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Purificação e caracterização da lacase do fungo Trametes cubensis (Mont.) Sacc. 1891Damasceno, Andrey Azedo, 92-99233-2173 27 May 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016-05-27 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The following interest in fungal enzymes comes about their potential for industrial use, as well as biotechnological research. In this context, the enzyme laccase (EC 1.10.3.2) stand out by its potential use in several industrial applications. Thus, the main goal of this research was to characterize the laccase enzyme produced by the Amazonian fungus Trametes cubensis. The T. cubensis strain was collected in Tefé National Forest (FLONA) and the enzymatic activity was determined from the submerged and semi-solid fermentation. As substrate, sawdust of the wood of Simarouba amara and sugarcane bagasse was tested. As inductors, copper sulfate, “ABTS” and mineral medium were used. The laccase was purified by means of ion exchange chromotography and characterized by mass (SDS-PAGE and zymogram) and determined kinetic parameters Km and Vmax. The most expressive laccase activity occurred in the medium with substrate of Simarouba amara (marupá) with 184 U / mL. The yield was 40% and purification factor of 1.5, with Vmax and Km of 33.33 μmol.L-1 6.66 mM, respectively. The becoming laccase from Trametes cubensis has an apparent molecular mass of approximately 40 kDa. In this way, from the cultivation of Trametes cubensis, it is possible to obtain laccases, however, the study is still necessary in reference the use of different inductors, looking for a potentialization of this activity. / O crescente interesse pelas enzimas fúngicas vem em função da sua potencialidade para uso industrial, bem como na pesquisa biotecnológica. Neste contexto, a enzima lacase (EC 1.10.3.2) destaca-se pelo seu potencial uso em diversas aplicabilidades industriais. Assim, o objetivo dessa pesquisa foi caracterizar a enzima lacase produzida pelo fungo amazônico Trametes cubensis. A cepa de T. cubensis foi coletada na Floresta Nacional de Tefé (FLONA) e determinada a atividade enzimática a partir da fermentação submersa e semi-sólida. Como substrato testou-se serragem da madeira de Simarouba amara e bagaço-de-cana de açúcar. Como indutores utilizou-se sulfato de cobre, ABTS e meio mineral. A lacase foi purificada por meio de cromotografia de troca iônica e caracterizada quanto à massa (SDS-PAGE e zimograma) e determinados os parâmetros cinéticos Km e Vmax. A atividade de lacase mais expressiva ocorreu no meio com substrato de Simarouba amara (marupá) com 184 U/mL. O rendimento foi de 40% e fator de purificação de 1,5, com Vmax e Km de 33,33 μmol.L-1 6,66 mM, respectivamente. A lacase proveniente de Trametes cubensis apresenta massa molecular aparente de, aproximadamente, 40 kDa. Nesse sentido, a partir do cultivo de Trametes cubensis é possível obter lacases, contudo, estudos ainda são necessários no que se refere ao uso de diferentes indutores, visando uma potencialização dessa atividade.
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O design de mobiliário para valorização dos resíduos de madeiras amazônicasPereira, Helder Alexandre Amorim, 92-99116-6733 15 March 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-03-15 / This study proposes a methodological process (systematization) for the utilization of tailings from the productive process of the wood industry (logs with hollows, cracks, malformation, etc.). Nowadays, the management and processing of wood logs are important variables for this operation within the wood industry of Amazon, however, the productive process, coupled with strict quality criteria imposed by the market, especially the international market, contributes for the generation of waste that can cause environmental impacts if no viable and environmentally friendly alternatives for disposal are found. In this case, the waste generated by sawmills is generally used in boilers for the production of electric energy, or for the production of boards and panels. Therefore, investigations on ways to use these residues are important, through which the value attributed to the discarded raw material, mostly noble wood and in relative big amount can be used for the development of products with differentiated and competitive design. The methodology used for the research was based on a study of the literature on the wood and furniture markets, productive processes, methodology in Design for the development of furniture, as well as a case study with Precious Woods Amazon which concentrates its activities on certified forest management (scope of certification), located between the municipalities of Itacoatiara, Silves and Itapiranga in the State of Amazon, Brazil. The study stages for the elaboration of the systematic involved a pre-selection of the raw material up to its processing for the manufacture of residential furniture, activities that accumulate significant waste of wood. The validation of the results came from a Focus Group (workshop) with professionals in the areas of Forestry Engineering, Design and Furniture Industry. The products developed within the study were evaluated by experts as being of great ecological appeal, with current and differentiated style that reflects a high commercial and economic viability identity that values the wood of the Amazon. With the results of this methodological process, it was possible to elaborate a systematic for the use of wood residues / Este estudo propõe um processo metodológico (sistematização) para o aproveitamento dos rejeitos do processo produtivo de Madeireiras (troncos com presença de oco, rachaduras, má formação e etc.). O manejo e o processamento das toras de madeiras na Amazônia brasileira atualmente são variáveis importantes para o gerenciamento da produção das mesmas, no entanto, o processo produtivo aliado aos critérios rígidos de qualidade impostos pelo mercado, principalmente o internacional, contribui para a geração de resíduos que podem ocasionar impactos ambientais se não encontradas alternativas viáveis e ecológicas para o descarte. Nesse caso, o aproveitamento dos resíduos pelas serrarias é geralmente utilizado em caldeiras para a produção de energia elétrica, ou ainda, para a produção de chapas e painéis. Assim sendo, importam investigações sobre formas de aproveitamento desses resíduos, em que o valor atribuído à matéria-prima descartada, em sua maioria madeira nobre e em relativa quantidade, possa ser aproveitada para o desenvolvimento de produtos com Design diferenciado e competitivo. A metodologia utilizada para a pesquisa partiu de uma revisão da literatura sobre os mercados madeireiros e de móveis, processos produtivos, revisão sobre metodologia em Design para o desenvolvimento de móveis, bem como um estudo de caso com a Mil Madeireiras, que concentra suas atividades no manejo florestal certificado (escopo da certificação), localizada entre os municípios de Itacoatiara, Silves e Itapiranga no Estado do Amazonas, Brasil. As etapas de estudo para a elaboração da sistemática envolveram uma pré-seleção da matéria-prima até o seu beneficiamento para a manufatura de móveis residenciais, atividades que acumulam perdas significativas de madeira. A validação dos resultados partiu de um Grupo Focal (workshop) com profissionais das áreas da Engenharia Florestal, Design e Indústria de Móveis. Os produtos desenvolvidos com o estudo foram avaliados por especialistas como sendo de grande apelo ecológico, com estilo atual e diferenciado que reflete uma identidade de alto nível comercial e de viabilidade econômica que valoriza as madeiras da Amazônia. Com os resultados desse processo metodológico, foi possível elaborar uma sistemática para o aproveitamento dos resíduos madeireiros.
