Els eicosanoids són els mediadors lípidics inflamatoris més potents i juguen un paper clau en diversos processos fisiològics i patològics modulant la iniciació, progressió i resolució de la inflamació. Per aquest motiu en la present tesi s'ha investigat el paper de les dues vies majoritàries de formació d'eicosanoids, la via de la ciclooxigenasa (COX)-2 i la de la 5-lipooxigenasa (LO), a dos teixits claus a l'homeostasi corporal: el teixit hepàtic i el teixit adipós. Durant el primer estudi, vam examinar la contribució de la COX-2 i la 5-LO en la progressió de la inflamació i fibrosi hepàtica. L'administració de SC-236, un inhibidor de la COX-2, combinat amb el CJ-13,610, un inhibidor de la 5-LO, a ratolins tractats amb CCl4, va reduir la fibrosi i la necroinflamació hepàtica, augmentant l'apoptosi en cèl·lules no parenquimals. Vam confirmar aquests resultats amb ratolins deficients per la 5-LO que van rebre SC-236. Vam realitzar un perfil farmacològic addicional d'aquests compostos en macròfags, on van regular diferentment l'expressió de IL-6. Durant el segon estudi, vam investigar la contribució de la via de la 5-LO a la inflamació del teixit adipós i la disfunció lipídica a l'obesitat. El teixit adipós de ratolins obesos va presentar un increment de la expressió de la proteïna activadora de la 5-LO (FLAP) i els nivells de LTB4. La incubació de explants de teixit adipós amb productes de la 5-LO va produir l'activació del NF-kappaB i va augmentar la secreció d'adipoquines proinflamatòries. A més, el LTB4 va modular el transport d'àcids grassos lliures al teixit adipós. El teixit adipós obès presentava una infiltració de macròfags, elevats nivells d'àcids grassos lliures i esteatosi hepàtica, efectes que van ser revertits amb la inhibició de la FLAP. Aquesta inhibició va modular a més l'AMPK, la HSL i de la secreció de TNFalfa i IL-6. En conjunt, aquests resultats ens indiquen que els eicosanoids, mediadors lipídics derivats de l'àcid araquidònic, tenen una paper regulador de la inflamació tissular. A nivell del fetge la inhibició simultània de la via de la COX-2 i la 5-LO exerceix un efecte preventiu del dany hepàtic necroinflamatori i la fibrogènesi. A nivell de teixit adipós la via de la 5-LO és una nova diana en la prevenció de l'estat inflamatori i de la disfunció lipídica. Això ens indica que aquestes vies representen una potencial estratègia terapèutica en aquests teixits estudiats. / In this thesis we investigated the major eicosanoid formation pathways, cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipooxygenase (5-LO), and their role in hepatic and adipose tissue inflammation. In the first study, we examined the contribution of COX-2 and 5-LO to the progression of hepatic inflammation and fibrosis. Separate administration of SC-236, a COX-2 inhibitor, and CJ-13,610, a 5-LO inhibitor, to CCl4-treated mice significantly reduced fibrosis without affecting necro-inflammation. Conversely, combined administration of SC-236 and CJ-13,610 reduced both necro-inflammation and fibrosis and increased the number of apoptotic non-parenchymal liver cells. These findings were confirmed in 5-LO-deficient mice receiving SC-236, which also showed reduced hepatic MCP-1. Additional pharmacological profiling of SC-236 and CJ-13,610 was performed in macrophages, the primary hepatic inflammatory cell type. These drugs differentially regulated IL-6 in macrophages. During the second study, we investigated the contribution of the 5-LO pathway to adipose tissue inflammation and lipid dysfunction in experimental obesity. Constitutive expression of key components of the 5-LO pathway as well as LT receptors were detected in adipose tissue. Adipose tissue from obese mice exhibited increased 5-LO activating protein (FLAP) expression and LTB4 levels. Incubation of adipose tissue with 5-LO products resulted in NF-kappaB activation and augmented secretion of pro-inflammatory adipokines. In addition, LTB4 reduced FFA uptake in adipocytes, whereas 5-LO inhibition suppressed lipolysis. In mice with obesity, elevated FLAP expression in adipose tissue was paralleled with macrophage infiltration, increased FFA levels and hepatic steatosis, phenomena that were reversed by FLAP inhibition. Interestingly, FLAP inhibition induced AMPK in parallel with decreases in HSL activity and the secretion of TNFalpha and IL-6. Taken together, these findings indicate that both COX-2 and 5-LO pathways are contributing factors to hepatic inflammation and fibrosis and that the 5-LO pathway signals the adipose tissue "low-grade" inflammatory state and steatogenic potential in experimental obesity, representing potential targets for therapy.

