Apenas se han utilizado cultivos organotípicos tridimensionales (3D-OC) para el análisis de la interacción entre las bacterias y el tejido cerebral, por ello, hemos estudiado por primera vez la infección de 3D-OC de cerebros de rata con L. monocytogenes. L. monocytogenes es un organismo modelo para microbiólogos e inmunólogos, por lo que resulta interesante utilizar esta bacteria para el estudio ex vivo de las interacciones con el sistema nervioso central (SNC). En este sentido, hemos examinado la infección del tejido cerebral con L. monocytogenes mediante microscopía. A través de la utilización de matrices de PCR en tiempo real, hemos analizado los genes implicados en la respuesta inmunitaria y en la autofagia del hospedador frente a la infección. Finalmente, hemos estudiado la interacción de Listeria con células primarias obtenidas de los 3D-OC. Estos cultivos constituyen una herramienta versátil para investigar, en condiciones experimentalmente controladas, una gran variedad de vías biológicas relevantes durante la neurolisteriosis, y sirven como modelo para el estudio de otros microorganismos neurotrópicos relevantes. / Three-dimensional organotypic cultures (3D-OC) has hardly been used for the analysis of the interaction between bacteria and brain tissue , therefore, we have studied for the first time the infection of 3D-OC rat brains with L. monocytogenes. L. monocytogenes is a model organism for microbiologists and immunologists , so it is interesting to use this bacteria to study ex vivo interaction with the central nervous system (CNS). In this regard, we examined brain tissue infection with L. monocytogenes by microscopy . Through the use of arrays of real time PCR, we have analyzed genes involved in the host immune response and autophagy against infection. Finally, we have studied the interaction of Listeria with primary cells obtained from the 3D-OC. These cultures are a versatile tool to investigate, in experimentally controlled conditions, a variety of relevant biological pathways during neurolisteriosis, and serve as a model for the study of other relevant neurotropic microorganisms.

La proteína CarD es un regulador transcripcional de acción global en la bacteria Myxococcus xanthus, que se requiere para la actividad de varios factores σ-ECF (extracytoplasmatic function). CarD presenta una arquitectura de dominios única, con un dominio C-terminal de unión al DNA similar a las proteínas eucarióticas HMGA (high-mobility group A), y un dominio N-terminal, típicamente bacteriano, que define a la familia de proteínas PF02559. Dicha familia incluye el dominio de interacción con la polimerasa de RNA de los factores TRCF (que acoplan la reparación del DNA con la transcripción), y un grupo de proteínas ampliamente distribuidas y poco estudiadas, cuyo miembro en M. xanthus hemos denominado CdnL (CarD N-terminus Like), para distinguirlo de CarD, ya que ambas proteínas coexisten en esta bacteria. En este trabajo se ha determinado la estructura de CdnL, una proteina esencial para la viabilidad en M. xanthus, así como del dominio N-terminal de la proteína homóloga de Thermus thermophilus y se ha realizado un análisis mutacional exhaustivo para establecer la relación estructura-función. Los resultados indican que CdnL utiliza su dominio N-terminal, que adopta una estructura similar a los dominios Tudor, para interaccionar con la subunidad β de la polimerasa de RNA (βRNAP), y que la superficie de contacto CdnL-βRNAP está conservada en relación con otros miembros de la familia. Asimismo, se ha demostrado que la interacción CdnL-βRNAP es fundamental para la función de CdnL. El dominio C-terminal de CdnL, también necesario para su función, adopta una estructura compacta con cinco hélices α en disposición antiparalela, en la que destaca una superficie de residuos no polares y básicos expuestos al solvente. Varios de dichos residuos básicos juegan un papel clave, pendiente de determinar, en la función de CdnL. Además, CdnL, pero no los mutantes de pérdida de función in vivo, estabiliza in vitro la formación del complejo abierto formado por la RNAP unida al factor σ principal, σA, en un promotor de rRNA. Consistente con estos datos, CdnL se localiza in vivo en los promotores de rRNA. Que CdnL se requiera para la actividad del holoenzima RNAP-σA y CarD para la de factores σ-ECF en M. xanthus ilustra cómo dos miembros de una misma familia han evolucionado para actuar sobre promotores dependientes de distintos factores σ. Como la proteína CdnL de M. xanthus, su homólogo en Mycobacterium tuberculosis, pero no en Bacillus subtilis, es esencial para la viabilidad celular, interacciona con la βRNAP, y se requiere para la activación de la