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Detecção de Escherichia coli enterotoxigênica por anticorpos anti-EtpA ligados a nanopartículas magnéticasAstolpho, Helber Abellini, 92-98245-3930 17 April 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-04-17 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Diarrheal diseases account for the second leading cause of death in children underfive years of age, below only pneumonia, killing about 760,000 children per year. The enterotoxigenic E. coli (ETEC) lineage is considered to be one of the most frequent causative agents of childhood diarrhea and travelers' diarrhea in low and middle-income countries. Among the virulence factors secreted by ETEC, the exoprotein EtpA has been described as an important protein that interacts with the highly conserved regions of the bacterial flagellum. These interactions are critical for adhesion, colonization, and delivery of toxins to enterocytes by ETEC. A new detection tool for enterotoxigenic E. coli bacteria was developed in the present work. Initially, the best antigenic sequence of the chimeric EtpA protein was determined by in silico prediction assays. After the construction of the recombinant antigen, we evaluated the production of anti-EtpA polyclonal antibodies in mice that were stimulated with this antigen. The mapping of epitopes using synthetic peptides demonstrated that only the 1.1 peptide was reactive to the pool of sera from the immunized animals. Specific recognition of anti-EtpA antibodies were assessed by flow cytometry. The results showed that the developed antibody was able to recognize the native EtpA protein. The evaluation of the specificity of anti-EtpA antibodies against different strains of diarrheogenic E. coli demonstrated the highest percentage and specificity for the ETEC strain (7.2%). The antibodies were then coupled into magnetic beads for the capture and detection of ETEC isolates. The results by cytometry showed high sensitivity, specificity and the efficacy of the method of separation and detection of these pathogens by magnetic beads bound to anti-EtpA antibodies. / As doenças diarreicas totalizam a segunda principal causa de morte em crianças menores de cinco anos de idade, perdendo apenas para a pneumonia. A cada ano a diarreia mata cerca de 760.000 crianças nessa faixa etária. A linhagem de E. coli enterotoxigênica (ETEC) é considerada como um dos agentes causadores mais frequentes da diarreia infantil e da diarreia dos viajantes nos países de baixa e média renda. Dentre os fatores de virulência secretados por ETEC, a exoproteína EtpA foi descrita como uma importante proteína que se interage com as regiões altamente conservadas do flagelo bacteriano. Essas interações são críticas para a adesão, colonização e entrega das toxinas nos enterócitos por ETEC. Foi desenvolvido no presente trabalho uma nova ferramenta de detecção para a bactéria E. coli enterotoxigênica. Inicialmente foi determinado a melhor sequência antigênica da proteína quimérica EtpA por ensaios de predição in silico. Após a construção do antígeno recombinante, avaliamos a produção de anticorpos policlonais anti-EtpA em camundongos que foram estimulados com esse antígeno. O mapeamento de epítopos utilizando peptídeos sintéticos demonstrou que apenas o peptídeo 1.1 foi reativo ao pool de soros dos animais imunizados. O reconhecimento específico dos anticorpos anti-EtpA foram avaliados por citometria de fluxo. Os resultados mostraram que o anticorpo desenvolvido foi capaz de reconhecer a proteína EtpA nativa. A avaliação da especificidade dos anticorpos anti-EtpA contra diferentes cepas de E. coli diarreiogênicas demonstrou a maior porcentagem e especificidade para um isolado de ETEC (7.2%). Em seguida, os anticorpos foram acoplados em beads magnéticas para a captura e detecção de isolados de ETEC. Os resultados por citometria evidenciaram alta sensibilidade, especificidade e a eficácia do método de separação e detecção desses patógenos por beads magnéticas ligadas aos anticorpos anti-EtpA.