Información extraída del <a href="http://www.cindefi.org.ar/?page_id=61&language=es">sitio web del CINDEFI</a>

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Objetivos • Caracterización cinética de la oxidación de diversas fenotiazinas comerciales, catalizada por lacasa, mediante un método espectrofotométrico, útil para posibles ensayos de gestión de la calidad en industrias farmacéuticas. • Desarrollo de un método espectrofotométrico apropiado, para la caracterización cinética de sustratos fenólicos de lacasa, que originan productos cromofóricos inestables. • Optimización de la biodegradación enzimática de clorofenoles recalcitrantes como TCP y PCP, con peróxido de hidrógeno y peroxidasa sin mediadores sintéticos. • Optimización de la biodegradación enzimática de TCP por oxígeno molecular, catalizada por lacasa en presencia de mediadores naturales, sin mediadores sintéticos ni peróxido de hidrógeno. • Determinación enzimática y espectrofotométrica de tioles, y aplicación a ensayos de gestión de la calidad de fármacos tiólicos, superando a otros métodos instrumentales alternativos. • Análisis cuantitativo de ácido ascórbico, en muestras sintéticas y en fármacos, utilizando un nuevo método enzimático y espectrofotométrico, capaz de superar a otros métodos ópticos y electroquímicos. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Ensayos de cromatografía de gases acoplada a detector de espectrometría de masas (GC-MS) Los espectros de masas fueron realizados con un espectrómetro de masas Agilent 5975 acoplado a un cromatógrafo de gases Agilent 7890N. Ensayos espectrofluorométricos Los espectro de fluorescencia fueron registrados con un lector de placas fluorescente GeminiTM XPS. Ensayos oximétricos Las medidas de evolución de consumo de oxígeno fueron medidas con un electro de tipo Clark acoplado a un oxígrafo Hansatech. Caracterización cinética de fenotiazinas y sustratos fenólicos La oxidación de diferentes fenotiazinas y sustratos fenólicos por lacasa procedente de Trametes villosa (TvL), fue seguida por la absorbancia de cada uno de los cationes radical cromofóricos. Parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), o su cuadrado (Amax2) y la velocidad en estado estacionario VSS fueron determinados. Biodegradación enzimática de clorofenoles La biodegradación de contaminantes clorados fue llevada a cabo por dos tipos de enzimas, lacasa (TvL) como enzima principal de estudio, y peroxidasas de sofá y rábano (SBP y HRP, respectivamente), con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del 2,4,6-triclorofenol y del pentaclorofenol (PCP). Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente la oxidación de varias fenotiazinas comerciales por lacasa, comprobando los efectos de diversas variables experimentales, sobre la formación enzimática y la destrucción no enzimática, de sus correspondientes radicales cromofóricos. • Se ha conseguido desarrollar un método espectrofotométrico simple, fiable y eficaz para la caracterización cinética de sustratos fenólicos de lacasa que originan productos cromofóricos inestables, superando los inconvenientes de los métodos espectrofotométricos de velocidad inicial. • El uso de peróxido de hidrógeno con peroxidasas de rábano picante (HRP) y de soja (SBP), ha demostrado ser una buena alternativa para la biodegradación enzimática de clorofenoles recalcitrantes, como TCP y PCP. • Se ha conseguido optimizar el proceso, ofreciendo un método rápido, eficaz, sin peróxido de hidrógeno, y medioambientalmente sostenible, superando a otros métodos que utilizan mediadores sintéticos, con alto coste y toxicidad. • La elevada reproducibilidad de los métodos enzimáticos con lacasa para la determinación de tioles y de ácido ascórbico, ha indicado una satisfactoria precisión de los mismos. • La validez de los métodos enzimáticos con lacasa respecto a métodos de referencia, para la determinación de D-penicilamina o de