transcripción del rRNA. Para evaluar el grado de conservación evolutiva de la función de CdnL, en este trabajo se ha estudiado también la proteína homóloga (CcCdnL) de Caulobacter crescentus, una alfaproteobacteria modelo de estudio para diversos procesos celulares. Los resultados obtenidos indican que CcCdnL es esencial, interacciona con la βRNAP, y se localiza en los promotores de rRNA activando su transcripción in vivo. Estos resultados sugieren que la función esencial de CdnL y su modo de acción, más allá de alguna posible excepción, están conservados en distintos grupos taxonómicos bacterianos. CcCdnL, cuya expresión es constitutiva, es sustrato de la proteasa ClpXP. Sin embargo, el aumento en los niveles intracelulares de CcCdnL por falta de la degradación mediada por ClpXP no provoca efectos adversos sobre el crecimiento. Una peculiaridad de las mutaciones de falta de función en CcCdnL, en relación con las mutaciones equivalentes en sus homólogos de M. xanthus y M. tuberculosis, es su criosensibilidad, que podría resultar de diferencias intrínsecas entre los distintos homólogos, o de diferencias en la estabilidad intrínseca de los complejos abiertos de transcripción formados por la distintas RNAP. / The CarD protein is a global transcriptional regulator in the bacterium Myxococcus xanthus that is required for the activity of various ECF (extracytoplasmatic function) σ factors. CarD has a unique domain architecture with a C-terminal DNA binding domain similar to eukaryotic HMGA (high- mobility group A) proteins and an N-terminal, typically bacterial, domain that defines the protein family PF02559. This family includes the RNA polymerase interaction domain of TRCF factors (that couple DNA repair with transcription) and a group of widely distributed but poorly studied proteins, whose member in M. xanthus we named CdnL (CarD N-terminus Like) to distinguish it from CarD, since both proteins co-exist in this bacterium. In this work, the structure of CdnL, a protein essential for M. xanthus viability, as well as that of the N-terminal domain of the homologous protein in Thermus thermophilus have been determined, and an extensive mutational analysis has been carried out to establish structure-function relationships. The results indicate that CdnL utilizes its N-terminal domain, which adopts a structure similar to Tudor domains, to interact with the β subunit of RNA polymerase (βRNAP), and that the CdnL-βRNAP contact surface is conserved relative to other members of this family. Furthermore, the CdnL-βRNAP interaction is shown to be critical for CdnL function. The CdnL C-terminal domain, also required for its function, adopts a compact structure composed of five antiparallel  helices, whose striking feature is the presence of a solvent-exposed nonpolar-basic patch. Several of these basic residues play a key role, which remains to be determined, in CdnL function. Moreover, CdnL, but not its loss-of-function mutants, stabilizes in vitro the formation of open complexes at rRNA promoters by RNAP holoenzyme containing σA, the principal σ factor in M. xanthus. Consistent with these data, CdnL localizes to rRNA promoters in vivo. That CdnL is required for activity of the RNAP-σA holoenzyme and CarD for that of ECF-σ factors in M. xanthus illustrates how two members of the same family have evolved to act on promoters dependent on distint σ factors. Like M. xanthus CdnL, its homologue in Mycobacterium tuberculosis, but not in Bacillus subtilis, is essential for cellular viability, interacts with βRNAP, and is required for the activation of rRNA transcription. To assess the degree of evolutionary conservation of CdnL function, we also studied the homologue (CcCdnL) in Caulobacter crescentus, a model alphaproteobacterium for the study of diverse cellular processes. The results show that CcCdnL is essential, interacts with βRNAP, and localizes to rRNA promoters activatng their transcription in vivo. These results suggest that the essential function of CdnL and its mode of action, other than some possible exception, is conserved across distinct taxonomical bacterial groups. CcCdnL, whose expression is constitutive, is a substrate of the ClpXP protease. Nevertheless, the increase in intracellular levels of CcCdnL due to the loss of its degradation by ClpXP does not provoke adverse effects on growth. An unusual feature of CcCdnL lack-of-function mutations, relative to equivalent mutations of its homologues in M. xanthus and M. tuberculosis, is their cold- sensitivity, which may stem from intrinsic differences among the distinct homologues, or from differences in the intrinsic stabilty of the open, transcripion complexes formed by distinct RNAP.