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Variabilidade genética dos principais fatores de virulência em amostras Clínicas de Shigella flexneriDantas, Paloma Inessa de Souza, 92-99235-3226 18 November 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016-11-18 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Shigella is a gram-negative and intracellular bacterium responsible for triggering Shigellosis, a diarrheal disease characterized by the presence of mucus and blood. . In an epidemiological study conducted by our group in the city of Manaus-Amazonas with children with severe diarrhea from 2007 to 2009, the genus Shigella was the fifth most isolated pathogen (2.2%). Based on the clinical data we observed a heterogenous symptomatology among patients with shigellosis, since then, our group has been investigating the genotypic and phenotypic characteristics of these isolates. Shigella is a highly virulent bacterium, its mechanisms of pathogenesis is due to the presence of plasmidial and chromosomal genes. Among the genes responsible for its virulence are the Ipas genes that promote the invasion of Shigella in epithelial cells and the death of macrophages, the IpaHs genes, which modulate the host's immune response and the enterotoxins Shet1 and Shet2. In the present study, our main objective was to verify the genetic variability of the main virulence factors in clinical samples of Shigella flexneri. The virulence genes were amplified with specific primers developed in the study, the obtained amplicons were sequenced and analyzed. The Ipa, IpaH, Set1A, Se1B and Sen genes were successfully amplified. A total of 474 sequences referring to the 19 virulence genes of Shigella were sequenced, however, only 12 genes, a total of 154 sequences were analyzed for the presence of polymorphism. In this study 9 point mutations were identified in 5 Shigella virulence genes, being the IpaD, SenA, IpaH3, IpaH2.5 and IpaH6 gene. The study of the identification of specific genetic determinants is essential to understand the mechanism of pathogenesis and the propagation of virulent variants in the population of Shigella. Our work is based on previous studies conducted by our group, since the initial amplification of the virulence genes of these isolates was ineffective. Although few genes are analyzed, nucleotide variations have been found in different isolates, which may or may not interfere in the expression of the virulence phenotype. A new sequencing will be required to confirm the variations found in the study, as well as in vitro and in vivo studies, to verify if these changes may interfere with the virulence phenotype of the Shigella clinical samples. / A Shigella é uma bactéria gram-negativa e intracelular, responsável pelo desencadeamento da Shigelose, uma doença diarreica caracterizada pela presença de muco e sangue. Em um estudo epidemiológico realizado por nosso grupo na cidade de Manaus-Amazonas com crianças que apresentavam diarreia severa nos anos de 2007 a 2009, o gênero Shigella foi o quinto patógeno mais isolado (2,2%). A partir dos dados clínicos observamos uma sintomatologia heterogênia entre os pacientes com shigelose, desde então, nosso grupo vem investigando as características genotípicas e fenotípicas desses isolados. Shigella é uma bactéria altamente virulenta, seus mecanismos de patogenicidade se deve a presença de genes plasmidiais e cromossomais. Entre os genes responsáveis pela sua virulência temos, os genes Ipas que promovem a invasão de Shigella nas células epiteliais e a morte dos macrófagos, os genes IpaHs, que modulam a resposta imunológica do hospedeiro e as enterotoxinas Shet1 e Shet2. No presente estudo, nosso principal objetivo foi verificar a variabilidade genética dos principais fatores de virulência em amostras clínicas de Shigella flexneri. Os genes de virulência foram amplificados com iniciadores específicos desenvolvidos no estudo, os amplicons obtidos foram sequenciados e analisados. Os genes Ipa, IpaH, Set1A, Se1B e Sen foram amplificados com sucesso. Um total de 474 sequências referentes aos 19 genes de virulência de Shigella foi sequenciado, no entanto, apenas 12 genes, num total de 154 sequências foram analisadas quanto à presença de polimorfismo. Neste estudo foram identificadas 9 mutações de ponto em 5 genes de virulência de Shigella, sendo eles, o gene IpaD, SenA, IpaH3, IpaH2.5 e IpaH6. O estudo da identificação de determinantes genéticos específicos é essencial para compreender o mecanismo de patogênese e a propagação de variantes virulentas na população de Shigella. Nosso trabalho se baseia em estudos anteriores realizados por nosso grupo, uma vez que a amplificação inicial dos genes de virulência desses isolados foi ineficaz. Apesar de poucos genes serem analisados, variações de nucleotídeos foram encontradas em isolados diferentes, que podem interferir na expressão do fenótipo de virulência. Um novo sequenciamento será necessário para confirmar as variações encontradas no estudo, assim como estudos in vitro e in vivo, para verificar se essas alterações podem interferir no fenótipo de virulência das amostras clinicas de Shigella.
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Estudo da microbiota da rizosfera do guaranazeiro (Paullinia cupana Kunth var.sorbilis (Mart.) Ducke) pelo sequenciamento do gene 16S rDNACarvalho, Elen Bethleen de Souza, 92-99187-9362 26 June 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-06-26 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The production of guarana in the Amazon region faces unfavorable phytosanitary conditions due to the presence of anthracnose, a disease caused by Colletotrichum spp. Taking into account the existing dynamics in plant-microorganism interaction took place this study to identify and verify the wealth and bacterial diversity associated with the rhizosphere of guarana with and without symptoms of antracnose. April 2011 were collected at the Fazenda da AMBEV located in Maués-AM district, guarana the rhizospheres with and without symptoms of antracnose. To extraction of genomic total DNA of bacteria uncultured present in the rhizosphere of guarana with symptoms of the disease and asymptomatic. The bacteria were identified by sequencing the 16S rDNA gene using as molecular tool the pyrosequencing and bioinformatics resources. The results indicate that the rhizosphere Sound guarana is richer and diverse in relation to the patient guarana. The predominant Filo was the Bacteroidetes in both physiological conditions of guarana, followed by Proteobacteria, Actinobacteria and Acidobactérias. The predominant genera accessed in the rhizosphere of the patient guarana were Chryseobacterium, Flavobacterium, Pedobacter, Sphingobacterium and healthy plants were represented by Rhizomicrobium, Acidicaldus, Sphingomonas and Rhodoplanes.Os common genres will rhizosphere of sick and healthy guarana were represented by Pseudomonas, Taibaiella, Mucilaginibacter, Candidatus Koribacter, Granulicella and Acidothermus.The presence of Colletotrichum spp appears to influence the composition of the microbiota rhizosphere of guarana. / A produção do guaraná na Região Amazônica enfrenta condições fitossanitárias desfavoráveis devido à presença da antracnose, uma doença causada pelo fungo Colletotrichum spp. Levando em consideração a dinâmica existente na interação planta-microrganismos realizou-se este estudo para identificar e verificar a riqueza e diversidade bacteriana associada à rizosfera de guaranazeiros com e sem sintomas da antracnose.Em Abril de 2011, foram coletadas na Fazenda da AMBEV, localizada no município de Maués-AM, rizosferas do guaranazeiro com e sem sintomas da antracnose. Realizou-se a extração do DNA genômico total das bactérias não cultiváveis presentes na rizosfera do guaranazeiro que apresentavam sintomas da doença e das assintomáticas.As bactérias foram identificadas por meio do sequenciamento do gene 16S rDNA utilizando-se como ferramenta molecular o pirosequenciamento e os recursos da bioinformática. Os resultados obtidos indicam que a rizosfera do guaranazeiro sadio é mais rica e diversa em relação ao guaranazeiro doente.O Filo predominante foi o Bacteroidetes nas duas condições fisiológicas do guaranazeiro, seguido das Proteobactérias, Acidobactérias e Actinobactérias. Os gêneros predominantes acessados na rizosfera do guaranazeiro doente foram as Chryseobacterium, Flavobacterium, Pedobacter, Sphingobacterium e em plantas sadias foram representados pelos Rhizomicrobium, Acidicaldus, Sphingomonas e Rhodoplanes.Os gêneros comuns á rizosfera do guaranazeiro doente e sadio foram representadas pelas Pseudomonas, Taibaiella, Mucilaginibacter, Candidatus Koribacter, Granulicella e Acidothermus. A presença do fungo Colletotrichum spp parece influenciar na composição da microbiota da rizosfera do guaranazeiro.
