Os fungos são microrganismos amplamente dispersos, podendo ser encontrados em vegetais, animais, solo e ambientes aquáticos, participando do ciclo de elementos na natureza. Embora muitos papéis ecológicos tenham sido estudados e descritos para os fungos terrestres, a ecologia de fungos marinhos ainda é pouco conhecida. Assim, os oceanos, que representam aproximadamente metade da biodiversidade global, são uma fonte enorme e virtualmente inexplorada de microrganismos produtores de novos produtos naturais. O objetivo deste trabalho foi isolar linhagens de fungos derivados de uma espécie de alga marinha do gênero Sargassum, visando à avaliação do seu potencial para a produção de metabólitos secundários bioativos. Ao todo foram isoladas 58 linhagens, das quais 52 foram crescidas em meio de cultura líquido e, após a extração com solventes orgânicos, deram origem a 99 extratos. Tais extratos foram avaliados por ensaios de atividade biológica, cromatografia em camada delgada (CCD), ressonância magnética nuclear (RMN) e cromatografia líquida acoplada a detectores de arranjo de diodos, espalhamento de luz evaporativo e espectrômetro de massas (LC - PDA - ELSD - MS). A avaliação pelo ensaio antibiótico foi o que resultou no maior número de extratos ativos (n = 13), seguido dos ensaios enzimático (n = 8), citotóxico (n = 3) e anti-tuberculose (n = 1). O extrato AS Fub 39, que apresentou atividade antibiótica, foi selecionado para estudos adicionais. Este extrato foi purificado por HPLC, e o seu composto majoritário identificado como sendo o 8-metóxi-3,5-dimetilisocroman-6-ol. Posteriormente, a linhagem AS Fub 39 foi taxonomicamente identificada como pertencendo à espécie Penicillium steckii. / Fungi are widely disperse microorganisms, typically associated with plants, animals, soil and aquatic environments (fresh and sea water), participating in the elements cycling. Although many ecological roles have been described for terrestrial fungi, ecological studies of marine derived fungi are still scarce. Therefore, oceans, which represent approximately half of the global biodiversity, are a huge and virtually unexplored source of microorganisms producers of interesting metabolites. The aim of this study was to isolate fungal strains derived from a marine algae of the Sargassum genus, and the evaluation of their metabolical potential for the production of secondary metabolites. Overall, 58 strains were isolated, of which 52 were grown in liquid culture media and extracted with organic solvents, originating 99 crude extracts. These extracts were analyzed by bioassays, thin layer chromatography (TLC), nuclear magnetic resonance (NMR) and liquid chromatography coupled with a photo diode array, an evaporative light scattering, and a mass spectrometry detectors (LC - PDA - ELSD - MS). The evaluation with the antibiotic assay resulted in the largest number of active extracts (n = 13), followed by the enzymatic (n = 8), the cytotoxic (n = 3) and the antituberculosis (n = 1) assays. The crude extract AS Fub 39, which presented antibiotic activity, was selected for additional studies. This extract was purified by HPLC, and its major compound identified as the 8-methoxy-3,5-dimethylisocroman-6-ol. Later, the AS Fub 39 strain was taxonomically identified as Penicillium steckii.

Os efeitos clastogênicos de campos magnéticos de freqüência extremamente baixa (ELF) foram investigados usando o bioensaio Tradescantia pallida (Trad-MCN). Inflorescências expostas durante 8 horas a doses de ELF-416mG, 833mG, e 4160mG, prescritas para exposição do público e ocupacional, apresentaram freqüência de micronúcleos aumentada no grupo que recebeu a maior dose (10.32±7.31), comparado com os demais (p=0.00, Kruskal-Wallis). Foi demonstrado que a exposição à ELF, induz danos ao DNA de Tradecantia. Estes resultados encorajam o uso deste bioensaio para avaliar a utilidade do monitor em estudos de campo, auxiliando na caracterização da função do ELF como causa de neoplasmas / The clastogenic effects of the extremely low frequency magnetic fields (ELF) were investigated using Tradescantia pallida micronucleus assay (Trad-MCN). Inflorescences exposed during 8 hours to doses of ELF-416mG, 833mG, e 4160mG, prescribed for public and occupational exposures, showed increased frequency of micronuclei in the group receiving the highest dose (10.32±7.31), compared with others (p=0.00, Kruskal-Wallis). We demonstrated that an ELF exposure induces DNA damage in Tradescantia. This results encourages the use of this assay to evaluate the usefulness of this monitor in field studies, helping to characterize the role of ELF in causing neoplasm

Para atestar a imunogenicidade de vacinas contra raiva, os testes de titulação e de soroneutralização de vírus rábico em células BHK-21 foram validados quanto à linearidade, precisão, exatidão e robustez. Cinco esquemas de imunização com diferentes concentrações, vias de inoculação e intervalos entre as doses foram avaliados em camundongos com vacina contra raiva em células Vero. O grupo II que recebeu um esquema de 2 doses e intervalos maiores (0 e 60 dias) apresentou títulos de anticorpos neutralizantes [ACN] mais elevados (46,1 UI/mL) do que o Grupo I (19,4 UI/mL), de 3 doses e intervalos menores (0,7 e 28 dias). O grupo III, que recebeu 2 doses, sendo a 1ª diluída 1/10, apresentou ACN semelhantes ao grupo II (39,2 UI/mL), sendo igualmente eficaz. Nenhum animal do grupo IV, imunizado por via oral (VO) apresentou ACN, indicando supressão e todos os do grupo V, imunizados VO com antígeno adsorvido/encapsulado em sílica nanoestruturada SBA-15, apresentaram títulos de ACN detectáveis, mostrando que o antígeno foi protegido da degradação no trato gastrointestinal. / To assure the reliability of the results of immunogenicity of rabies vaccines, tests of virus