ácido ascórbico en fármacos, ilustra su aplicabilidad para el análisis de muestras reales, especialmente de principios activos reductores como tioles y ácido ascórbico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral. / Objectives • Kinetic characterization of the oxidation of several commercial phenothiazines catalyzed by laccase, using a spectrophotometric assay, useful for quality management assays in pharmaceutical industries. • Development of an appropriate spectrophotometric assay, for the kinetic characterization of phenolic substrates, which produce unstable chromophoric products. • Optimization of the enzymatic biodegradation of recalcitrant chlorophenols like TCP and PCP, with hydrogen peroxide and peroxidase in the absence of synthetic mediators. • Optimization of the enzymatic biodegradation of TCP by molecular oxygen, catalysed by laccase in the presence of natural mediators, and without synthetic mediators neither hydrogen peroxide. • Enzymatic and spectrophotometric determination of thiols, and application in quality management assays of thiolic drugs, with improved performance than other instrumental alternative assays. • Quantitative analysis of ascorbic acid, in synthetic samples and drugs, using a new enzymatic and spectrophotometric assay, that offer better specifications than other optical and electrochemical assays. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Gas chromatography/Mass spectrometry Mass spectra were realized with a Mass spectrometer Agilent 5975 coupled to a gases chromatograph Agilent 7890N. Spectrofluorometric assays Fluorescence spectra were recorded in a fluorescence microplate reader GeminiTM XPS. Oxymetric assays Oxygen evolution was measured with a Clark-type electrode coupled to a Hansatech Oxygraph. Kinetic characterization of phenothiazines and phenolic substrates The oxidation of different phenothiazines and phenolic substrates by laccase from Trametes villosa (TvL), was monitored recording the absorbance of each chromophoric radical cation. Kinetic parameters as maximum absorbance (Amax), maximum square absorbance (Amax2) and the steady-state rate VSS were determined. Enzymatic biodegration of chlorophenols The biodegradation of chlorophenolic pollutants were carried out with two kind of enzymes, laccase (TvL) as the main research one, and peroxidase (SBP and HRP) to constrast the biodegradation yields of 2,4,6-trichlorophenol (TCP) and pentachlorophenol (PCP). Conclusions • The oxidation of several commercial phenothiazines with laccase has been kinetically characterized, checking the effects of many experimental variables, on the enzymatic formation and non-enzymatic breakdown, of their corresponding chromophoric radicals. • A simple, reliable and effective spectrophotometric method has been developed, for the kinetic characterization of phenolic substrates of laccase that generate unstable chromophoric products, overcoming the drawbacks of the spectrophotometric methods of the initial rate. • The use of hydrogen peroxide with horseradish peroxidase (HRP) and soybean peroxidase (SBP), has demonstrated to be a great alternative for the enzymatic biodegradation of recalcitrant chlorophenols, like TCP and TCP. • The process has been optimized, offering a method that is fast, effective, without hydrogen peroxide, and environmentally sustainable, overcoming other methods that use synthetic mediators, with high cost and toxicity. • The high reproducibility of the enzymatic methods with laccase to determine thiols and ascorbic acid, has shown a successful precision of these methods. • The validity of the enzymatic methods with laccase with respect to reference methods, for the determination of D-penicillamine or ascorbic acid in drugs, show their applicability to analyse real samples, especially reductant active ingredients like thiols and ascorbic acid. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.

