La puissance de la biopile enzymatique à glucose/oxygène est limitée par sa partiecathodique. Afin de contourner cette limitation, nous avons étudié les enzymescathodiques : les Bilirubine oxydases (BODs). Dans le but de mieux appréhender ces BODs, lemécanisme réactionnel, la nature de l’étape limitante et l’effet des sels ont alors été étudiés.Deux mécanismes différents sont retrouvés en fonction du mode de transfert des protons etdes électrons (4 fois 1H+/1e- ou 2 fois 2H+/2e-). De plus, nous avons démontré que l’étapelimitante est l’oxydation du substrat pour les trois substrats testés et que les sels agissent auniveau du cuivre T1. Les principales limitations des BODs sont leur stabilité à 37 °C ainsi queleur inhibition par le NaCl. Deux techniques ont alors été utilisées pour identifier des BODsplus résistantes. La première méthode est l’extraction de nouvelles enzymes à partird’organismes extremophiles. Elle a permis d’isoler la BOD d’Anaerophaga thermohalophilaqui possède une bonne résistance au NaCl mais une densité de courant faible. Dans unsecond temps, afin de reconstruire des séquences ancestrales, la phylogénie de la familledes Bacillus Bacterium a été effectuée. Cette technique a permis l’identification de troisBODs possédant des caractéristiques très intéressantes : la BOD de Bacillus nakamurai etdeux BODs ancestrales (Noeud 10 et Noeud 13). Par exemple, après une heure à 37°C et 140mM de NaCl, le Noeud 10 possède une meilleure densité de courant que la BOD de Bacilluspumilus, qui est l’enzyme utilisée comme base de la phylogénie. La seconde technique estdonc une méthode de choix permettant la découverte de nouvelles enzymes à la fois plusstables et plus résistantes que les enzymes actuelles. Elle ouvre de grandes perspectivespour l’utilisation des BODs comme enzymes cathodiques ou pour d’autres applicationsbiotechnologiques. Enfin, nous avons montré que l’immobilisation de la BOD de B. pumilusdans le matériau Si-(HIPE) permet la décoloration cyclique de colorants chimiques surplusieurs mois. / Power of glucose/oxygen enzymatic biofuel cell is limited by the cathodic part. In order to prevent this limitation, we studied cathodic enzymes: Bilirubin oxidases (BODs). For this purpose, the kinetic mechanism, rate-limiting step and salts effect were determined. Two different mechanisms are observed depending on the electron/proton transfer (4 times1H+/1e- or 2 times 2H+/2e-). We also demonstrated that the rate-limiting step is the substrate oxidation for the three substrates tested and salts act around the T1 copper. Main BODs limitations are their stability at 37°C and their inhibition by NaCl. Two methods were used toidentify the most resistant BODs. The first one was the identification of new enzymes from extremophile organisms. It allows to isolate BOD from Anaerophaga thermohalophila whichhas good NaCl resistance but low current density. In addition, in order to reconstructancestral sequences, phylogeny of Bacillus Bacterium family was performed. This methodidentified three BODs with interesting features: BOD from Bacillus nakamurai and twoancestral BODs (Noeud 10 and Noeud 13). For example, after one hour at 37°C and 140 mMNaCl, Noeud 10 has a better current density than the BOD from Bacillus pumilus, which is theenzyme used as basis for the phylogeny. This second method allowed the discovery of newenzymes that were both more stable and more resistant than actual enzymes. Thistechnique opens up valuable prospects for the use of BODs as cathodic enzymes or for otherbiotechnological applications. In the end, we demonstrated that BOD from B. pumilusimmobilization in Si-(HIPE) materials allows cyclic discoloration of chemical dyes duringseveral months.