titration and neutralization in BHK-21 cells were validated for linearity, precision, accuracy and robustness. Five schemes of immunization with different concentrations, routes of inoculation and intervals between doses were evaluated in mice with rabies vaccine in Vero cells. Group II, immunized with 2 doses and enlarged interval (0 and 60 days) presented higher levels of neutralizing antibody (NAs) (46,1 IU/mL) than group I (19,4 IU/mL), with 3 doses and shorter intervals (0,7 and 28 days). Group III, which received 2 doses, the 1st diluted to 1/10, presented results similar to group II (39,2 IU/mL). None mouse of Group IV, immunized by oral route, presented NAs, indicating suppression and all mice of group V, immunized by oral route with vaccine adsorbed/encapsulated in nanostructured SBA-15 silica presented detectable NAs titers, showing that the SBA-15 silica prevented the antigen degradation in the gastrointestinal tract.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica utilizada como biopesticida contra insetos, principalmente Lepidoptera, Coleoptera e Diptera, e na produção de organismos geneticamente modificados. Com a descoberta da capacidade de Bt se movimentar sistemicamente em plantas, potencialmente atingindo insetos sugadores, surge uma nova possibilidade para o controle de Diaphorina citri Kuwayama, que transmite bactérias associadas ao Huanglongbing, uma séria doença da citricultura. O objetivo do trabalho foi desenvolver sistemas de aquisição de Bt por D. citri, in vitro e in planta, para estudos de patogenicidade. Uma estirpe de Bt transformada com o gene green fluorescent protein (Btk-gfp), cultivada em meio NYSM, foi usada como marcador de aquisição pelo inseto e movimentação nas plantas. Para o sistema de aquisição in vitro, selecionaram-se dietas com base na sobrevivência e atividade alimentar de D. citri. Btk-gfp foi adicionada à dieta selecionada, composta por uma solução de sacarose a 30% em água mineral com corantes alimentícios (verde 0,1% e amarelo 0,4%). A dieta foi acondicionada em um sachê formado por duas membranas de Parafilm®, sobre a parte inferior de uma placa de Petri de 40 mm de diâmetro (gaiola de alimentação). Dez insetos foram confinados em cada gaiola para períodos de acesso à aquisição (PAA) de até 48 h, estabelecendo-se 10 gaiolas por tratamento; como controle, utilizou-se a dieta sem Btk-gfp. Para testes de aquisição in planta, suspensões de Btk-gfp foram inoculadas em ramos novos cortados e no solo, próximo à haste de seedlings de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de murta [Murraya paniculata (L.) Jack], e em diferentes concentrações, avaliando-se a movimentação da bactéria após um período de 48 h. Posteriormente, adultos e ninfas de D. citri foram confinados nestas plantas para avaliar a aquisição de Btk-gfp, usando-se plantas inoculadas apenas com água como controle. Para os bioensaios de patogenicidade a D. citri, 21 estirpes de Bt foram testadas no sistema de aquisição em ramos cortados de murta e 5 estirpes em ramos cortados de laranja para ninfas de 3º. ínstar. In vitro, testaram-se 3 estirpes contra ninfas de 3º. ínstar e 9 contra adultos. Btgfp foi absorvido pelas raízes e ramos novos cortados de seedlings de laranja doce e de murta, e translocado até as folhas, mostrando movimentação sistêmica. Esta estirpe foi adquirida por adultos e ninfas de D. citri que se alimentaram nos ramos novos cortados, mantidos em suspensão bacteriana. O sistema de alimentação in vitro permitiu a aquisição de Bt-gfp (pellet ressuspendido na dieta de sacarose com corantes) por adultos de D. citri com apenas 12 h de PAA, mas 30 h é um período ótimo para exposição do inseto ao sistema. Nenhuma das nove estirpes testadas no sistema in vitro foi patogênica aos adultos de D. citri. Das 21 estirpes testadas contra ninfas de 3º. ínstar em ramos novos de murta, cinco causaram mortalidade de 24 a 45%, em 5 dias. Essas cinco estirpes também foram testadas contra ninfas dem ramos de citros cortados, causando mortalidade de 35 a 75% em 48 h. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium widely used as a biopesticide against insect pests, mainly Coleoptera, Lepidoptera and Diptera, or for engineering genetically-modified plants. The recent finding that Bt is able to move systemically within plants, potentially targeting piercing-sucking insects, suggests that the bacterium may be effective for microbial control of Diaphorina citri Kuwayama, the vector of Huanglongbing-associated bacteria, a serious citrus disease. The goal of this research was to develop in vitro and in planta acquisition systems of Bt by D. citri for pathogenicity assays. A transformed Bt strain with the green fluorescent protein gene (Btk-gfp), grown in NYSM medium, was used as a marker to demonstrate bacterial acquisition by the insect and movement within the plants. Artificial diets were selected for the in vitro acquisition system based on insect survival and feeding activity. Btk-gfp was added to the selected diet, a 30% sucrose solution in mineral water with green (0.1%) and yellow (0.4%) food coloring. The diet was placed inside a Parafilm® membrane sachet, covering the opening of the lower half of a 40-mm diameter culture plate, and forming the feeding cage. Ten D. citri adults or nymphs were introduced in each cage and allowed acquisition access periods (AAP) of up to 48 h on the diet; as a control, a diet without Btk-gfp was used. For testing the in planta acquisition system, Btk-gfp suspensions were inoculated in young stem cuttings or in the soil, near the stem of Citrus sinensis (L.) Osbeck and Murraya paniculata (L.) Jack seedlings, as well as in different concentrations, and bacterial movement was assessed after 48 h; plants inoculated with water were used as controls. D. citri adults and