Las poliaminas son pequeñas moléculas con carga positiva esenciales para los procesos de crecimiento, proliferación, diferenciación y apoptosis celular. En mamíferos, los niveles intracelulares de poliaminas están altamente regulados a través de distintos mecanismos, como su biosíntesis, degradación y transporte a través de la membrana plasmática. La regulación post-traduccional de ornitina descarboxilasa (ODC), enzima clave de la ruta biosintética, está principalmente mediada por la acción de una familia de proteínas denominadas antizimas (AZs), cuya síntesis se estimula cuando los niveles de poliaminas son elevados. Las AZs se unen y inhiben ODC, e inducen su degradación proteasomal sin ubiquitinación. Además, las AZs inhiben la captación de poliaminas extracelulares, probablemente por interaccionar con el transportador de poliaminas. Además de las AZs, la actividad ODC está también indirectamente regulada por una familia de proteínas denominadas inhibidores de antizimas (AZINs). Estas proteínas, homólogas a ODC pero sin actividad enzimática, también interaccionan con las AZs, incluso de manera más eficiente que ODC, contrarrestando los efectos de las AZs sobre ODC. En mamíferos, la familia de los AZINs está compuesta por dos miembros: AZIN1 y AZIN2. Mientras que AZIN1 es una proteína de expresión ubicua que regula los niveles intracelulares de poliaminas y el crecimiento celular, AZIN2 se expresa mayoritariamente en testículo y cerebro, y su función fisiológica es menos conocida. El presente trabajo se ha centrado en el estudio de la expresión del gen Azin2 en tejidos de ratón, así como en profundizar en el conocimiento de diferentes aspectos funcionales y estructurales de AZIN2, proteína caracterizada por primera vez en nuestro laboratorio, comparando los mismos con los de sus proteínas homólogas ODC y AZIN1. Los objetivos del trabajo planteados, relacionados con la expresión, estructura, y función de AZIN2, fueron los siguientes: 1) Estudio de la expresión de AZIN2 y proteínas homólogas, así como la de las AZs en diferentes tejidos de ratón adulto mediante RT-PCR a tiempo real; 2) expresión de AZIN2 en testículo de rata y en testículos de ratones con alteraciones en la espermatogénesis; 3) influencia de AZIN2 y proteínas relacionadas con el metabolismo de poliaminas sobre el transporte de agmatina e influencia sobre el mismo de compuestos amino-guanidinios; 4) predicción de la estructura tridimensional de AZIN2 mediante modelado comparativo por homología, y estudio de la estructura cuaternaria de AZIN2 en células de mamífero; 5) análisis de la zona de unión a AZs (AZBE) en AZIN2 y sus parálogos, e influencia de los residuos conservados en las propiedades de las proteínas; 6) estudio de la vida media de AZIN2 y sus parálogos en células de mamífero, y de su posible mecanismo de degradación. En general, la metodología utilizada para la realización de este trabajo puede describirse como una combinación de técnicas de bioquímicas y de biología molecular, análisis de expresión génica mediante RT-PCR a tiempo real y aproximaciones computacionales. Además, se utilizaron tanto líneas celulares, principalmente para los experimentos de transfección, como animales de laboratorio. En particular, se realizaron tratamientos específicos para la destrucción de células germinales haploides del testículo. Las conclusiones obtenidas del trabajo experimental son las siguientes: 1. El análisis mediante RT-PCR a tiempo real mostró que, además de cerebro y testículo, AZIN2 se expresa de manera significativa en otros tejidos de ratón adulto como epidídimo, glándula adrenal, páncreas, corazón y pulmón, mientras que su expresión en diversas líneas celulares humanas de origen tumoral fue prácticamente indetectable. 2. Diversos modelos experimentales corroboran que en el testículo murino la gran mayoría del ARNm de AZIN2 se encuentra localizado en las células germinales haploides, descartando una expresión significativa en otros tipos celulares testiculares como las células intersticiales. 3. El patrón de expresión postnatal de AZIN2 y AZ3 en el testículo de rata es similar al encontrado en ratón, sugiriendo que estas proteínas también podrían estar participando en el proceso de espermiogénesis en esta especie. 4. La sobreexpresión de ODC o AZIN2 estimula la entrada de agmatina a las células COS7, mientras que las AZs la inhiben. En condiciones basales, dicho transporte, a concentraciones próximas a las fisiológicas, parece tener lugar a través del transportador general de poliaminas. 5. La estructura tridimensional de AZIN2, deducida mediante modelado comparativo, es similar a la descrita para sus parálogos ODC y AZIN1 en lo referente a los dominios barril / y hoja plegada , aunque difiere en regiones menos conservadas como ciertos bucles y las regiones N- y C-terminal. 