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Cogumelos da Amazônia como fonte de protease para aplicação na indústria de queijoMartim, Salomão Rocha, 92-99138-7544 30 June 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-06-30 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The increase in world cheese production, the scarcity of animal rennet, associated with the
rejection of genetically modified proteases, encourages the search for new sources of milkclotting
enzymes. Among fungi, edible mushrooms have stood out as alternative sources of
peptidases that can be used as milk-clotting. This research aimed to evaluate the synthesis of
proteases by six edible mushrooms from DPUA Culture Collection and select a milk-clotting
producer species with physicochemical characteristics for cheese production. The submerged
fermentation was carried out in GYP medium (glucose, yeast extract and peptone) with 0.5%
(w/v) of gelatine. The edible mushroom that produced proteases with higher coagulant ratio in
the liquid medium was cultivated in Amazon agroindustrial wastes as substrate: angelim
sawdust, cupuaçu, exocarp of tucumã, banana leaf and açai seeds, supplemented with rice bran.
The proteolytic activity was determined using 1% (w/v) of azocasein as substrate and the
determinination of milk-clotting activity was used 10% (w/v) of skimmed milk solution as
substrate. Some parameters were used to evaluate the influence of milk-clotting enzymes
production (pH of the culture medium, fermentation time, size and age of the inoculum). The
enzymes were characterized according to optimums pH and temperature, pH and temperature
stabilities, and effect of metallic ions and inhibitors. The cytotoxic effect of the selected
mushroom crude extract was evaluated in human MRC-5 fibroblast. The analysis of centesimal
and microbiological composition was determined in the elaborated cheese. In submerged
fermentation conditions, Pleurotus albidus was the best protease producer (34.00 U/mL) and
the synthesis of theses enzymes were stimulated by culture age (10 days) e inoculum volume
[5% (p/v)]. The enzymes showed optimum activities at pH 5 and 60°C, with stabilies at pH 5
to 8 and 30°C to 60°C, being classified as cysteine and serine proteases. The milk-clotting
enzymes from Pleurotus albidus expressed the highest coagulant ratio (21.60) with maximum
activity at 60 °C and pH 6. Iodoacetic acid was the inhibitor of higher action in the proteolytic
activity suggesting the presence of cysteine proteases. Pleurotus albidus milk-clotting enzymes
showed no toxicity against human fibroblasts (MRC5). In the solid fermentation, Pleurotus
albidus presented high enzyme production in the mixture composed by açai seeds and rice bran
(90:10, w/w). The milk-clotting enzymes demonstrated coagulant ratio of 14.58, abundant whey
formation and strong coagulation in milk solution. The best conditions to milk-clotting enzymes
production were: inoculum with 10 days of age, culture medium at pH 6 and inoculum size of
2.5% (p/v). The enzymes exhibited maximum catalytic activity at pH 5 and 55 ° C with stability
until 45°C. They were completely inhibited by iodoacetic acid. The cheese produced with
Pleurotus albidus milk-clotting enzymes as coagulant agent demonstrated contents of moisture,
lipid and protein of 55%, 20% and 18%, respectively. The microbiological analysis showed that
the cheese was under the standards required by Brazilian legislation. Pleurotus albidus is a
potential source of coagulant that can be applied in dairy industry, especially in the manufacture
of cheese. / O aumento da produção mundial de queijos, a escassez do coalho animal e a rejeição de
proteases geneticamente modificadas, incentiva a busca por novas fontes de coagulantes do
leite. Dentre os fungos, os cogumelos têm se destacado como fonte alternativa de peptidases
coagulantes para aplicação na indústria de laticínios. Esta pesquisa teve como objetivo avaliar
a síntese de proteases por seis cogumelos do acervo da Coleção de Culturas DPUA para
selecionar uma espécie produtora de coagulante com características físico-químicas para
elaboração de queijo. A fermentação em meio líquido foi realizada em GYP [(20 g de glicose,
5 g de extrato de levedura, 15 g de peptona/1000 mL de água)], com 0,5 % de gelatina (p/v). O
macrofungo produtor de proteases com elevada razão coagulante, em meio líquido, foi
cultivado em resíduos lignocelulósicos amazônicos: serragem de angelim, exocarpos de
cupuaçu e tucumã, engaço de banana e semente de açaí, suplementados com farelo de arroz. As
atividades proteolítica e coagulante foram determinadas utilizando como substratos azocaseína
1% (p/v) e leite desnatado em pó a 10% (p/v), respectivamente. Os parâmetros que influenciam
a produção de coagulantes (pH do meio de cultivo, tempo de fermentação, tamanho e idade do
inóculo) foram avaliados. O coagulante foi caracterizado quanto ao pH e temperatura ótimos,
estabilidade ao pH e à temperatura, e efeito de íons metálicos e inibidores. A citotoxicidade do
coagulante foi avaliada em fibroblastos humanos MRC-5. No queijo elaborado com o
coagulante foi determinada a composição centesimal e a microbiológica. Na fermentação
submersa, Pleurotus albidus foi o produtor significativo de proteases (34,00 U/mL) e a síntese
dessas enzimas foi estimulada pela idade (10 dias) e volume do inóculo (5%, p/v). As proteases
mostraram atividade ótima em pH 5 a 60°C, estabilidade em pH (5-8), temperatura de 30°C até
60°C, sendo classificadas como cisteíno e serinoproteases. O coagulante de Pleurotus albidus
expressou razão coagulante de 21,60 com máxima atividade a 60 °C, pH 6. Ácido iodoacético
inibiu significativamente a atividade coagulante, sugerindo maior quantitativo de
cisteínoproteases. As enzimas de Pleurotus albidus não apresentaram toxicidade contra
fibroblastos humanos (MRC5). Em matriz sólida, Pleurotus albidus cultivado em semente de
açaí e farelo de arroz (90:10, p/p) produziu protease com elevada razão coagulante (14,58),
formação de soro abundante e forte coagulação. As condições ideais para produção do
coagulante foram: inóculo (10 dias de idade), meio de cultivo pH 6, tamanho do inóculo (2,5%,
p/v) e idade do inóculo 10 dias. O coagulante exibiu máxima atividade em pH 5, a 55 °C, com
estabilidade até 45 °C, sendo inibido por ácido iodoacético. O quejo elaborado apresentou
umidade (55%), lipídios (20%), proteínas (18%) e atendeu aos padrões microbiológicos
exigidos pela legislação brasileira. Pleurotus albidus é uma fonte de coagulante que pode ser
aplicada na indústria de laticinios, em especial na fabricação de queijo.