nymphs were confined on inoculated plants to verify Btk-gfp acquisition. In pathogenicity assays, 21 Bt strains were tested against 3rd instars of D. citri using the acquisition system with stem cuttings of M. paniculata and 5 strains were tested using citrus stem cuttings. The in vitro acquisition system was used to test pathogenicity of 3 and 9 Bt strains against 3rd-instar nymphs and adults, respectively. Bt-gfp absorbed by roots or young stem cuttings of inoculated C. sinensis and M. paniculata was detected in the leaves, showing systemic movement. Bt-gfp was isolated from groups of nymphs and adults that were fed on inoculated stem cuttings or on artificial diets with bacterial suspension, showing that both in planta and in vitro acquisition take place. D. citri adults can acquire Bt-gfp within 12 h of AAP to the artificial diet with bacterium inoculum, but 30 h is the optimum AAP. None of the nine Bt strains assayed in vitro were pathogenic to D. citri adults. Of 21 strains tested for pathogenicity against nymphs using inoculated stem cuttings of M. paniculata, five caused mortality rates varying from 24 to 45% mortality within 5 days. These five Bt strains were also tested against D. citri nymphs using young stem cuttings of C. sinensis, causing mortality rates of 35 to 75% within 48 h.

Foram realizados testes de toxicidade ao longo de dois anos, com amostras de água e sedimento do rio Corumbataí, entre Novembro de 2004 e Setembro de 2006, com o objetivo de avaliar a qualidade da água e do sedimento. Os testes de toxicidade aguda realizados com os organismos Chironomus xanthus, Daphnia magna, Hydra attenuata, Lactuca sativa e Pseudokirchneriella subcapitata indicaram variados graus de toxicidade nos diferentes pontos de coleta do rio Corumbataí, com maior ocorrência de toxicidade nos pontos de coleta mais próximos à foz do rio, principalmente devido à afluência do Ribeirão Claro. Todas as amostras de sedimento se mostraram mais tóxicas do que as amostras de água dos mesmos locais, para todos os organismos utilizados, em todas as coletas realizadas. Para todos os organismos, foram realizados testes de sensibilidade, com substância de referência (NaCl), mensalmente, a fim de garantir a qualidade dos cultivos em laboratório e dos bioensaios realizados, com resultados regulares e satisfatórios. Os efeitos produzidos pelas amostras ambientais sobre as sementes de alface (Lactuca sativa) foram bastante variáveis e irregulares, não possibilitando os cálculos de CI50. Decidiu-se por bem suspender a realização deste teste após um ano. Dentre todos os endpoints avaliados, os dos testes de Hydra attenuata e Pseudokirchneriella subcapitata se mostraram mais sensíveis, e o de Daphnia magna o menos sensível às amostras testadas. A avaliação da toxicidade através de efeitos subletais em H. attenuata se mostrou um bom parâmetro de avaliação das condições ambientais do rio Corumbataí, sendo um dos endpoints mais sensíveis utilizados. Outros testes de toxicidade foram realizados em algumas das oito coletas realizadas neste estudo, em caráter complementar: teste de toxicidade crônica com D. magna, teste de toxicidade LuminoTox, que utiliza sistemas enzimáticos vegetais, e o teste de genotoxicidade com Allium cepa, com o objetivo de avaliar suas sensibilidades e contribuições ao estudo. Estes bioensaios adicionaram informações a respeito dos níveis de poluição e toxicidade do rio Corumbataí, contribuindo com os bioensaios principais. Informações como parâmetros físicos e químicos, quantificação de elementos químicos e herbicidas ofereceram subsídios para a interpretação dos resultados obtidos com os testes de toxicidade. São apresentados também resultados das atividades referentes ao estágio de doutorado realizado no exterior (doutorado-sanduíche), no período de Setembro a Dezembro de 2007, na agência de proteção ambiental Environment Canada, no qual foi aplicado um teste de toxicidade com linhagens microbianas (MARA assay) em amostras de água e sedimento, juntamente com nanomateriais / Toxicity tests were conducted for two years with water and sediment samples from Corumbataí River, between November 2004 and September 2006, in order to assess the water and sediment quality. Acute toxicity tests conducted with Chironomus xanthus, Daphnia magna, Hydra attenuata, Lactuca sativa and Pseudokirchneriella subcapitata showed varying degrees of toxicity along the river course, with more toxic results in the sampling sites near the river mouth, due mainly to the inflow of Ribeirão Claro. All sediment samples were more toxic than the water samples (from the corresponding sites), for all test organisms, and for all samplings. Sensitivity tests were performed monthly, with NaCl as the reference toxicant, in order to guarantee both the laboratory culture quality and the bioassays conducted with these organisms. Results with NaCl were regular and satisfactory. The effects of the samples on lettuce seeds (L. sativa) were irregular, thus not allowing the estimative of IC50. It was decided to suspend the performance of this bioassay after one year of testing. Among all studied tests and endpoints, the tests with H. attenuata and P. subcapitata had the most sensitive endpoints, and the acute toxicity test with D. magna had the less sensitive one. Toxicity assessment of Corumbataí River based on Hydra sub-lethality endpoint was one of the most sensitive among the tested ones. Other bioassays were conducted at least once as part of this study, as a complementary assessment: the 21-day chronic toxicity test with D. magna, the LuminoTox bioassay, and the genotoxicity test with Allium cepa, in order to assess their sensitivity and contribution to the present study. These bioassays added information about the contamination levels and toxicity of Corumbataí River, contributing with the main bioassays performed. Data such as physical and chemical parameters, metals and herbicides determinations had a contribution to bioassay results interpretation. Results from a research project developed during a four-month stay (from September 2007 to December 2007) at Environment Canada Protection Agency are further described, regarding the application of the MARA bioassay, (conducted with 11 microbial strains), testing water and sediment samples, along with nanomaterials