6. A diferencia de ODC, AZIN2 es incapaz de formar homodímeros o a heterodimerizar con monómeros de ODC, aunque comparte con esta proteína la capacidad para interaccionar con las tres antizimas conocidas. 7. El análisis comparativo de la secuencia de la región AZBE en los diferentes ortólogos de AZIN2 y los de sus parálogos AZIN1 y ODC reveló la existencia de cinco residuos conservados (K116, A124, E139, L140 y K142 en la secuencia de AZIN2 de ratón). 8. Mientras que las mutaciones simples de cada uno de estos residuos en AZIN2 apenas afectaron la interacción de esta proteína con las AZs, las mutaciones dobles o triples de algunos de ellos anularon la capacidad de AZIN2 para interaccionar con las AZs, de manera independiente de la repercusión de dichas mutaciones sobre la carga eléctrica neta del elemento AZBE. 9. Los residuos conservados en la secuencia AZBE de ODC parecen ser muy importantes para la función de la enzima, ya que todas las mutaciones simples de los mismos, con la excepción de A123, disminuyeron notablemente la actividad catalítica de la enzima. 10. Los residuos E138 y L139 son críticos para la funcionalidad de ODC, ya que su sustitución por alaninas disminuye grandemente la homodimerización de la proteína, produciendo además la del segundo un gran aumento en su estabilidad por anular su interacción con AZ1. 11. En células transfectadas, AZIN2 es una proteína más lábil que ODC, mostrando una vida media de aproximadamente 90 minutos, y que a diferencia con ODC se estabiliza grandemente al interaccionar con las antizimas. 12. A diferencia con lo observado para ODC y AZIN1, la inhibición de la maquinaria proteasomal con lactacistina o MG132 produce una marcada disminución de la proteína AZIN2, sugiriendo que su degradación pudiera estar mediada por una vía alternativa a la del proteasoma 26S. / Polyamines are small cationic molecules essential for cell growth, proliferation, differentiation and apoptosis. In mammals, the intracellular polyamine levels are tightly controlled by the regulation of different processes including their biosynthesis, degradation and transport across the plasma membrane. Post-translational regulation of ornithine decarboxylase (ODC), the key biosynthetic enzyme, is mainly mediated by the action of a family of small proteins named antizymes (AZs), whose synthesis is stimulated by high polyamine levels. AZs bind and inhibit ODC and target it to proteasomal degradation. Furthermore, AZs inhibit extracellular polyamine uptake presumably by interacting with the polyamine transport system. In addition to AZs, the ODC activity is also indirectly regulated by a family of proteins named antizyme inhibitors (AZINs). These proteins, closely related to ODC but without enzymatic activity, also interact with antizymes, even more efficiently than ODC, counteracting the effects of antizymes on ODC. In mammals, the AZIN family is formed by two members: AZIN1 and AZIN2. Whereas AZIN1 is a ubiquitous protein that regulates intracellular polyamine levels and cell growth, AZIN2 is mainly expressed in testis and brain and its physiological role is mostly unknown. In this work we have focused on the study of the expression of the Azin2 gene in mouse tissues and the determination of different functional and structural aspects of AZIN2, protein first characterized in our laboratory, comparing the results with those of the homologous proteins ODC and AZIN1. The specific aims of this work were: 1) To determine the expression pattern of AZIN2 and homologous proteins, as well as those of AZs, in different adult mouse tissues by real-time RT-PCR; 2) to elucidate the AZIN2 expression in rat normal testes and in mouse testes with impaired spermatogenesis; 3) to analyse the effect of AZIN2 and proteins related to the polyamine metabolism and the influence of aminoguanidine compounds on agmatine transport; 4) to predict the tridimensional structure of AZIN2 by comparative modeling and to determine whether AZIN2 is able to form homodimers or heterodimers with ODC in mammalian cells; 5) to analyse the AZBE region of AZIN2 and its paralogs and the effect of conserved residues in the functionality of these proteins; 6) to study the half-life and the mechanism of degradation of AZIN2 and its paralogs in mammalian cells. In general the experimental methodology involved methods of molecular biology and biochemistry, gene expression analyses using real-time RT-PCR and computational approaches. In addition, we used several mammalian cell lines, mainly for transient transfection experiments, and laboratory animals. In particular, we performed specific treatments for the selective destruction of haploid germ cells in mouse testis. The conclusions obtained from our experiments were as follows: 1. Real-time RT-PCR analysis showed that, in addition to brain and testis, AZIN2 is expressed significantly in other adult mouse tissues such as epididymis, adrenal glands, pancreas, heart and lung, whereas its expression in several human cancer cell lines is almost undetectable. 