Dans la nature, la réduction du dioxygène est catalysée par des enzymes de la famille des oxydoréductases. A l’heure actuelle, ces protéines spécifiques et efficaces sont envisagés comme biocatalyseurs au sein de biopile enzymatique. Dans ce contexte, l’optimisation de l’orientation et de la connexion d’oxydases multi-cuivre (MCOs) pour la réduction d’O2 sur des matrices de nanotubes carbone (CNTs) fonctionnalisées a été étudiée. Dans un premier temps, le transfert électronique direct de la laccase est optimisé par la fonctionnalisation non covalente de CNTs par divers dérivés hydrophobes. La dynamique moléculaire ainsi que la modélisation électrochimique ont permis la rationalisation des performances des différentes biocathodes développées. Dans une seconde approche, la modification spécifique par des groupements pyrène de la surface de laccases modifiées par mutagénèse a également été envisagée. La fonctionnalisation supramoléculaire de CNTs par des feuillets de graphène fonctionnalisés d’une part, et par des nanoparticules d’or d’autre part, a également permis de favoriser la connexion de laccases. La seconde partie présente l’élaboration d’autres types de biocathodes basées sur la connexion directe de bilirubines oxydases. Plusieurs stratégies de fonctionnalisation covalente et non covalente de CNTs ont été envisagées. Les différentes biocathodes élaborées par l’assemblage supramoléculaire de MCOs et de matériaux nanostructurés délivrent des densités de courant de réduction du dioxygène de plusieurs mA cm-2. Ces nouvelles bioélectrodes combinées à une bioanode qui catalyse l’oxydation du glucose ont permis le développement de biopiles enzymatiques glucose/O2 délivrant des densités maximales de puissances allant de 250 µW cm-2 à 750 µW cm-2 selon les conditions expérimentales. Enfin une bioanode à base d’une hydrogénase hyperthermophile a été développée et associée à une biocathode à base de bilirubine oxydase pour former un nouveau design de biopile H2/O2. Au sein de ce dispositif, la biocathode à diffusion de gaz réduit directement l’oxygène provenant de l’air, ce qui permet de s’affranchir de l’utilisation d’une membrane séparatrice tout en protégeant l’hydrogénase de sa désactivation en présence d’oxygène. Cette nouvelle biopile délivre une densité maximale de puissance de 750 µW cm-2. / The reduction of oxygen is realized in nature by oxidoreductase enzymes. Currently, these highly specific and efficient proteins are considered as biocatalysts for the development of biofuel cells. In this context, optimizing the orientation and the connection of multicopper oxidase (MCOs) for the reduction of O2 on functionalized carbon nanotubes was studied. In the first part of this manuscript, direct electron transfer of laccase is assessed and optimized by the non-covalent functionalization of CNTs by various hydrophobic derivatives. Electrochemical modeling and molecular dynamics enabled the rationalization of the developed biocathodes efficiency. In a second approach, the specific modification by pyrene moieties of laccases surface modified by protein engineered has also been considered. Additionally, supramolecular functionalization of CNTs by modified graphene sheets and gold nanoparticles also helped to promote laccase connection. The second part presents the development of other types of biocathodes based on the direct connection of bilirubin oxidase. Several strategies of covalent and non-covalent CNTs functionalization have been considered. The different biocathodes developed by the supramolecular assembly of nanostructured materials and MCOs delivered current density of several mA cm-2 for oxygen reduction. These new bioelectrodes combined with a bioanode which catalyzes the glucose oxidation have enabled the development of glucose/O2 enzymatic biofuel cells; delivering maximum power densities from 250 µW cm-2 to 750 µW cm-2 depending on the experimental conditions. Finally a hyperthermophilic hydrogenase based bioanode was developed and associated with a bilirubin oxidase-based biocathode to form a new design of H2/O2 biofuel cell. Within this device, the gas diffusion biocathode directly reduces oxygen from the air, which eliminates the use of a separation membrane while protecting the hydrogenase from its deactivation in the presence oxygen. This new biofuel cell delivers a maximum power density of 750 µW cm-2.