Este trabalho foi desenvolvido nos reservatórios, em cascata, que fazem parte do Médio e Baixo Rio Tietê, incluindo os tributários, os Rios Tietê, Piracicaba e Bauru. Foram considerados os pontos de coleta, localizados à montante, jusante, bem como os pontos intermediários dos reservatórios estudados. Considerando-se os períodos referentes a outubro de 1999 fevereiro, maio e julho de 2000, as pesquisas nestes locais abordaram a qualidade ambiental dos reservatórios, com características limnológicas (água, sedimento), a fauna de macroinvertebrados bentônicos, além de testes ecotoxicológicos (Chironomus xanthus). As análises dos sedimentos permitiram evidenciar as frações de silte e argila, o elevado teor de matéria orgânica nos reservatórios situados no início da cascata, além do nitrogênio e fósforo e metais potencialmente biodisponíveis. Elevadas concentrações de nutrientes nitrogenados e fosfatados, material em suspensão (orgânico e inorgânico) e clorofila-a, foram observadas nas amostras de água, o que permitiu classificar os reservatórios como eutróficos, mesotróficos e oligotróficos, de acordo com sua posição no sistema bem como do período amostrado. As concentrações de alguns dos metais encontrados na água estiveram acima do permitido pela Resolução CONAMA (20/96), considerando-se os períodos em estudo. Quanto às relações bióticas, foram obtidas através do índice de Diversidade (H\'), da equitabilidade, a qual foi evidenciada pela distribuição agregadados organismos e a presença de indivíduos pertencentes à mesma espécie, evidenciou a baixa riqueza de taxa. Através do IET/Densidade de Oligochaeta constatou-se para os reservatórios em cascata e os principais tributários características de eutrofizados. A fauna bentônica dos rios Tietê, Piracicaba e Bauru e dos reservatórios dos locais de estudo caracterizou-se pela presença de Tubificidae (Oligochaeta) além de Chironomidae (Díptera), e do grupo Mollusca. Entre os Tubificidae, a espécie Limnodrilus hoffmeisteri, Branchiura sowerbyi e Limnodrilus udekemianus ocorreram em considerável dominância numérica no período de estudo. A Família Chironomidae, foi representada pelos gêneros Goeldichiromus e Coelotanypus e o grupo Mollusca pelo gênero, Haylacostoma e espécie Melanoides tuberculatus (Thiaridae), Corbicula fluminea (Corbiculidae), o gênero Biomphalaria (Planorbidae) e o gênero Lymnaea collumela, (Lymnaiidae). Quanto à Família Naididade foi representada pelas espécies (Prístina americana, Dero nívea, Dero digitata e Allonais chelata), pela família Alluroididae (Brinkhurstia americanus) e pela Família Opistocystidae (Opistocysta funiculus). Os testes de toxicidade com Chironomus xanthus confirmaram os resultados obtidos através das análises físicas e químicas, conferindo características de impactados aos reservatórios situados no início da cascata (Barra Bonita, Bariri e Ibitinga) e aos tributários (Tietê, Piracicaba e Bauru) moderadamente poluídos aos reservatórios intermediários (reservatório de Nova Avanhandava e Promissão) e, com ausência de poluição, o Reservatório de Três Irmãos, situado no final da cascata. Os resultados decorrem dos usos e ocupação do solo, atividades antropogênicas na Bacia Hidrográfica, do aporte de materiais para o sistema na qual se inserem os rios e os reservatórios estudados. / This work was developed in the reservoirs, at waterfalls, which are part of the Medium and Low Tiete River, including its tributaries, the Tiete, the Piracicaba river and the Bauru river. The collecting sites considered were upstream, downstream and those intermediary sites of the reservoirs. Taking into account the different periods of October 1999 and February, May and July of 2000, the researches in those sites were about the environmental quality of the reservoirs with limnologic characteristics (water, sediment), the bentonic macroinvertebrate fauna besides ecotoxilogic tests (Chironomus xanthus). The sediment analysis allowed to evidence the silt and clay fractions, the high organic matter content in the reservoirs located at the waterfall head in addition to nitrogen, phosphur and potentially bio-available metals. High nitrogened and phosphated nutrients, suspended matter (organic and inorganic) and chlorophyl-a were observed in the water samples, which allowed to classify the reservoirs as euthrophic, mesotrophic and oligotrophic according to their location in the system and the sampling period. The concentration of some metals found the water was above the level permitted by CONAMA Resolution (20/96) taking into account the periods of study. As to the biotic relations, they were obtained by means of the Diversity index (H\') of the equitability, which was evidenced by the aggregated distribution of the organisms and the presence of individuals belongingto the same species evidenced the low taxa richness. Through the IET/Oligochaeta abundance, the reservoirs and the tributaries were found to be eutrophitized. The Tiete, Piracicaba and Bauru rivers and the reservoirs studied sites bentonic fauna was characterized by the presence of Tubificidae (Oligochaeta) besides Chironomidae (Diptera) and the Mollusca group. Among the Tubificidae, the Limnodrilus hoffmeisteri, Branchiura sowerbyi e Limnodrilus udekemianus species occurred in considerable numerical dominance in the period of