Objetivo: Demostrar que conforme aumenta la data de los restos óseos disminuye proporcionalmente la quimioluminiscencia que se produce al ser enfrentados al reactivo del luminol, y de esta forma aplicar dicha técnica para poder calcular la data de dichos restos con fines medicolegales. El fundamento es que los restos óseos presentan indicios de hematina que como sustancia orgánica estará presente en los mismos cada vez en menos concentración conforme avanza la data de la muerte, y dada la altísima sensibilidad del reactivo de luminol frente a la presencia de dicha molécula medir la intensidad en URL de la reacción y así poder aplicarla al establecimiento de la data. Metodología: Disponemos de 102 muestras de polvo óseo de cortical de huesos largos, en este caso fémures, con data de la muerte conocida. El reactivo de luminol que utilizamos es el propuesto por Weber que estará compuesto por un oxidante, el peróxido de hidrógeno, un reductor, que será el propio luminol y sosa que alcaliniza el medio. Haremos reaccionar 0,1 ml de dicho reactivo con 30 mg de polvo, produciéndose, en caso de presencia de un catalizador como es la hematina, una reacción de quimioluminiscencia que la mediremos en un luminómetro tipo FluostarGalaxy, el cual nos proporcionará los resultados en una hoja de cálculo en donde para cada muestra estudiada tendremos un valor de intensidad de quimioluminiscencia cada 5 segundos durante 5 minutos de lectura. Los valores obtenidos los trasladaremos a una herramienta estadística como el SPSS 20.0 para poder hacer el consiguiente tratamiento. Resultados: Al realizar una correlación bivariada comparando los valores obtenidos en quimioluminiscencia como variable independiente frente a la data conocida, en este caso variable dependiente, hemos podido comprobar que ateniéndonos al valor del coeficiente de Pearson y al nivel de significación en todos los casos, se puede afirmar que la intensidad de quimioluminiscencia y la data se relacionan de forma inversamente proporcional. Con las mismas variables hemos hecho un estudio de regresión para establecer la variable más predictora, resultando ser ésta la quimioluminiscencia a los 15s. El estudio por medio de una estimación curvilínea nos indica que el modelo exponencial es el que más se ajusta. Con un análisis discriminante por pasos hemos comprobado que los mejores resultados se obtienen con la variable de quimioluminiscencia a los 20 segundos. Las curvas COR autorizan la aplicación de esta técnica en la determinación de la data. Este trabajo se limita al no combinar resultados obtenidos con otros que ya se conocen por su aplicación en este campo, y por la necesidad de cuantificar el Fe previo de la muestra. Por otra parte, abre la vía para profundizar en el análisis cinético de las curvas resultantes para cada muestra. Conclusiones Hemos encontrado una correlación negativa entre la quimioluminiscencia medida por luminometría y la data de los restos óseos, de tal forma que la quimioluminiscencia decrece conforme aumenta la data. El modelo matemático que mejor se ajusta de relación entre quimioluminiscencia y data es el exponencial. La lectura de quimioluminiscencia a los 15 segundos (QL15s) es la que presenta una mayor capacidad de predicción de la data. La lectura de quimioluminiscencia a los 20 segundos (QL20s) presenta el mayor poder discriminante (capacidad de clasificación) de todos los tiempos analizados. Del estudio realizado pensamos que nuestros resultados nos permiten proponer el estudio por luminometría de los restos óseos para el cálculo de la data de los mismos al tratarse de una técnica simple, de bajo coste y con una capacidad de clasificación aceptable. / Objective: to demonstrate that chemiluminescence diminishes proportionately as post-mortem interval of bone remains increases when they come into contact with luminol, enabling this technique to be used to calculate the post-mortem interval of these remains for medico-legal interests. The basis is that bone remains show traces of haematin, which is present as an organic substance in the bone, but the concentration diminishes constantly after death. Given the high sensitivity of luminol in the presence of this molecule, it is possible to measure the intensity of the reaction in URL and so establish the date of death. Methodology: we used 102 samples of cortical bone dust belonging to long bones, in this case femurs, with a known date of death. The luminol used is that proposed by Weber, which comprises an oxidant (hydrogen peroxide), a reductant (luminol itself) and sodium carbonate, which alkalises the medium. The reagent (0.1 ml) is reacted with 30 mg of dust to produce, in the presence of a catalyst such as haematin, chemiluminescence, which can be measured with a luminometer (Fluostar Galaxy). This provides the results for each studied sample on a spreadsheet, which shows the chemiluminescence intensity every 5 seconds for 5 minutes. The obtained values are transferred to a statistical program, such as the SPSS 20.0, for treatment. Results: based on a bivariate correlation comparing the values of chemiluminescence as an independent variable with the known date, in this case the dependent variable, from the Pearson coefficient and the significance level, we can affirm that the intensity of chemiluminescence and the age are inversely proportional. A regression study was made using the same variables to establish th emost predictable variable, which was the chemiluminescence at 15 seconds. A curvilinear estimation indicated that the exponential model was the best fitting model, while a step by step discriminant study showed that the best results were obtained with the chemiluminescence variable at 20 seconds. The COR curves results confirm the usefulness of this technique to determine the date. This validity of this work is limited because other results already known in this field were not compared and because of the need to quantify Fe previous to the sample. However, it opens the way to studying in greater detail the kinetic analysis of the resulting curves for each sample. Conclusions We found a negative correlation between chemiluminescence measured by luminotremy and the age of bone remains, the chemiluminescence decreasing as the age increases. The mathematical model that best fits the relation between chemiluminescence and date is exponential. The chemiluminescence reading at 15 seconds (QL15s) is the best predictor of date, while the reading of chemiluminescence at 20 seconds (QL20s) has the best discriminant capacity (classification capacity) of all the times analyzed. The results of the study lead us to propose luminometry as a method for calculating the age of bone remains since it is a simple, low cost technique with an acceptable classification capacity.

D.L. A 454-2007

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