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Caracterização estrutural da BpirSP-39 e isolamento e caracterização da primeira serinoprotease do veneno da serpente Bothrops braziliZaqueo, Kayena Delaix, 69-99249-6615 07 August 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-08-07 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Snake venoms are formed by organic and inorganic compounds and result in a complex
product of biological nature which present as main objectives the detention, death and
the promotion of initial digestion of its prey. In addition, presents a vast potential for
exploration of molecules with pharmaceutical applications. Among organic compounds
protease should be highlighted due its ability to cause changes on hemostatic system.
Snake venoms serine proteases (SVSPs) are a class of proteases that act on different
factors of the coagulation cascade. One SVSPs class is described as thrombin-like
(SVTLEs) by mimicking some thrombin activities and displays coagulant ability in
vitro through the degradation of fibrinogen chains α and/or β. The objectives were (i) to
characterize structurally BpirSP-39 previously isolated from Bothrops pirajai venom
and (ii) to isolate and characterize the first serine protease (SP) of B. brazili. Studies of
this magnitude are justified because they can provide important information on the
involvement of proteins during envenoming, which can contribute to a better
understanding of the mechanisms of action of these enzymes. Primary and tertiary
structures model of both isolated SPs were elucidated. BpirSP-39 presented 224 amino
acids and has high identity when compared to other SVSPs. BbrzSP-32 was obtained
from B. brazili venom after two chromatographic steps (affinity and reverse phase) and
its primary structure showed 240 amino acid residues. Both SPs characterized are
enzymes which may take the SP’s structure of Agkistrodon halys (PDB ID: 4E7N), an
enzyme used as a model for molecular modeling. The enzymes are glycoproteins
globular and monomeric with two α-helices and two barrels formed by sheet-β. BbrzSP-
32 showed 36 kDa of relative molecular mass and its absolute mass was confirmed by
mass spectrometry as 32,520 Da. It present 79.48% identity when compared to other
SVSPs and was able to degrade the α-chain of fibrinogen, in vitro models, and is
considered a SVTLE-A. It showed a dose-dependent activity in the process of
degradation of fibrin networks demonstrating greater specificity for this activity when
compared to its thrombolytic action. BbrzSP-32 demonstrated proteolysis activity on
gelatin and chromogenic substrates for serine proteases and thrombin-like enzymes (S-
2288 and S-2238 respectively), besides having coagulant activity on human plasma.
13
After pre-incubation with PMSF and benzamidine the coagulants and proteolytic
activities on S-2288 and S-2238 substrate were reduced. BbrzSP-32 shows stability
against pH and temperature variations, demonstrating optimum activity between 30 and
40 °C and in the pH range 7.5 to 8.5. The enzyme does not induce or interferes with the
clotting washed platelets. When incubated with parasites Trypanosoma cruzi or
Leishmania infantum, promastigotes and the epimastigote forms, respectively, and S.
epidermidis (gram positive-bacteria), the enzyme presented to cytotoxic on
microorganisms, furthermore, was able to reduce the biofilm formation by the bacteria
species. Both SPs present potential biotechnological. / Os venenos de serpentes são constituídos por compostos orgânicos e inorgânicos,
resultando em um produto biológico eficiente e de natureza complexa, que tem como
principais objetivos a imobilização, morte e a promoção da digestão inicial das presas.
Além disso, apresentam um enorme potencial para prospecção de moléculas com
aplicação farmacológica. Dentre os compostos orgânicos destacam-se as proteínas,
principalmente as proteases, pois apresentam capacidade em alterar o sistema
hemostático. As serinoproteases dos venenos de serpentes (SVSPs) pertencem à classe
de proteases que agem sobre diferentes fatores da cascata de coagulação. Uma das
classes de SVSPs é descrita como trombina-símile (SVTLEs) por mimetizar algumas
atividades da trombina, exibindo capacidade coagulante in vitro por intermédio da
degradação das cadeias α e/ou β do fibrinogênio. Os objetivos do trabalho foram (i)
caracterizar estruturalmente a BpirSP-39 isolada previamente do veneno de Bothrops
pirajai e (ii) isolar e caracterizar a primeira serinoprotease (SP) do veneno de B. brazili.
