Orientador: Telma Teixeira Franco / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-25T10:33:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MariaEstelada_D.pdf: 6869313 bytes, checksum: e25d368e00276aa7116f957184aa768c (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Este trabalho visou estudar o emprego de ligantes de afinidade para extração e purificação de diferentes enzimas por partição em sistemas de duas fases aquosas (SDF A). O emprego de ligantes específicos em um estágio inicial de um processo extrativo visa reduzir o número de etapas do mesmo, pois ao aumentar a seletividade e especificidade de uma operação, as próximas são diretamente beneficiadas pela redução de carga do material contaminante. Inicialmente foram investigados métodos de ativação química do polietilenoglicol (PEG) com o intuito de torná-lo mais reativo para o acoplamento da molécula do ligante. Foram usados dois métodos de ativação deste polímero: com cloreto de tresila e com cloreto de tionila. Para ativação com cloreto de tresila, o rendimento obtido foi de 74%, determinado pela análise do enxofre elementar, enquanto que para a ativação com cloreto de tionila, o rendimento obtido foi de 86% (p/p) (capítulo 7). Um estudo para extração e recuperação da f3-galactosidase de diferentes origens microbianas: Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Aspergillus oryzae e Escherichia co/i foi então realizado (capítulo 3) e foi observado que somente a 13galactosidase de Escherichia coli era coletada na fase superior em sistema formado por PEG 4000 15% e fosfato 13,6% (coeficiente de partição, K = 52). As demais 13galactosidases eram sempre particionadas em direção à fase inferior salina juntamente com as principais proteínas contaminantes, impossibilitando a separação e purificação. Com o objetivo de separar a f3-galactosidase das outras proteínas, um processo específico de partição por afinidade foi desenvolvido, o qual consistiu de duas etapas: acoplamento específico da enzima ao ligante e rompimento desta interação. Para eficiente separação entre a f3-galactosidase de Kluyveromyces fragilis e os contaminantes protéicos foi desenvolvido um processo em duas etapas, aonde a primeira utiliza o ligante APGP (paminofenil-f3-D-tiogalactopiranosídeo). Os sistemas usados foram formados, na primeira etapa (acoplamento da enzima), por PEG 4000-APGP 6% e dextrana 505.000 8% e na segunda etapa (desacoplamento da enzima) por PEG-APGP 13% e fosfato 9%. Na primeira etapa de purificação, o K da ?-galactosidase teve um aumento de aproximadamente 2.800 vezes com o uso do PEG-APGP, apresentando recuperação de 55% da enzima na fase polimérica do sistema PEG-APGP/dextrana e a segunda etapa da purificação da enzima foi realizada em sistema formado por PEG-APGP 13% e fosfato 9%. mostrando-se altamente eficiente na reversão do K da enzima ?-galactosidase para a fase oposta. O valor do coeficiente de partição foi de 2,2 x 10-5 com 39% de recuperação da enzima na fase salina (capítulos 3 e 4). Com o intuito de investigar a capacidade do polímero de afinidade PEG-IDA-CU2+ em extrair proteínas nos SDF A, a partição da lisozima proveniente de clara de ovo e da peroxidase de soja foi investigada (capítulos 5 e 6). A lisozima de clara de ovo de galinha foi utilizada como enzima modelo nos estudos preliminares em sistemas de afinidade contendo o complexo PEG-IDA-Cu2+. Esta enzima possui um resíduo de histidina disponível na sua superfície, tornando viável sua extração neste tipo de sistema, já que um resíduo de histidina é suficiente para formar o complexo enzima-metalo-ligante. As concentrações empregadas foram de PEG 4000 13% e fosfato de potássio 9% (p/p), pH 7,0 nos SDF A sem o ligante. Em sistemas de afinidade, as concentrações do PEG-IDA-Cu2+ foram de 1, 5 e 10% e as concentrações de PEG 4000 foram de 12, 8 e 3%, respectivamente, sendo que a concentração do fosfato permaneceu em 9%. O valor do coeficiente de partição, K, foi aumentado 9 vezes quando PEG-IDA-Cu2+ foi usado nos SDF A de afinidade, sendo possível recuperar 51 % da lisozima. Para recuperação da peroxidase de soja, Glycine