study. The Chironomidae family was represented by the genus Goeldichiromus and Coelotanypus and the Mollusca group by the genus Haylacostoma and Melamoides tuberculatus (Thiaridae) species, Corbicula fluminea (Corbiculidae), the genus Bionphalaria (Planorbidae) and the genus Lymnaea collumela (Lymnaiidae). The Naididae family was represented by the species (Pristina americana, Dero nivea, Dero digitata and Allonais chelata), by the family Alluroididae (Brinkhurstia americanus) and the family Opistocystidae (Opistocysta funiculus).The toxicity tests with Chironomus xanthus confirmed the results obtained through physical and chemical analyses granting characteristics of impacted to the reservoirs located at the waterfall head (Barra Bonita, Bariri and Ibitinga) and the tributaries (Tiete, Piracicaba and Bauru) moderately polluted to the intermediate reservoirs (Nova Avanhandava and Promissão reservoirs) and, absenceof pollution, the Tres Irmãos Reservoir located at the end of the waterfall. The results arise from the uses and occupation of the soli, anthropogenic activities in the hydrographic basis, disclosure of materials into the system in which are the rivers the reservoirs under study are located.

O objetivo deste estudo foi aumentar o banco de dados em relação a resíduos (cake) e efluentes (licor) industriais e o seu nível de clastogenicidade. Este estudo contribuiu para mostrar: a) que o bioensaio com Tradescantia pallida foi sensível para a avaliação da clastogenicidade em mistura complexa de resíduos catalíticos industriais, nunca testados anteriormente. b) a tendência de uma dose resposta para ambos os resíduos catalíticos c)a pasta (cake) apresenta maior clastogenicidade que o licor nas concentrações estudadas. Provavelmente isto se deve a menor concentração de Ti e Al no licor do que no cake. / The aim of this study was to increase data concerning liquid effluent (liquor) and solid waste (cake) and their level of clastogenicity using TradMCN. This study contributed to show a) bioassay Trad-MCN with Tradescantia pallida was sensitive to evaluate the clastogenicity in a complex waste mixture, never tested before b) a tendency of a dose response for both catalytic wastes. c) higher clastogenicity of cake comparing to liquor effluent in concentrations evaluated. Probably this is due to the much lower Ti and Al concentrations in the liquor than in the cake

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6412.pdf: 14036212 bytes, checksum: dc6e90045bca1050bc9fd76f94f1f30a (MD5) Previous issue date: 2014-06-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / The increase in the production of antimicrobial metabolites by Paenibacillus polymyxa RNC-D was appraised through the study of cultivation variables. Two process variables, namely the glucose and inoculum concentrations, were evaluated in different levels (5 to 40 g/l, and 2.5% to 5.0% v/v, respectively), and their effects on biomass formation, minimal inhibitory concentration (MIC) against Escherichia coli and surface tension reduction (STR) were studied. The fermentation process was firstly carried out using non-optimized parameters, where the dependent variables biomass, MIC and STR reached the values of 0.6 g/l, 1.000,0 μg/ml and 18.4 mN/m, respectively. The optimum glucose (16 g/l) and inoculum concentrations (5.0% v/v) were defined in order to maximize the biomass formation, with low value of MIC and large STR of extract. Under these conditions, a biomass of 2.76 g/l, MIC of 15.8 μg/ml, and STR of 14.58 mN/m were predicted by the model. Data attained by experiments using optimized settings showed the following values: biomass 2.05 g/l; MIC 31.2 μg/ml; STR 10.7 mN/m. Thus, the percentage of improvement for each target response was: biomass 241.6%; MIC 96.88%; STR 41.85%. It was found that high concentrations of glucose substrate, although reflected in an increase in bacterial biomass, inhibited the microbial secondary metabolism, resulting in a low production of biomolecules associated with high values of MICs. Thus, initial concentrations of glucose and inoculum are shown as variables of strong influence in the production of antimicrobial metabolites by P. polymyxa RNC-D. Through the methods of experimental factorial design and surfaceresponse followed by graphical optimization it was possible to determine the optimum operating condition to achieve both maximum biomass and RTS as well as and lowest possible values of CIM. The validity of the proposed model was verified and confirmed. This is the first study on the optimization of culture conditions for the production of antimicrobial metabolites by P. polymyxa RNC-D, and constitutes an important step in the development of strategies to modulate the production of antimicrobial molecules by this microorganism in elevated levels. Novel antimicrobial compounds were isolated from the fermentation broth of P. polymyxa RNC-D, here named total extract (TE). It was possible to verify the presence of lipopeptide and peptide active compounds through enzymatic assays made with ET. Total extract was subjected to a two-phase system, resulting in lipopeptide extract (LPE) and aqueous fraction (AF). According to the results of bioassays, LPE has broad-spectrum activity against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi. The mass spectrometry analysis of PLA revealed the existence of a novel compound that was named polycerradin. The purification of a novel antimicrobial peptide (AMP) from the AF was carried out by using chromatography. The compound was active against Gram-negative bacteria. Nterminal analysis determined the amino acid sequence, as well as MS / MS analysis confirmed the primary structure of this new compound. This research reports firstly the production of PAM PpRNCD that has an unusual amino acid