Estudos dessa magnitude justificam-se, pois podem trazer importantes informações
sobre a participação das proteínas durante o envenenamento, podendo auxiliar no
melhor conhecimento sobre os mecanismos de ações destas enzimas. As estruturas
primárias, bem como, os modelos tridimensionais de ambas SPs isoladas foram
elucidados. A BpirSP-39 possui 224 aminoácidos e apresenta elevada identidade com
outras SVSPs. A BbrzSP-32 foi obtida do veneno de B. brazili após duas etapas
cromatográficas (afinidade e fase reversa) e sua estrutura primária apresentou 240
resíduos de aminoácidos. Ambas as enzimas caracterizadas podem assumir a estrutura
da SP de Agkistrodon halys (PDB ID: 4E7N), proteína utilizada como modelo para a
modelagem molecular, sendo glicoproteínas monoméricas globulares com duas α-
hélices e dois barris formados por folhas-β. Com relação à BbrzSP-32, por intermédio
de eletroforese foi obtida a massa molecular relativa (36 kDa), sendo sua massa absoluta
confirmada por espectrometria de massa como 32.520 Da. A BbrzSP-32 possui
identidade de até 79,48% quando comparada a outras SVSPs e foi capaz de, em
modelos in vitro, degradar a cadeia α do fibrinogênio, sendo considerada uma SVTLE11
A. Possui atividade dose dependente no processo de degradação de redes de fibrina,
demonstrando maior especificidade por essa atividade quando comparada à sua ação
trombolítica. Apresenta atividade de proteólise sobre gelatina e substratos
cromogênicos, para serinoproteases e enzimas trombina-símile (S-2288 e S-2238,
respectivamente), além de possuir atividade coagulante sobre o plasma humano. As
atividades de proteólise sobre os substratos S-2288 e S-2238, bem como, coagulantes,
foram reduzidas por PMSF e benzamidina e, em menor proporção por EDTA. A
BbrzSP-32 apresenta relativa estabilidade frente a variações de pH e temperatura,
demonstrando maiores atividades entre 30 e 40 ºC e, em intervalo de pH 7,5 à 8,5. A
enzima não induz ou interfere na coagulação de plaquetas lavadas. Quando incubada
com os parasitos Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum, nas formas epimastigota e
promastigota, respectivamente, e bactérias gram-positiva da espécie Staphylococcus
epidermidis, apresentou-se citotóxica sobre os microrganismos, além disso, foi capaz de
reduzir o biofilme formado pela espécie de bactéria. Ambas SPs apresentam potenciais
biotecnológicos.
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Coinfecção viral como elemento imunomodulatório na tuberculose pulmonarSoria, Aurora Del Carmen Rosell, 3305-4018 18 December 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-12-18 / Tuberculosis demands today great sanitary importance due to it’s high prevalence and lethality. It possesses antimicrobial resistance and hits vulnerable populational groups. The Cytomegalovirus (CMV) and the Epstein-Barr virus (EBV), after initial exposure, are capable of establishing latency in the tissues, causing modulatory effects on the immune system, allowing protection against intercurrent infections, but enabling cancer and autoimmunity in individuals with a favorable genetic backround. This work is a controlled case study aiming to verify if the viral co-infection by EBV and CMV have any influence on the onset of Tuberculosis (TB). IgG and IgM serology were carried out for EBV and CMV, also viral genome research through the Polymerase Chain Reaction technique in real time on the plasma of TB patients, and controls (subjects that had interdomiciiary contact with index cases of TB). 68 patients participated, ages ranging from 18 to 36 years and 56 paired controls. It was observed that 100% of cases and controls had positive IgG for EBV; and that 100% of cases and 96,4% of controls were IgG positive for CMV. Therefore, in that small transversal sampling the high prevalence of infection by EBV and CMV was confirmed, but not an association between the infection/latency of the viruses and the occurrence of TB. Low presence of the viral genome on the plasma was verified: 7 occurrences in the cases (10,3%) and 9 in the controls (16,1%). Despite the numerical difference, maybe highliting a tendency, there was no statistical significance. It is important that this study continues, in this way, in a longitudinal cohort of exposed individuals (home infected), with higher “n” sampling, and a smaller populational age range, that houses more prevalence of seronegatives exposed to EBV and CMV, allowing observation of the contrast with seropositives. / A tuberculose se investe na atualidade de grande importância sanitária devido a sua alta prevalência e letalidade. Possui resistência e acomete grupos populacionais vulneráveis. O citomegalovírus (CMV) e o vírus Epstein Barr (EBV), após a aquisição inicial, são capazes de estabelecer latência nos tecidos, provocando efeitos modulatórios no sistema imune, podendo proteger de infecções intercorrentes, mas favorecendo o câncer e a autoimunidade em indivíduos com o background genético favorável. O presente trabalho é um estudo de caso controle com o objetivo de verificar se a coinfecção viral pelo EBV e CMV influencia no aparecimento da Tuberculose (TB). Procedeu-se à sorologia IgG e IgM para EBV e CMV, e à pesquisa do genoma viral por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real no plasma de pacientes com TB e controles (indivíduos que tiveram contacto intradomiciliar com casos index de tuberculose). Participaram 68 pacientes com idade entre 18 a 36 anos e 56 controles pareados. Observou-se que 100% de casos e controles eram IgG positivos para EBV; 100% de casos e 96,4% de controles eram IgG positivos para o CMV, portanto, nessa pequena amostragem transversal, confirmou-se a alta prevalência da infecção pelo EBV e CMV, mas, não se observou associação entre a infecção/latência dos vírus e a ocorrência de tuberculose. Verificou-se baixa presença do genoma viral no plasma: 7 ocorrências nos casos (10,3%) e 9 ocorrências nos controles (16,1%). Apesar da diferença numérica, talvez mostrando uma tendência, não houve significância estatística. É muito importante a continuidade do estudo, desta feita em uma coorte longitudinal de indivíduos expostos (contactantes domiciliares), com maior “n” amostral, e faixa etária populacional menor, que comporte maior prevalência de expostos soronegativos para o EBV e CMV, permitindo observar contraste com expostos seropositivos.
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Caracterização nutricional e desenvolvimento de produto alimentício adicionado de Pleurotus albidusFigueiredo, Adrya da Silva, 92-99478-2040 28 July 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-07-28 / The genus Pleurotus (Fr.) Quél belongs to the order Agaricales, family Pleurotaceae and
constitutes a group of cosmopolitan mushrooms, found in regions of temperate climate.