Les travaux présentés dans cette thèse visent à étudier les interfaces "nanocatalyseur/glucose" et "enzyme/O2" d'une biopile hybride. Dans ce cadre, une nouvelle méthode de synthèse de nanoparticules à base d'or et de platine a été développée. Ces nanomatériaux ont été caractérisés par différentes méthodes physicochimiques pour connaître leur taille, leur morphologie et leur dispersion dans un substrat carboné (Vulcan XC72R). La surface active de chaque électrode a été déterminée par voltammétrie cyclique et par CO stripping. Il a été montré que dans les catalyseurs AuxPty, l'or a un effet promoteur sur le platine vis-à-vis de l'oxydation du glucose. Le catalyseur Au70Pt30 présente la meilleure activité catalytique. L'étude par spectroélectrochimie a permis de déterminer que la B–gluconolactone est le produit primaire de l'oxydation du glucose qui procède à bas potentiel par la déshydrogénation du carbone anomérique sur le platine. La réaction de réduction de O2 a été catalysée par une enzyme, la bilirubine oxydase (BOD). Pour faciliter le transfert électronique, deux médiateurs : ABTS et un complexe d'osmium ont été encapsulés avec l'enzyme dans une matrice de Nafion® pour créer les interfaces : BOD/ABTS/O2 et BOD/Os/O2. L'étude voltammétrique des deux médiateurs en milieu tampon phosphate a révélé deux systèmes quasi-réversibles avec des potentiels apparents proches du potentiel redox du site T1 de la BOD. Bien que difficilement comparables en termes de densité de courant au catalyseur constitué de nanoparticules de platine, les cathodes enzymatiques permettent de catalyser à quatre électrons la réduction de O2 à des potentiels très proches du potentiel de Nernst. / The work developed in this thesis concerns the study of the behavior of redox reactions at the interfaces "nanocatalyst/glucose" and "enzyme/O2" for a hybrid Biofuel Cell. In this framework, a novel synthesis method of based gold and platinum nanoparticles has been achieved. These synthesized nanomaterials were characterized by different physicochemical techniques to determine their size, morphology and their dispersion in Vulcan XC72R used as substrate. The active surface area of each electrode material was determined by cyclic voltammetry and CO stripping. It has been shown that in the bimetallic catalyst gold promotes platinum activity towards the glucose oxidation. The bimetallic composition Au70Pt30 exhibits the better efficiency. The study by spectroelectrochemistry determined that the B-gluconolactone is the primary product of the glucose oxidation which proceeds at low potential by the dehydrogenation of anomeric carbon on platinum. The reduction reaction of O2 was catalyzed by an enzyme, bilirubin oxidase (BOD). Mediated electronic transfer was performed with two redox mediators, ABTS and an Osmium complex (Os). They have been encapsulated with the enzyme in a Nafion® matrix to construct the interfaces: BOD/ABTS/O2 and BOD/Os/O2. The voltammetric study of the mediators in phosphate buffer revealed two quasi-reversible systems with an apparent potential close to the theoretical potential of the T1 BOD center. Although hardly comparable in terms of current density with the Pt nanocatalyst the O2 reduction is a four electron reaction at the cathodes BOD/ABTS and BOD/Os which deliver an electrode potential close to the Nernst one.

Dans la nature, la réduction de l'oxygène et l'oxydation de l'hydrogène sont catalysées par des enzymes oxydoréductases. Ces catalyseurs spécifiques, efficaces, renouvelables et biodégradables constituent une alternative séduisante au platine dans les piles à combustible. L'immobilisation à des interfaces nanostructurées de l'hydrogénase membranaire tolérante à l'oxygène de la bactérie hyperthermophile Aquifex aeolicus, et de la bilirubine oxydase thermostable de la bactérie Bacillus pumilus, a été étudiée dans ce sens.L'électrochimie et la dynamique moléculaire ont permis d'affiner le modèle d'orientation de l'hydrogénase sur les surfaces planes. L'efficacité de l'immobilisation de l'hydrogénase sur différents nanomatériaux carbonés (nano-particules, tubes et fibres de carbone) structurant la surface de l'électrode a été évaluée. Les nanofibres de carbone (CNFs) ont permis de former une bioanode efficace pour l'oxydation de l'H2 en l'absence de médiateurs redox. L'étude a souligné l'importance d'un transport efficace du substrat dans le film carboné mésoporeux. Les CNFs ont également été utilisées comme matériau d'électrode pour réaliser la 1ère connexion directe de la bilirubine oxydase. L'existence d'une forme resting alternative de l'enzyme, influencée par les ions chlorures, le pH et la température, a été mise en évidence. Une biocathode efficace pour la réduction de l'oxygène a été développée.Les deux électrodes thermostables ont permis le développement de la 1ère biopile H2/O2 qui délivre des densités de puissance supérieures au mW.cm-2 sur une large gamme de température. Ce résultat ouvre la voie à l'alimentation électrique de dispositifs de faibles puissances. / The oxygen reduction and the hydrogen oxidation reactions are realized in nature by oxidoreductase enzymes. These highly efficient, specific, renewable and biodegradable catalysts appear as a seducing alternative to platinum in fuel cell devices. The immobilization at nanostructured interfaces of the membrane-bound oxygen-tolerant hydrogenase from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus, and of the thermostable bilirubin oxidase from Bacillus pumilus, has been studied within this objective.Electrochemistry and molecular dynamics have been used to validate the orientation model of the hydrogenase at planar electrodes. Hydrogenase immobilisation in 3D-networks based on various carbon materials (nanoparticles, nanotubes and nanofibers) has been especially studied. Fishbone carbon nanofibers were demonstrated to provide an efficient platform for mediatorless H2 oxidation. Mass transport inside the carbon mesoporous film has been especially studied and demonstrated to be one of the limitations of the catalytic efficiency. Direct electrical connection of bilirubin oxidase has also been realized for the first time thanks to its immobilization on carbon nanofiber films. An alternative resting form of the enzyme, influenced by chlorides, pH and temperature, has been evidenced. An efficient biocathode for the oxygen reduction reaction has been developed. Thanks to the two thermostable electrodes, the first H2-O2 bio fuel cell able to deliver power densities over 1 mW.cm-2 over a large temperature range has been developed. This result paves the way for the electrical alimentation of low-power devices.