in its constitution. It is an unprecedented fact considering the bacterial specie P. polymyxa. In terms of molecule size, PAM PpRNCD can be considered one of the smallest active natural peptide reported to date. It was also possible to isolate from FA the depsipeptides IL-F04a (m/z 883), LI-F04b (m/z 897), LI-F03a (m/z 947) and LI-F03b (m/z 961) previously described in the literature. The photoluminescence study of the LPE, TE, AF in both at room temperature (RT) and low temperature (T = 8K) was performed. In addition, this technique was applied to evaluate the action of the ELP on Staphylococcus aureus ATCC 29213, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 29212, Shigella sonnei ATCC 1578 and Candida albicans ATCC 10231 in two different situations: (a) immediately after mixing LPE with the bacterial and fungus cell suspension, and (b) after thirty minutes. The photoluminescence emission was collected by a triple spectrometer (three diffraction gratings) T64000 model from Jobin Yvon, equipped with an optical microscope. For the detection of the radiation emitted by the sample we used a CCD camera (charge coupled device) cooled by liquid nitrogen. The slits of the spectrometer were adjusted to produce a spectral resolution of the order of 10-4 nm. The excitation source used was the line of 457 nm (violet) from an argon laser. The behaviors here observed indicate a strong potential for applications in biosensors as well as molecular markers. / Através do estudo de variáveis do cultivo pretendeu-se aumentar a produção de metabólitos antimicrobianos por Paenibacillus polymyxa RNC-D. Duas variáveis do processo - glicose e concentração de inóculo - foram avaliadas em diferentes níveis e seus efeitos na formação de biomassa, concentração inibitória mínima (CIM) contra Escherichia coli e redução na tensão superficial (RTS) foram estudados. Utilizando parâmetros não-otimizados as variáveis dependentes biomassa, CIM e RTS atingiram valores de 0,6 g/l, 1.000,0 μg/ml e 18,4 mN/m, respectivamente. As concentrações ótimas de glicose (16 g/l) e inóculo (5,0% v/v) foram definidas no sentido de maximizar a formação de biomassa e RTS do extrato, bem como diminuir o valor de CIM do extrato. Experimentalmente 2,05 g/l de biomassa; 31,2 μg/ml de CIM e 10,7 mN/m de RTS foram obtidos sob condições otimizadas. Foi constatado que altas concentrações do substrato glicose, embora refletissem em aumento de biomassa bacteriana, inibiram o metabolismo secundário microbiano, resultando em baixa produção de biomoléculas associada a altos valores de CIM. Através dos métodos de design fatorial experimental e superfície-resposta seguidos por otimização gráfica foi possível determinar a condição operacional ótima das concentrações iniciais de glicose e inóculo, as quais se demonstraram como variáveis de grande influência na produção de metabólitos antimicrobianos por P. polymyxa RNC-D. O extrato total (ET), proveniente do caldo de fermentação de P. polymyxa RNC-D, foi utilizado para pesquisa e isolamento de novos compostos antimicrobianos. Através de ensaios enzimáticos feitos com ET foi possível verificar a natureza lipopeptídica e peptídica dos compostos antimicrobianos. O ET foi submetido a um sistema de duas fases, separandose então em extrato lipopeptídico (ELP) e fração aquosa (FA). Resultados de bioensaios revelaram que o ELP apresenta amplo espectro de atividade contra bactérias Grampositivas, Gram-negativas e fungo. A análise por espectrometria de massas de ELP revelou a presença de um composto peptídico inédito o qual foi denominado polycerradin. A partir da fração aquosa (FA) foi possível a purificação de um novo peptídeo antimicrobiano (PAM) através de etapas cromatográficas. A bioatividade do composto foi avaliada e confirmada frente às bactérias Gram-negativas. A determinação da sequência de aminoácidos foi realizada por análise do N-terminal, e a confirmação da estrutura primária deste novo composto foi feita por MS/MS. O presente estudo relata pela primeira vez a produção do PAM PpRNCD que possui um aminoácido não usual em sua constituição, relato primeiramente aqui descrito considerando-se a espécie bacteriana P. polymyxa. Em termos de tamanho de molécula, pode-se considerar que o PAM PpRNCD é um dos menores peptídeos naturais ativos relatados até o momento. Utilizando-se a FA também foi possível o isolamento dos depsipeptídeos LI-F04a (m/z 883), LI-F04b (m/z 897), LI-F03a (m/z 947) e LI-F03b (m/z 961) previamente descritos na literatura. O estudo da fotoluminescência do ELP, do ET e da FA foi realizado tanto em temperatura ambiente (RT) quanto em baixa temperatura (T=8K). Também se estudou, através desta técnica, a ação do ELP sobre as bactérias Staphylococcus aureus ATCC 29213, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 29212, Shigella sonnei ATCC 1578 e fungo Candida albicans ATCC 10231 em duas situações: (a) imediatamente após a mistura do ELP com a suspensão celular bacteriana, e (b) trinta minutos após a mistura. Detectou-se emissão fotoluminescente por ELP, ET e FA, e sinais de Raman a λ 699 nm (FA a baixa temperatura). Decorridos 30 min da mistura do ELP com as suspensões celulares microbianas houve alteração na emissão fotoluminescente, sendo que alguns sinais foram suprimidos (λ 470, 480 e 700 nm para S. sonnei, por exemplo). Isto evidencia a potencial aplicação destas frações (ELP, ET e FA) para a fabricação de sensores, detectores e marcadores moleculares.