Pleurotus has a large number of edible species that grow in different substrates. They are
considered to be easy to grow fast and with low costs using inexpensive and available raw
materials such as straw, grass and bagasse. The aim of this study was to evaluate the production
and nutritional properties of P. albidus to supplement a pasta and evaluating the nutritional
quality of different combinations of its dehydrated biomass on the final product. The results
showed that P. albidus grew and excreted proteases in all tested substrates: cupuaçu exocarp
(Theobroma grandiflorum, Schum) and açaí seed (Euterpe oleracea), supplemented with rice
bran (Oryza sativa) and crueira (residue of Manihot esculenta). The substrates supplemented
with rice bran showed significant values of proteolytic activity than the ones supplemented with
crueira. The enzymes showed optimum activity at pH 6.0, 40 °C and 50 °C and they were
characterized as being cysteine and metalloprotease. The crude extract was not toxic in the
hemolysis and human fibroblast cells test. It showed antioxidant capacity in DPPH (68.47 μg
/ ml), ABTS radical (93.99 μg / mL), total phenols (79.9 mgEq / g) and flavonoids (14.8 mgEq
/ g). In the nutritional quality, the biomass presented total carbohydrate content of 60.3%, 36.3%
of protein, 2.7% of crude fiber, 0.8% of ash, 0.4% of lipids and 376.3 Kcal. Potassium was the
most abundant macromineral, followed by phosphorus, sulfur, magnesium, and calcium with
21.08 g.Kg -1, 10.31 g.Kg -1, 2.08 g.Kg -1, 1.33 g .Kg-1 and 0.26 g.Kg-1, respectively. Among
the microminerals, iron (131.85 mg.Kg -1) and zinc (95.78 mg.Kg -1) were higher, followed
by boron, sodium, manganese and copper with 39.48 mg.Kg- 1, 33.04 mg.Kg -1, 7.27 mg.Kg -1,
and 2.0 mg.Kg -1, respectively. In the evaluation of the microbiological quality the noodle
produced and supplemented with P. albidus biomass were considered safe for human
consumption. The addition of mushroom biomass increased proteins, fibers and mineral
content. The noodle also showed quality in the cooking test and texture. According to the
results, the addition of P. albidus has potential for development of food products with
nutritional qualities. / O gênero Pleurotus pertence à ordem Agaricales, família Pleurotaceae e constitui um grupo de
cogumelos cosmopolitas, encontrados em regiões de clima temperado. Os Pleurotus possuem
um grande número de espécies comestíveis que crescem em diferentes condições de substratos,
considerados de fácil produção e com pouco investimento, utilizando matérias-primas baratas
e facilmente disponíveis como, palha, capim e bagaço. O objetivo deste trabalho foi avaliar a
produção e as propriedades nutricionais de P. albidus para fortificar produto de panificação do
tipo massa alimentícia e avaliar o efeito de diferentes combinações da biomassa desidratada do
cogumelo sobre a qualidade nutricional das massas elaboradas. Os resultados mostraram que
P. albidus cresceu e excretou proteases em todos os substratos testados, exocarpo de cupuaçu
(Theobroma grandiflorum, Schum) e semente de açaí (Euterpe oleracea), suplementados com
farelo de arroz (Oryza sativa) e crueira (residuo grosseiro da Manihot esculenta), apresentando
valores significativos para as misturas suplementadas com farelo de arroz. O padrão proteolítico
das enzimas em extrato bruto usando inibidores indica ser císteina e metaloprotease, pH 6,0 e
temperatura ótima 40 e 50 °C. As enzimas mantiveram estáveis entre 60 a 90 minutos nas
temperaturas de 30 a 50 ºC. A biomassa não apresentou toxicidade nos testes de hemólise em
sangue comercial de carneiro e na avaliação citotóxica em célula de fibroblasto humano.
Mostrou capacidade antioxidante em DPPH (68,47μg/ml), radical ABTS (93,99 μg/mL), fenóis
totais (79,9 mgEq/g) e flavonoides (14,8 mgEq/g). Na qualidade nutricional, a biomassa
apresentou teor de carboidratos totais de 60,3%, 36,3% de proteínas, 2,7% de fibra bruta, 0,8%
de cinzas, 0,4% de lipídios e 376,3 Kcal. O potássio foi o macromineral mais abundante,
seguido de fósforo, enxofre, magnésio, e cálcio com 21,08 g.Kg-1, 10,31 g.Kg-1, 2,08 g.Kg-1,
1,33 g.Kg-1 e 0,26 g.Kg-1, respectivamente. Já entre os microminerais o ferro (131,85 mg.Kg-1)
e zinco (95,78 mg.Kg-1) estão em maior quantidade, seguido do boro, sódio, manganês e cobre,
39,48 mg.Kg-1, 33,04 mg.Kg-1, 7,27 mg.Kg-1, e 2,0 mg.Kg-1, respectivamente. Na avaliação da
qualidade microbiológica os macarrões elaborados com a biomassa de P. albidus foram
consideradas seguras para consumo humano. A adição da biomassa elevou o teor de minerais e
apresentou um aumento de 53% e 64% de proteínas e fibras, respectivamente, as massas
demonstraram qualidade no teste de cozimento e textura, mostrando que a adição de P. albidus
tem potencial para o desenvolvimento de produto alimentício com qualidades nutricional.