max, o metalo-ligante cobre (Cu2l foi acoplado ao complexo PEG-IDA, formador da fase polimérica do sistema. Duas etapas foram suficientes para a recuperação da peroxidase usando sistemas de afinidade. Na primeira etapa da extração, o sistema foi composto por PEG-IDA-CU2+ 14% e sulfato de sódio 8% para o acoplamento da enzima e na segunda etapa, um sistema constituído de PEG-IDA-CU2+ 14% e fosfato 10% foi usado para o desacoplamento da enzima, a qual foi recuperada na fase salina. Obteve-se um aumento de K de 24 vezes e recuperação maior que 109% da enzima, quando o sistema de afinidade foi usado. Na etapa de desacoplamento da enzima obteve-se 64% de recuperação. A fase polimérica foi recic1ada e usada num sistema contendo PEG-IDA-Cu2+ 14% e sulfato de sódio 8%, obtendo-se um K = 23, com recuperação de 85% da peroxidase / Abstract: In this work the extraction and purification of f3-galactosidase from different species and soybean peroxidase (Glycine max) in aqueous two-phase systems (ATPS) by bioaffinity were studied. The synthesis of affinity polymers to recover this enzyme was also studied. Initially the extraction of f3-galactosidase from Kluyveromyces Iactis, from Kluyveromyces fragi/is, from Aspergillus oryzae and from Escherichia co/i was compared. It was observed that only the f3-galactosidase from Escherichia colí partitioned to the top phase in. a system formed of 15% PEG 4000 and 13.6% phosphate (partition coefficient, K = 52). f3-galactosidases from other sources partition into the bottom salt-rich phase, together with the main contaminant proteins, preventing separation and purification. The specific ligand APGP (p-aminophenyl 1-thio-f3-D-galactopyranoside) is an inhibitor of f3-galactosidase, and it was attached to polyethylene glycol (pEG). Two methods of activation were used: activation with tresyl chloride and with tionyl chloride. The yield for activation of tresyl chloride was 74%, determined by elementary sulphur analysis, and the yield for activation with tionyl chloride was 86%. A new two-step method for extraction and purification of the enzyme f3-galactosidase from Kluyveromyces fragilís was then developed. In the first step, an affinity system composed of 6% PEG 4000-APGP and 8% dextran 505 was used, where f3-galactosidase primarily partitioned toward the top phase (K 2,330). In the second step, a system formed of 13% PEG-APGP and 9% phosphate salt was used to revert the value of the partition coefficient, K, of f3-galactosidase to 2 x 10-5, thereby achieving the purification and recovery of39% of the enzyme in the bottom salt-rich phase. The extraction of the model protein lysozyme from chicken egg white was studied by affinity in systems with the complex PEG-IDA-CU2+. This enzyme has a histidine residue available on its surface, making possible its recovery in this system. Metal affinity partitioning in ATPS is a useful tool to extract the proteins which have accessible histidine, cysteine or tryptophan on their surfaces. Partitioning of lysozyme in a PEG 4000/phosphate system, pH 7.0, was studied in the presence and in the absence of PEG-IDA-CU2+. The composition of systems without ligands was 13% PEG 4000 + 9% phosphate, and the affinity systems had correspondent amounts of PEG 4000 replaced by 1%, 5% and 10% of PEG-IDA-CU2+. The partition coefficient, K, of the lysozyme increased ninefold when 5% PEG-IDA-CU2+ was used, and 45% of the enzyme was recovered in the top ligand-rich phase of the system. This is a pioneer work on liquid-liquid extraction of lysozyme in ATPS with PEG-IDA-CU2+. Then the extraction of peroxidase from a crude extract of defatted soybean peroxidase (Glycine max) by metal affinity in an ATPS was studied. A two-step liquid liquid extraction process using metalligand was developed aiming to purify the peroxidase. In the first purification step, the system was composed of 14% PEG 4000-IDA-CU2+ and 8% Na2S04and the peroxidase partitioned mainly to the top phase (K = 24). In the second step, a system formed of 14% PEG 4000 and 10% phosphate was used to revert the value of the partition coefficient of peroxidase to the bottom salt-rich phase (K = 0.05), providing the purification and recovery of 64% of the enzyme. The top PEG 4000-IDA-CU2+ -rich phase was washed by ultrafiltration in order to remove the sulphate salt and reused in another cycle of peroxidase purification. Only two steps were enough to recover the enzymes f3-galactosidase and peroxidase in the ATPS by bioaffinity / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

