculados com o patógeno. Os RGAs 43 e RGA 37 mostraram indução significativa em M. acuminata Calcutta 4 quando inoculada com o patógeno e os RGAs 9330, 7100, 6160, M09A31 e M09A21 apresentaram regulação negativa em Calcutta 4. Esta análise foi consistente com a tendência aparente de caracterizações anteriores de genes R individuais já que alguns genes R são induzidos por uma variedade de estímulos, alguns exibem respostas muito específicas e outros parecem não ser responsivos ao patógeno. A caracterização contínua de genes envolvidos em respostas ao estresse biótico em M. acuminata durante a interação com M. musicola, bem como o desenvolvimento de marcadores moleculares, irá contribuir para o desenvolvimento de uma gestão eficaz da doença Sigatoka com base no melhoramento genético através da transformação de plantas ou seleção assistida por marcadores. ________________________________________________________________________ ABSTRACT / Commercial banana cultivars (Musa spp.) are grown across numerous countries in different tropical and subtropical environments. Conventional breeding strategies are limited due to sterility in many commercial cultivars. Asexually-driven evolution has resulted in a restricted genetic base, lacking resistance to pests and disease. Non-conventional breeding strategies, such as transformation and marker-assisted selection, offer an alternative approach for introgression of resistance genes in commercial cultivars. Resistance (R) genes in plants encode protein receptors that recognize molecular signatures of effectors of plant pathogens, triggering defense mechanisms of effector-triggered immunity (ETI). Such resistance can be lost during host and pathogen co-evolution, favouring the more rapid evolution of new pathogenic races. In this context, the continuous development of resistant plant cultivars is required in order to accompany pathogen evolution. The objective of this work was to identify genes potentially involved in responses to biotic stresses, which will serve as a resource for the design of specific primers for differential expression analysis during the interaction of M. acuminata with the pathogen Mycosphaerella musicola and development of SSR markers to search for polymorphisms in M. acuminata genotypes. From this, 14 expressed NBS-LRR R genes from Calcutta 4 and 25 in Cavendish Grande Naine. A total of 156 microsatellite markers were developed for genes potentially involved in resistance and defense responses, derived from different sources: 454-pyrosequencing derived leaf transcriptome sequences derived from the M. acuminata x M. musicola interaction, which mapped to BAC clone sequences from M. acuminata Calcutta 4 containing NB-ARC resistance gene analogs (RGAs); M. acuminata DH Pahang whole genome sequence regions containing conserved domains belonging to NB-ARC and other R genes; and 454-pyrosequencing transcripts from the M. acuminata x M. musicola interaction, enriched for defense genes. Among SSR loci evaluated, 21 (13.46%) were polymorphic, with alleles per locus ranging from 2 to 4, and polymorphism information content ranging from 0,31 to 0,67. The expression analysis of 51 target genes showed that 19 had specificity in real time PCR reaction and that most of the genes involved in defense processes were not modulated, with the exception of NAC and chorismate synthase gene. The NPR1 gene was expressed only in the susceptible cultivar and RGA 37, 43, M09A31, M09A21, B03A51 and B03A11 had increased expression when inoculated with the pathogen. The RGAs 43 and 37 showed significant induction in M. acuminata Calcutta 4 when inoculated with the pathogen and the RGAs 9330, 7100, 6160, M09A31 and M09A21 showed downregulation in Calcutta 4. This analysis was consistent with the apparent trend of previous individual genes R characterizations since some genes are induced by a variety of stimuli, exhibit some very specific responses and others seem to be responsive to the pathogen. The continued characterization of genes involved in response to biotic stress in M. acuminata during interaction with M. musicola, as well as the development of molecular markers, will contribute to the development of effective management of Sigatoka disease based on genetic improvement through plant transformation or marker assisted selection.