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Reação de Cafeeiros (Coffea canephora) ao Nematoide-das- Galhas Meloidogyne incognita (Est I2) sob condições controladas de inoculaçãoSantos, Anderson Vieira, 69-98123-3454 21 June 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-06-21 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Brazil is the leading producer and exporter of coffee world. The use of resistant coffee cultivars is one of the most economical ways to control the Root-knot nematodes Meloidogyne spp. However, studies are needed to demonstrate the best methodologies used in resistance tests of coffee to the gnath nematode to be Possible to reduce experimental errors and to standardize test facilities so that the results of different jobs can be compared with confidence. Therefore, the objective of this work is to analyze the effects of adjusting the inoculum concentration and evaluation period on the reaction of Coffea canephora and weed clones to Meloidogyne incognita (Est I2) in Rondônia, as well as to evaluate the reaction of 56 clones as resistance to the Root-knot nematodes M. incognita. For this, three experiments were conducted separately. Firstly, samples of coffee roots were collected in five producing areas of the municipality of Cacoal and sent to the biochemical characterization by esterase enzyme (Est) of the species (s) of Meloidogyne spp., where a single pattern of Meloidogyne incognita (Est I2) in all samples. One of them was used to obtain a pure nematode population of M. incognita and multiplied in cv. Saint Clara. The first experiment was set up as follows: Six-month-old seedlings of C. canephora "194", "125" and "750" clones, as well as of the Obatã variety of C. arabica, from the germplasm bank of Embrapa Rondônia, were transplanted to 8-liter vessels containing 2: 1: 1: 1 sterilized substrates (natural soil, vermiculite medium texture, sand and organic compost, respectively). As a susceptible control, tomato plants (Solanum Iycopersicum L.) cv Santa Clara were used to verify the viability of the inoculum of M. incognita used in this experiment. After fifteen days of adaptation of the coffee tree seedlings in the pots, six plants of each one of the coffee genotypes was inoculated with different concentrations of M. incognita, being 1000, 5000, 10000 and 20000 eggs + J2 per plants, constituting 11 treatments with six replicates. However the seedlings of the susceptible control, the tomato, were inoculated with 5000 eggs of the nematode/plant. After the inoculations the treatments were arranged in a completely randomized design in the shelter. Evaluations were performed at 5 and 8 months after inoculation. It was observed that the lowest concentrations of inoculum (1000 and 5000 eggs / pot) were the most efficient for nematode establishment and reproduction in both coffee genotypes. In the second experiment, clones of C. canephora of the BRS Ouro Preto variety, 8 months old were transplanted to vessels containing autoclaved soil and inoculated with 5,000 eggs + juveniles of the second stage (J2) of the nematode (first trial). The design was completely randomized, with six replicates for each genotype tested. Tomatoes cv. Santa Clara represented the positive witness and coffee clones Apoatã the negative witnesses, inoculated with the same level of inoculum of the others. After 148 days of inoculation the plants were removed from the vases and the roots separated from the aerial part, washed, weighed and evaluated for number of galls (NG). Then, the number of eggs of M. incognita (NO) from the roots was extracted and counted, obtaining the breeding factor (FR) of the nematode (FR = final population / initial population) in each tested plant. Considering immune genotypes with FR = 0.00; Resistant, FR <1.00; And, susceptible, FR> 1.00. The M. incognita NG and FR values were submitted to ANOVA and the means were compared by the Scott Knott test (1974) at 5% probability. The results showed that only clone 750 was susceptible to M. incognita. Apoatã clones obtained FR = 0, being considered non-hosts. The clones of the cultivar BRS Ouro Preto behaved as resistant to M. incognita. The second assay was installed on July 2, 2015, in order to evaluate the reaction of thirty - two clones of C. canephora to M. incognita, using the same methodology of the first assay, being evaluated on 02/11 / 2015. At 150 DAI the C. canephora clones of the botanical variety Conilon 694, 160, 837, 46, 909, 890 and the hybrid materials 844, 1005, 169, 543, 453, 120, 193, 636, both with early ripening cycle, Have behaved as resistant to M. incognita and can be used in breeding programs to obtain nematode-resistant precocious coffee cultivars under soil and climate conditions in Rondônia. / Foi ojetivo deste trabalho analisar os efeitos do ajuste da densidade de inóculo e época de avaliação de ensaios na reação de clones de Coffea canephora à Meloidogyne incognita (Est I2) sob condições controladas. Para tanto, foram conduzidos três experimentos separadamente. Primeiramente, amostras de raízes de café foram coletadas em cinco áreas produtoras do município de Cacoal e encaminhadas para a caracterização bioquímica através da enzima esterase (Est) da(s) espécie(s) de Meloidogyne spp., onde se reconheceu um único padrão de Meloidogyne incognita (Est I2) em todas as amostras. Uma delas foi utilizada para a obtenção de uma população pura do nematoide das galhas M. incognita e multiplicado em tomateiro cv. Santa Clara. No primeiro experimento mudas com seis meses de idade dos clones de C. canephora “194”, “125” e “750”, além da variedade Obatã IAC-1669-20 de C. arabica e plantas de tomate (Solanum Iycopersicum L.) cv Santa Clara (testemunhas) foram transplantadas para vasos. Após quinze dias de adaptação das mudas seis plantas de cada genótipo de café foram inoculadas com diferentes concentrações de M. incognita, sendo elas 1000, 5000, 10000 e 20000 ovos + J2 por plantas, constituindo 11 tratamentos com seis repetições em delinemamento inteiramente casualizado mantidos em casa de vegetação. O tomateiro foi inoculado com 5000 ovos do nematoide/planta. As avaliações foram realizadas aos 5 e 8 meses após a inoculação. Foi observado que as menores concentrações de inóculo (1000 e 5000 ovos/planta) foram as mais eficientes para o estabelecimento e reprodução do nematoide em ambos os genótipos, expressando de forma adequada os níveis de resistência e/ou suscetibilidade dos cafeeiros. No segundo experimento, quinze clones de C. canephora da variedade BRS Ouro Preto, foram inoculados com 5.000 ovos + juvenis de segundo estádio (J2) da mesma população de Meloidogyne incognita (Est I2). O delineamento foi completamente casualizado, com seis repetições para cada clone testado. Tomateiros cv. Santa Clara e clones de café Apoatã representaram as testemunhas (positiva e negativa, respectivamente). Após 148 dias da inoculação as plantas foram avaliadas quanto ao número de galhas (NG) e o fator de reprodução (FR) do nematoide (FR = população final/população inicial) em cada planta testada. Os resultados demonstraram que os clones de Apoatã foram imunes ao nematoide (FR=0) e todos os clones da cultivar BRS Ouro Preto se comportaram como resistentes à M. incognita (FR<1), diferenciando-se significativamente das testemunhas suscetíveis (FR>1). O terceiro experimento foi instalado em julho de 2015, com o objetivo de avaliar a reação de trinta e dois clones de C. canephora das variedades botânicas Conilon, Robusta e Híbridos Intervarietais à mesma população de M. incognita (Est I2), utilizando a mesma metodologia do segundo experimento. Aos 150 DAI os clones de C. canephora da variedade botânica Conilon 694, 160, 837, 46, 909, 890 e os materiais híbridos 844, 1005, 169, 54, 453, 120, 193, 636, ambos com ciclo precoce de maturação, se comportaram como resistentes à M. incognita.
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