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Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2007. / Title from first page of PDF file. Includes bibliographical references (p. 174-181).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:10:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318382.pdf: 1686846 bytes, checksum: 51ac5e51f122726f40392a9cb814daf3 (MD5) Previous issue date: 2013 / No presente trabalho transfectamos uma cepa de Leishmania amazonensis com um plasmídeo contendo o gene da ?-galactosidase, visando estabelecer um ensaio colorimétrico para triagem de compostos ativos contra amastigotas intracelulares de leishmania. A transfecção não alterou o crescimento de promastigotas em cultura, a infectividade de células THP-1 e de camundongos Balb/c. A atividade da enzima foi diretamente proporcional ao número de parasitos. A inibição do crescimento dos parasitos intracelulares pelo fármaco de referência Anfotericina B, determinada tanto pelo método colorimétrico quanto por contagem microscópica dos parasitos, produziu resultados semelhantes, validando o ensaio. O teste colorimétrico também foi aplicado com sucesso para avaliar a atividade de uma classe de moléculas análogas e derivadas do ácido gálico. O estudo da correlação estrutura atividade mostrou que estas moléculas possuem uma atividade leishmanicida pouco seletiva. Algumas melhorias como a transfecção integrativa e estável, bem como padronização deste método com outras espécies de Leishmania ainda são desejáveis. Contudo, o ensaio com L. amazonensis expressando ?-galactosidase foi robusto, sensível, reprodutível e rápido na avaliação da atividade leishmanicida de compostos <br>

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T05:10:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_Rosangelados_M.pdf: 814194 bytes, checksum: 40aac8890d5062af1c1b42f9e06c6d35 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Os galactooligossacarídeos (GOS), um grupo de oligossacarídeos, são carboidratos não digeríveis (NDOs), resistentes à hidrólise das enzimas digestivas do intestino, tem os efeitos fisiológicos similares ao da fibra dietética. Sua ingestão aumenta a proliferação das Bifidobacterium e dos Lactobacilus no intestino. Eles são considerados como ingredientes prebióticos. Devido aos possíveis benefícios à saúde, associados com o consumo destes compostos, seu uso como Alimento Funcional tem crescido rapidamente, particularmente no Japão e Europa. Este trabalho teve como objetivo a extração da enzima _-galactosidase a partir do microrganismo Scopulariopsis sp, de avaliar o efeito da temperatura, tempo de reação, concentração de enzima e lactose, de modo a obter condições mais eficientes para a produção de GOS, além disso, comparar esses resultados com os GOS produzidos com a enzima comercial obtida por Aspergillus oryzae. Como resultado, observamos que a linhagem de Scopulariopsis sp sintetizou grandes quantidades de b-galactosidase por fermentação semi-sólida, que foi produzida constitutivamente. A enzima semi-purificada foi precipitada de etanol 70%. O extrato foi caracterizado bioquimicamente, mostrando ter pH ótimo de 5,0 e a melhor temperatura a 45ºC, para atividade de transgalactosilação. A enzima obtida a partir de Scopulariopsis sp converteu 20% de lactose em oligossacarídeos (80.8mg/mL de 4¿galactosyl-lactose), comparando com a _- galactosidase de Aspergillus oryzae, que converteu 6% de lactose em oligossacarídeos (25.6mg/mL de 4¿galactosyl-lactose), utilizando lactose 40% (p/v), à 45ºC, pH 5.0 e 10U/mL e o melhor tempo foi o de 12h de reação. Também houve a produção de outro galactooligossacarídeo de estrutura não identificada ainda, sendo