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-06-20T13:25:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 845125 bytes, checksum: 4c94c1bbafe8070618ea88db66608e84 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-20T13:25:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 845125 bytes, checksum: 4c94c1bbafe8070618ea88db66608e84 (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A banana (Musa spp.) é uma das frutas mais consumidas no mundo. O Brasil ocupa a 5a colocação na produção mundial dessa cultura, mostrando relevância no cenário agrícola. Os nematoides do gênero Meloidogyne se destacam por sua ampla distribuição mundial e pela magnitude das perdas que causam à cultura, diretamente e pela predisposição ao parasitismo por fungos de solo. O controle biológico de fitonematoides tem sido estudado para essa cultura como uma ferramenta possível de ser usada em manejo integrado. Nesse estudo foram avaliados o controle biológico de Meloidogyne javanicaem mudas micropropagadas de bananeira ‘Prata-Anã’ por sete isolados de Pochonia chlamydosporia(Pc-10; Pc-18; Pc-20; Pc- 42; Pc-54; Pc-64 e Pc-123) e a redução do stress causado pelo nematoide nas mudas de bananeira pela aplicação do isolado Pc-10, medida pela atividade das enzimas polifenoloxidase (PFO)e fenilalanina amônia liase (FAL). Os isolados Pc- 10, Pc-64, Pc-123 e Pc-18 reduziram significativamente o número de ovos do nematoide. Pc-42, Pc-54 e Pc-20 não reduziram o número de ovos. O número de galhas nas raízes foi reduzido apenas pelo isolado Pc-10 em comparação com os outros tratamentos. Existe variação na promoção de crescimento de mudas entre os isolados de P. chlamydosporia. O isolado Pc-42 apresentou a maior concentração no solo (UFC) após os experimentos de controle biológico e de promoção de crescimento. O isolado Pc-10 reduziu o stress em mudas de bananeira inoculadas com M. javanica. / The banana (Musa spp.) is one of the most consumed fruits in the world. Brazil occupies the 5th place in the world production of this crop, showing relevance in the agricultural scenario. The nematodes of the genus Meloidogyne stand out for their worldwide distribution and the magnitude of losses that cause to the culture directly and the predisposition to parasitism by soilborne fungi. Biological control of nematodes has been studied for this crop as a possible sustainable tool to be used in integrated pest management. In this study we assessed the biological control of Meloidogyne javanica in plantlets of banana 'Prata Ana’ by seven isolates Pochonia chlamydosporia (PC-10, PC-18, PC-20, PC-42, PC-54, PC-64 and P-123) and the stress reduction caused by the nematode in banana seedlings by applying the isolate Pc-10, measured by the activity of the enzymes polyphenoloxidase (PPO) and phenylalanine ammonia lyase (PAL). The isolates PC-10, PC-64, PC-123 and PC- 18 reduced the number of nematode eggs significantly. PC-42, PC-54 and PC-20 did not cause reduction in the number of eggs. The number of galls on the roots was only reduced by PC-10 in comparison with other treatments. There was variation in the seedling growth promotion by the isolates of P. chlamydosporia. The isolate Pc-42 showed the highest concentration in the soil (CFU) after the biocontrol and growth promotion experiments. The isolate Pc-10 reduced the stress on plants inoculated with M. javanica.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2018. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: páginas 51, 52, 53, 55, 57 e anexos. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-08-30T18:16:15Z No. of bitstreams: 1 2018_EricaCristinaSilvaRego_PARCIAL.pdf: 2019467 bytes, checksum: 947f4fafb34f1929db0e14ebbcfd84ad (MD5) / Rejected by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br), reason: Boa tarde, Rejeitado a pedido do submetedor. on 2018-08-30T18:17:42Z (GMT) / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-08-30T18:23:27Z No. of bitstreams: 1 2018_EricaCristinaSilvaRego_PARCIAL.pdf: 2019467 bytes, checksum: 947f4fafb34f1929db0e14ebbcfd84ad (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-09-10T17:32:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_EricaCristinaSilvaRego_PARCIAL.pdf: 2019467 bytes, checksum: 947f4fafb34f1929db0e14ebbcfd84ad (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-10T17:32:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_EricaCristinaSilvaRego_PARCIAL.pdf: 2019467 bytes, checksum: 947f4fafb34f1929db0e14ebbcfd84ad (MD5) Previous issue date: 2018-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). / A bananeira (Musa spp.) é uma das principais fontes de alimento do mundo. A banana é uma das frutas mais consumidas na maioria dos países tropicais e subtropicais, sendo componente básico da alimentação de mais de 400 milhões de pessoas. Um grande número de patógenos causam doenças na cultura da bananeira, dentre os principais agentes estão os vírus, bactérias, nematoides e fungos. Os fungos se destacam como um dos principais causadores de perdas na produção por causarem doenças como a Sigatoka-amarela, Sigatoka-negra, e Mal do Panamá. Pseudocercospora musae (Zimm.) Deighton é o agente causal da Sigatoka-amarela, e se destaca como a principal doença fúngica da bananeira. P. musae é um patógeno hemibiotrófico, e sua a infecção ocorre por meio dos estômatos. O objetivo geral desse trabalho é caracterizar os componentes moleculares presentes na interação M. acuminata – P. musae que exerçam possíveis papéis na defesa da planta frente à infecção. Desta forma foram validados nove pares de primers para oito genes de referência com o objetivo de normalizar a expressão gênica de genes alvos em RT-qPCR em Musa. Os genes utilizados foram Actina 1 (ACT1), Adenina Fosforibosil Transferase (APT), Fator de elongação 1 alfa (EF), Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase (GAPDH), Tubulina alfa (TUBA), GTP-Binding Nuclear Protein (RAN), Ubiquitina 1 (UBIQ1) e Ubiquitina 2 (UBIQ2). As análises demostraram que os genes mais estáveis foram Ubiquitina 2 e RAN. As análises de expressão diferencial de seis genes alvos por RT-qPCR demostraram que a maioria dos genes potencialmente envolvidos em processo de defesa não foram modulados. Foi realizado também sequenciamento Illumina de isolado de P. musae in vitro a fim de identificar os microRNAs (miRNAs) do fungo. Um total de 101 pré-miRNAs candidatos foram identificados, e os alvos potenciais desses miRNAs foram preditos usando a ferramenta psRNATarget, onde foram identificados um total de 381 genes alvos no genoma de Musa acuminata. Foi observado que alguns desses genes alvos tem papel potencial em resistência a estresse biótico, tais como, NBS-LRR, fatores de transcrição da superfamília WRKY, genes análogos em resistência (RGAs) tais como, RGA1 e RGA3, citocromo P450 e quinases. A identificação contínua de genes envolvidos em resposta ao estresse biótico em M. acuminata, junto com a caracterização de miRNAs no patógeno e seu papel na modulação de expressão gênica, contribuirão para o desenvolvimento de métodos de controle da doença Sigatoka-amarela. / Banana (Musa spp.) is one of the world's most important crops, and the most popular fruit in many tropical and subtropical countries. It is a staple food for millions of people throughout the developing world. Musa spp. are hosts to many infectious diseases caused bv a vast array of phytopathogenic fungi, bacteria, viruses, and nematodes. Fungal diseases may cause considerable yield losses in banana. They are responsible for diseases such as Yellow Sigatoka, Black Sigatoka, and Panama Disease. Pseudocercospora musae (Zimm.) Deighton is the causal agent of Yellow Sigatoka, and stands out as one of the main fungal diseases of banana. P. musae is a hemibiotrophic pathogen, and its´ infection occurs through the stomata. The aim of this study is to characterize molecular compounds of the interaction Musa acuminata - P. musae that may exert possible roles in defense of the plant against infection. Nine pairs of primers were validated for eight potential reference genes with the objective of enabling accurate normalization of gene expression of target genes in RT-qPCR for Musa. The genes used were Actin 1 (ACT1), Adenine phosphoribosyltransferase (APT), Elongation factor 1-alpha (EF), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Alpha-tubulin (TUBA), GTP-Binding Nuclear Protein (RAN), Ubiquitin 1 (UBIQ1) e Ubiquitin 2 (UBIQ2). The results showed that the most stable genes were Ubiquitin 2 and GTP-binding nuclear protein RAN. Differential expression analysis of six target genes demonstrated that most of the genes potentially involved in the defense process were not modulated. Illumina sequencing of P. musae in vitro was also carried out to identify microRNAs (miRNAs). A total of 101 candidate pre-miRNAs were identified, and potential gene targets of these miRNAs were predicted using psRNATarget. A total of 381 target genes in M. acuminata genome were identified. Some of these target genes are likely involved in resistance, such as NBS-LRRs, WRKY transcription factors, resistance gene analogs (RGAs) such as RGA1 and RGA3, cytochrome P450 and kinases. The continued characterization of resistance gene candidates in M. acuminata, together with the characterization of miRNAs in the pathogen and their role in gene expression modulation, will contribute towards the development of efficient methods for control of Yellow Sigatoka disease.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas,Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-27T15:00:37Z No. of bitstreams: 1 2014_MarcoAurelioNinomiaPassos.pdf: 16854510 bytes, checksum: a4998054652f2ebc80b59742693cec5f (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-31T15:40:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MarcoAurelioNinomiaPassos.pdf: 16854510 bytes, checksum: a4998054652f2ebc80b59742693cec5f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-31T15:40:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MarcoAurelioNinomiaPassos.pdf: 16854510 bytes, checksum: a4998054652f2ebc80b59742693cec5f (MD5) / A Sigatoka Amarela em banana (Musa spp.), causada pelo fungo Mycosphaerellamusicola, provoca desordem significativa de área foliar e amadurecimento prematuro do fruto. O desenvolvimento de genótipos resistentes a fungos patogênicos é de fundamental importância. A fim de desenvolver um recurso de genômica funcional para essa cultura oferencendo compreensão sobre os mecanismos moleculares das respostas de Musa a estresses bióticos, foi realizado um estudo de pirosequenciamento do transcritoma de Musa acuminata utilizando genótipos contrastantes em resistência ao patógeno M. musicola. Amostras de RNA total foram preparadas a partir do material foliar dos genótipos Calcutta 4 (resistente) e Cavendish Grande Naine (suscetível), ambos não infectados (controles não inoculados) e artificialmente desafiados com o patógeno. O estudo gerou 978.133 seqüências de alta qualidade, com um comprimento médio de 334pb e totalizando 466Mb, das quatro bibliotecas de cDNAseqüenciadas usando o 454 GS-FLX Titanium. A montagem de novo gerou 36.384 e 35.269 seqüênciasunigenes de M. acuminataCalcutta 4 e Cavendish Grande Naine, respectivamente. Seqüências montadas foram funcionalmente mapeadas nos termos do Gene Ontology (GO). As funções do unigenes cobriram uma ampla gama de funções moleculares, processos biológicos e componentes celulares. Os genes oriundos de uma série de vias relacionadas com a defesa foram observadas em transcritos a partir de cada biblioteca de cDNA.Inúmeros fatores de transcrição foram identificados, que são tipicamente envolvidos na regulação do desenvolvimento vegetal, sinalização e resposta ao meio ambiente, entre outros papéis. Muitos deles são também conhecidas por estarem envolvidas na transdução de sinal e regulação da expressão de genes responsivos ao estresse. Mais de 99% dos unigenes mapearam em regiões exônicas no genoma referência de M. acuminata DH Pahang. Além disso, a extração de proteínas foi realizada a partir dos materiais foliares inoculados e não inoculados. A focalização isoelétrica foi realizada utilizando o sistema IPGphor. A segunda dimensão foi realizada utilizando um gel de SDS-PAGE a 12%, com géis corados com solução de azul de Coomassie G-250. Os géis foram digitalizados usando um scanner ImageScanner II (GE Healthcare), e as imagem foram analisadas utilizando o software Imagem Master 2D Platinum 7.0 (GeneBio). Foramfeitastambémanálisesparadetecção de spotscomunsaomesmo cultivar (controle e tratado), bemcomo a