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica utilizada como biopesticida contra insetos, principalmente Lepidoptera, Coleoptera e Diptera, e na produção de organismos geneticamente modificados. Com a descoberta da capacidade de Bt se movimentar sistemicamente em plantas, potencialmente atingindo insetos sugadores, surge uma nova possibilidade para o controle de Diaphorina citri Kuwayama, que transmite bactérias associadas ao Huanglongbing, uma séria doença da citricultura. O objetivo do trabalho foi desenvolver sistemas de aquisição de Bt por D. citri, in vitro e in planta, para estudos de patogenicidade. Uma estirpe de Bt transformada com o gene green fluorescent protein (Btk-gfp), cultivada em meio NYSM, foi usada como marcador de aquisição pelo inseto e movimentação nas plantas. Para o sistema de aquisição in vitro, selecionaram-se dietas com base na sobrevivência e atividade alimentar de D. citri. Btk-gfp foi adicionada à dieta selecionada, composta por uma solução de sacarose a 30% em água mineral com corantes alimentícios (verde 0,1% e amarelo 0,4%). A dieta foi acondicionada em um sachê formado por duas membranas de Parafilm®, sobre a parte inferior de uma placa de Petri de 40 mm de diâmetro (gaiola de alimentação). Dez insetos foram confinados em cada gaiola para períodos de acesso à aquisição (PAA) de até 48 h, estabelecendo-se 10 gaiolas por tratamento; como controle, utilizou-se a dieta sem Btk-gfp. Para testes de aquisição in planta, suspensões de Btk-gfp foram inoculadas em ramos novos cortados e no solo, próximo à haste de seedlings de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de murta [Murraya paniculata (L.) Jack], e em diferentes concentrações, avaliando-se a movimentação da bactéria após um período de 48 h. Posteriormente, adultos e ninfas de D. citri foram confinados nestas plantas para avaliar a aquisição de Btk-gfp, usando-se plantas inoculadas apenas com água como controle. Para os bioensaios de patogenicidade a D. citri, 21 estirpes de Bt foram testadas no sistema de aquisição em ramos cortados de murta e 5 estirpes em ramos cortados de laranja para ninfas de 3º. ínstar. In vitro, testaram-se 3 estirpes contra ninfas de 3º. ínstar e 9 contra adultos. Btgfp foi absorvido pelas raízes e ramos novos cortados de seedlings de laranja doce e de murta, e translocado até as folhas, mostrando movimentação sistêmica. Esta estirpe foi adquirida por adultos e ninfas de D. citri que se alimentaram nos ramos novos cortados, mantidos em suspensão bacteriana. O sistema de alimentação in vitro permitiu a aquisição de Bt-gfp (pellet ressuspendido na dieta de sacarose com corantes) por adultos de D. citri com apenas 12 h de PAA, mas 30 h é um período ótimo para exposição do inseto ao sistema. Nenhuma das nove estirpes testadas no sistema in vitro foi patogênica aos adultos de D. citri. Das 21 estirpes testadas contra ninfas de 3º. ínstar em ramos novos de murta, cinco causaram mortalidade de 24 a 45%, em 5 dias. Essas cinco estirpes também foram testadas contra ninfas dem ramos de citros cortados, causando mortalidade de 35 a 75% em 48 h. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium widely used as a biopesticide against insect pests, mainly Coleoptera, Lepidoptera and Diptera, or for engineering genetically-modified plants. The recent finding that Bt is able to move systemically within plants, potentially targeting piercing-sucking insects, suggests that the bacterium may be effective for microbial control of Diaphorina citri Kuwayama, the vector of Huanglongbing-associated bacteria, a serious citrus disease. The goal of this research was to develop in vitro and in planta acquisition systems of Bt by D. citri for pathogenicity assays. A transformed Bt strain with the green fluorescent protein gene (Btk-gfp), grown in NYSM medium, was used as a marker to demonstrate bacterial acquisition by the insect and movement within the plants. Artificial diets were selected for the in vitro acquisition system based on insect survival and feeding activity. Btk-gfp was added to the selected diet, a 30% sucrose solution in mineral water with green (0.1%) and yellow (0.4%) food coloring. The diet was placed inside a Parafilm® membrane sachet, covering the opening of the lower half of a 40-mm diameter culture plate, and forming the feeding cage. Ten D. citri adults or nymphs were introduced in each cage and allowed acquisition access periods (AAP) of up to 48 h on the diet; as a control, a diet without Btk-gfp was used. For testing the in planta acquisition system, Btk-gfp suspensions were inoculated in young stem cuttings or in the soil, near the stem of Citrus sinensis (L.) Osbeck and Murraya paniculata (L.) Jack seedlings, as well as in different concentrations, and bacterial movement was assessed after 48 h; plants inoculated with water were used as controls. D. citri adults and nymphs were confined on inoculated plants to verify Btk-gfp acquisition. In pathogenicity assays, 21 Bt strains were tested against 3rd instars of D. citri using the acquisition system with stem cuttings of M. paniculata and 5 strains were tested using citrus stem cuttings. The in vitro acquisition system was used to test pathogenicity of 3 and 9 Bt strains against 3rd-instar nymphs and adults, respectively. Bt-gfp absorbed by roots or young stem cuttings of inoculated C. sinensis and M. paniculata was detected in the leaves, showing systemic movement. Bt-gfp was isolated from groups of nymphs and adults that were fed on inoculated stem cuttings or on artificial diets with bacterial suspension, showing that both in planta and in vitro acquisition take place. D. citri adults can acquire Bt-gfp within 12 h of AAP to the artificial diet with bacterium inoculum, but 30 h is the optimum AAP. None of the nine Bt strains assayed in vitro were pathogenic to D. citri adults. Of 21 strains tested for pathogenicity against nymphs using inoculated stem cuttings of M. paniculata, five caused mortality rates varying from 24 to 45% mortality within 5 days. These five Bt strains were also tested against D. citri nymphs using young stem cuttings of C. sinensis, causing mortality rates of 35 to 75% within 48 h.