necessário estudos adicionais que elucidem a estrutura e atividade destes GOS / Abstract: The galactooligosaccharides (GOS), a group of oligosaccharide, are not digerible carbohydrates (NDOs), they are resistant to hydrolysis by digestive enzymes from intestine and have similar dietary fiber physiological effect. Its ingestion increases the Bifidobacterium and Lactobacillus proliferation in the intestine. They are considered prebiotic ingredients. Due to the possible health benefits associated with the consumption of these compounds, their use as functional ingredients has grown quickly, particularly in Japan and Europe. They aim of this work was to extract the _-galactosidase from Scopulariopsis sp, and to evaluate the temperature conditions, reaction time, lactose and enzyme concentration, to improve the GOS production, beyond that, to make a comparison with the GOS obtained by commercial enzyme produced by Aspergillus oryzae. As result the Scopulariopsis sp strain had, accumulated great amounts of _- galactosidase on semisolid fermentation and the enzyme was produced continuosly. The enzyme solution was precipitated by using 70% ethanol. The extract was biochemically characterized showing the otimum pH of 5.0, and the best temperature was 45ºC, for transgalactosylation activity. The enzyme isolated from Scopulariopsis sp has converted 20% of lactose into oligosacharides (80.8mg/mL of 4'galactosyl-lactose), comparing with _-galactosidase from Aspergillus oryzae, a commercial enzyme, that converted 6% of lactose into oligosacharides (25.6 mg/mL of 4'galactosyl-lactose), using lactose 40% (p/v), at 45ºC, pH 5.0 and 10U/mL, and the best reaction time was at 12h of reaction. We also observed the production of other galactooligosaccharide with nonidentified structure, been necessary additional research to discover their structure and activity / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

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The Arabidopsis genome encodes 17 putative beta-galactosidases belonging to Glycosyl Hydrolase (GH) family 35, which have been classified into seven subfamilies based on sequence homology. The largest of these, Subfamily III, consists of six genes, Gal-1 (At3g13750), Gal-2 (At3g52840), Gal-3 (At4g36360), Gal-4 (At5g56870), Gal-5 (At1g45130), and Gal-12 (At4g26140) that share 60-81% sequence identity at the amino acid level. All six proteins have a signal peptide that may target them to the cell exterior. We report purification and biochemical characterization of all six members of Subfamily III, each expressed as a recombinant protein in Pichia pastoris and one also in native form, purified from Arabidopsis leaves, with a special emphasis on substrate specificities. Organ specific expression of the six Gal genes was examined by analysis of the microarray databases and by semi-quantitative RT-PCR. The relative abundance and size of the Gal-1, Gal-2, Gal-5, and Gal-12 proteins was studied by immunoblotting using isoform-specific anti-peptide antibodies. The protein expression patterns of the Gal genes were generally consistent with microarray and RT-PCR data, though some discrepancies were observed suggesting distinct mechanisms of regulation for transcription and translation. Localization of total beta-galactosidase activity was visualized using the substrate, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galatopyranoside (X-Gal), to stain whole plants. Subcellular localization of the four isoforms examined by immuno-dotblotting and western blotting showed that Gal-1, Gal-2, Gal-5 and Gal-12 are present in apoplastic and cell wall bound protein extracts. Immuno-EM analysis of Gal-1 and Gal-12 showed that these proteins are localized in the cell walls of vascular and epidermal tissues in mature root. Taken together, the biochemical properties, expression patterns, and subcellular localization of these isozymes indicate that the Subfamily III beta-galactosidases all have potential functions in restructuring the cell wall during plant growth and development. / Ph. D.

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