identificação de spots com expressãodiferencial, e detecção de spotspresentes em apenasumacondição, denominados de spotsexclusivos. No cultivar resistente Calcutta 4, foramobservados 7 spotscomumaexpressãopelomenos 1,5 vezesmaior no tratadoquandocomparadoaocontrole. O padrão de expressãofoidiferente no cultivar suscetível, onde 1 spotapresentoudiferença de expressão entre o controle e o tratado. Os resultados da análise proteômica desta interação poderá gerar informações importantes, tais como: os tipos de proteínas expressas, as mudanças pós-tranducionais e respostas a diferentes condições ambientais, o que representa um elo entre a informação genotípica e fenotípica. Essa análise proteômica, em sobreposição com as informações transcritômicas geradas pelo seqüenciamentomassal com NGS, podem vir a beneficiar futuros programas de melhoramento genético de Musa na obtenção de genótipos resistentes. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Sigatoka leaf spot disease in banana (Musa spp.), caused by Mycosphaerella mosicola, causes significant reduction in functional leaf area and premature ripening of fruit. The development of genotypes resistant to fungal pathogens is of paramount importance. In order to develop a functional genomics resource for this crop which offers insights into molecular mechanisms of responses in Musa to biotic stresses, we performed a pyrosequencing study of the transcriptome in Musa acuminata genotypes contrasting in resistance to the fungal pathogen M. musicola. Total RNA samples were prepared from whole plant leaf material from genotypes Calcutta 4 (resistant) and Cavendish Grande Naine (susceptible), both uninfected (non-inoculated controls) and artificially challenged with the pathogen. The study generated 846,762 high quality sequences reads, with an average length of 334pb and totaling 283MSb, from four full-length enriched cDNA libraries sequenced using a 454 GS-FLX system pyrosequencer with Titanium chemistry. De novo assembly generated 36,384 and 35,269 unigene sequences for M. acuminate Calcutta 4 and Cavendish Grande Naine respectively. Assembled sequences were functionally mapped to Gene Ontology (GO) terms. Unigene functions covered a diverse range of molecular functions, biological processes and cellular components. Genes from a number of defense-related pathways were observed in transcripts from each library cDNA. Numerous transcription factors were also identified, which are typically involved in regulation of plant development, signaling and response to environment, amongst others roles. Many are also known to be involved in signal transduction and expression regulation of stress-responsive genes. Over 99% of contig unigenes mapped to exon regions in the reference M. acuminata DH Pahang whole genome sequence. Furthermore, protein extraction was conducted from the inoculated and non-inoculated leaf materials. Isoelectric focusing was performed using the IPGphor system. A second dimension was performed using an SDS-PAGE gel at 12%, with gels stained with Coomassie Blue solution G-250. Gels were scanned using a scanner ImageScanner II (GE Healthcare), with image analysis performed using the software Image Master 2D Platinum 7.0 (GeneBio). Assays to detect common spots were also made at the same cultivar (control and treated), as well as the identification of differentially expressed spots, and detection of spots present in only one condition, called exclusive spots. In the resistant cultivar Calcutta 4, 7 spots were observed at least 1,5 times higher expression in the treated compared with the control. The expression pattern was different in the susceptible cultivar which showed 1 spot difference in expression between control and treated. The results of the proteomic analysis of this interaction can generate important information such as: types of expressed proteins, post-translation changes and responses to different environmental conditions, representing a link between genotyp and phenotypic information. Proteomic analysis, overlapping with transcriptome information for this pathosystem, generated by NGS sequencing, can potentially benefit future programs for genetic improvement of Musa in development of resistant genotypes