Foram realizados testes de toxicidade ao longo de dois anos, com amostras de água e sedimento do rio Corumbataí, entre Novembro de 2004 e Setembro de 2006, com o objetivo de avaliar a qualidade da água e do sedimento. Os testes de toxicidade aguda realizados com os organismos Chironomus xanthus, Daphnia magna, Hydra attenuata, Lactuca sativa e Pseudokirchneriella subcapitata indicaram variados graus de toxicidade nos diferentes pontos de coleta do rio Corumbataí, com maior ocorrência de toxicidade nos pontos de coleta mais próximos à foz do rio, principalmente devido à afluência do Ribeirão Claro. Todas as amostras de sedimento se mostraram mais tóxicas do que as amostras de água dos mesmos locais, para todos os organismos utilizados, em todas as coletas realizadas. Para todos os organismos, foram realizados testes de sensibilidade, com substância de referência (NaCl), mensalmente, a fim de garantir a qualidade dos cultivos em laboratório e dos bioensaios realizados, com resultados regulares e satisfatórios. Os efeitos produzidos pelas amostras ambientais sobre as sementes de alface (Lactuca sativa) foram bastante variáveis e irregulares, não possibilitando os cálculos de CI50. Decidiu-se por bem suspender a realização deste teste após um ano. Dentre todos os endpoints avaliados, os dos testes de Hydra attenuata e Pseudokirchneriella subcapitata se mostraram mais sensíveis, e o de Daphnia magna o menos sensível às amostras testadas. A avaliação da toxicidade através de efeitos subletais em H. attenuata se mostrou um bom parâmetro de avaliação das condições ambientais do rio Corumbataí, sendo um dos endpoints mais sensíveis utilizados. Outros testes de toxicidade foram realizados em algumas das oito coletas realizadas neste estudo, em caráter complementar: teste de toxicidade crônica com D. magna, teste de toxicidade LuminoTox, que utiliza sistemas enzimáticos vegetais, e o teste de genotoxicidade com Allium cepa, com o objetivo de avaliar suas sensibilidades e contribuições ao estudo. Estes bioensaios adicionaram informações a respeito dos níveis de poluição e toxicidade do rio Corumbataí, contribuindo com os bioensaios principais. Informações como parâmetros físicos e químicos, quantificação de elementos químicos e herbicidas ofereceram subsídios para a interpretação dos resultados obtidos com os testes de toxicidade. São apresentados também resultados das atividades referentes ao estágio de doutorado realizado no exterior (doutorado-sanduíche), no período de Setembro a Dezembro de 2007, na agência de proteção ambiental Environment Canada, no qual foi aplicado um teste de toxicidade com linhagens microbianas (MARA assay) em amostras de água e sedimento, juntamente com nanomateriais / Toxicity tests were conducted for two years with water and sediment samples from Corumbataí River, between November 2004 and September 2006, in order to assess the water and sediment quality. Acute toxicity tests conducted with Chironomus xanthus, Daphnia magna, Hydra attenuata, Lactuca sativa and Pseudokirchneriella subcapitata showed varying degrees of toxicity along the river course, with more toxic results in the sampling sites near the river mouth, due mainly to the inflow of Ribeirão Claro. All sediment samples were more toxic than the water samples (from the corresponding sites), for all test organisms, and for all samplings. Sensitivity tests were performed monthly, with NaCl as the reference toxicant, in order to guarantee both the laboratory culture quality and the bioassays conducted with these organisms. Results with NaCl were regular and satisfactory. The effects of the samples on lettuce seeds (L. sativa) were irregular, thus not allowing the estimative of IC50. It was decided to suspend the performance of this bioassay after one year of testing. Among all studied tests and endpoints, the tests with H. attenuata and P. subcapitata had the most sensitive endpoints, and the acute toxicity test with D. magna had the less sensitive one. Toxicity assessment of Corumbataí River based on Hydra sub-lethality endpoint was one of the most sensitive among the tested ones. Other bioassays were conducted at least once as part of this study, as a complementary assessment: the 21-day chronic toxicity test with D. magna, the LuminoTox bioassay, and the genotoxicity test with Allium cepa, in order to assess their sensitivity and contribution to the present study. These bioassays added information about the contamination levels and toxicity of Corumbataí River, contributing with the main bioassays performed. Data such as physical and chemical parameters, metals and herbicides determinations had a contribution to bioassay results interpretation. Results from a research project developed during a four-month stay (from September 2007 to December 2007) at Environment Canada Protection Agency are further described, regarding the application of the MARA bioassay, (conducted with 11 microbial strains), testing water and sediment samples, along with nanomaterials