La première partie du travail présenté ici se concentre sur l’optimisation d’une cathode à oxygène. Tout d’abord, l’utilisation d’une nouvelle enzyme (la BOD de Magnaporthe oryzae) permet de multiplier le courant de réduction de l’oxygène en eau jusqu’à neuf fois. Ensuite la synthèse d’un polymère rédox adapté a permis d’améliorer le coefficient de diffusion des électrons dans l’hydrogel résultant en l’augmentation de la densité de courant générée. Enfin nous sommes passés d’uneélectrode de carbone en 2 dimensions à une fibre d’or poreuse tridimensionnelle. Après modification de cette fibre avec l’hydrogel rédox à base de BOD de M. oryzaenous avons évalué sa biocompatibilité : in vitro les tests ont montré l’absence totale de cytotoxicité et seule une très faible réponse inflammatoire ; in vivo aucune infection ne s’est déclarée pendant les 8 semaines d’implantation dans les souris etla formation d’une capsule fibrotique autour de l’électrode traduit sa bonne intégration dans les tissus de l’animal. La seconde partie concerne la biopile dans son intégralité, construite à partir de la cathode optimisée et d’une anode adaptée à base de GDH. Elle permet de générer jusqu’à 240 μW.cm-2 dans du tampon Pipes/CaCl2 à 5mM de glucose. La biopile a ensuite été testée dans du sang humain total. Un maximum de 129 μW.cm-2 a été obtenu dans un échantillon avec une glycémie de 8,2 mM sous air. De plus nous avons constaté que la densité de puissance délivrée augmente proportionnellement avec la glycémie des différents échantillons de sang testés, faisant de la biopile à la fois une source d’électricité et un biocapteur à glucose ce qui n’avait jamais été démontré auparavant. / The first part of the work presented here focuses on the optimization of an oxygen cathode. First, the use of a new enzyme (BOD from Magnaporthe oryzae) permit to increase the current of reduction of oxygen into water by a factor nine. Then the synthesis of a suitable redox polymer greatly improved the diffusion coefficient of electrons in the hydrogel, resulting in an increase of the current density. Finally we switched from a two-dimensional carbon electrode to a three-dimensional porous gold fiber. After modification of the fiber with the redox hydrogel based on BOD from M. oryzae, we assessed its biocompatibility: in vitro the tests showed the total absence of cytotoxicity and only a very low inflammatory response; in vivo noinfection appeared during the 8 weeks of implantation in mice and the formation of afibrotic capsule around the device reflects its successful integration into the animal tissues.The second part concerns the full biofuel cell, elaborated from the optimized cathode and an adapted GDH-based anode. It could generate up to 240 μW.cm-2 at 5mMglucose in Pipes/CaCl2 buffer. The biofuel cell was then tested in whole human blood. A maximum of 129 μW.cm-2 was obtained in a sample with 8,2 mM glycaemiaunder air. In addition we observed that the delivered power density increased proportionally with the glycaemia of the different blood samples tested, making the biofuel cell both a power source and a glucose biosensor at the same time which had never been shown before.