2. In mouse testis, most AZIN2 mRNA is located in haploid germ cells, without significant expression in other testicular cells such as the interstitial cells. 3. The postnatal expression patterns of AZIN2 and AZ3 genes in rat testis are similar to those found in mice, indicating a evolutionary conserved expression pattern and suggesting that in the rat both proteins might be also participating in the spermiogenesis. 4. Agmatine uptake in COS7 cells is stimulated by AZIN2, ODC or SSAT overexpression, and inhibited by the presence of AZs. In basal conditions, agmatine uptake occurs through the polyamine transporter when the concentration of agmatine is close to the physiological values. 5. The tertiary structure of AZIN2, predicted by comparative modeling, is similar to those of its paralogs ODC and AZIN1 in the domains TIM / barrel and sheet, but it differs considerably in less conserved regions such as some loops and the N- and C-terminal regions. 6. Unlike ODC, AZIN2 is unable to form homodimers or heterodimers with ODC, but it is able to interact with the three AZ isoforms. 7. The comparative analysis of the AZBE sequences from multiple AZIN1, AZIN2 and ODC ortologs revealed the existence of five conserved residues (K116, A124, E139, L140 and K142 in mouse AZIN2). 8. In AZIN2, the double and triple substitutions of some of the conserved residues, but not single substitutions, drastically affected its interaction with AZs, independently from the effect of the substitutions on the net electric charge of the AZBE region. 9. In the case of ODC, the conserved residues play an important role in the function of the enzyme, since all single substitutions, with the exception of A123, significantly diminished ODC catalytic activity. 10. The residues E138 and L139 are critical for ODC functionality, since their substitution by alanines clearly reduced the formation of homodimers, causing the change L139A a potential increase of the protein stability by decreasing its interaction with AZ1. 11. In transfected cells, AZIN2 is more labile than ODC, having a half-life of approximately 90 minutes and being considerably stabilized by the interaction with AZs. 12. Unlike ODC and AZIN1, AZIN2 protein levels decreased after treatment with proteasome inhibitors, suggesting that its degradation might be mediated by an alternative route to proteasome 26S.

OBJETIVOS 1. Evaluar como influye la función renal glomerular, medida por TFGe, en la concentración de NT-proBNP urinario. 2. Evaluar la relación entre las concentraciones de marcadores bioquímicos específicos de función renal glomerular y tubular y las concentraciones de NT-proBNP, para ayudar a identificar su mecanismo de eliminación renal. 3. Evaluar el valor pronóstico de los niveles de NT-proBNP urinario y compararlo con el de NT-proBNP plasmático en pacientes con ICA. MATERIAL Y MÉTODOS Se incluyeron prospectivamente 138 pacientes consecutivos ingresados, diagnosticados de ICA, en el Hospital Virgen de la Arrixaca. Se recogieron simultáneamente muestras de sangre y orina al ingreso. Los parámetros de laboratorio medidos en suero fueron: glucosa, creatinina, urea, albúmina, sodio, ácido úrico, PCR, Troponina T, cistatina C, BTP y NT-proBNP. Y en orina: alfa-1 microglobulina, albúmina (MAU) y NT-proBNP. RESULTADOS 1. NT-proBNP plasmático y urinario fue más elevado en pacientes con un mayor deterioro de la TFGe (p<0,001). NT-proBNP plasmático correlacionó positivamente con los valores de NT-proBNP urinario (r=0,61, p<0,001) Las correlaciones TFGe - NT-proBNP también fueron significativas aunque menos potentes (r=-0,44; NT-proBNP plasmático y r=-0,37; NT-proBNP urinario, p<0,001 para ambos). TFGe, tras ajuste multivariable, tan sólo fue predictora independiente de las concentraciones plasmáticas de NT-proBNP (y de una forma débil). El principal predictor independiente de las concentraciones urinarias de NT-proBNP fue el NT-proBNP en plasma. 2. Los niveles urinarios de alfa-1 microglobulina (β = 0,50; p <0,001) y el NT-proBNP plasmático (β = 0,29; p <0,001) fueron los principales predictores independientes de los niveles de NT-proBNP urinario mientras que la creatinina, MDRD, cistatina C, BTP y MAU no alcanzaron significación estadística. 3. Los pacientes que presentaron eventos clínicos tenían una concentración plasmática superior de NT-proBNP (4.561 pg/ml [2.191-8.631] frente a 2.906 pg/ml [1.643-5.823]; p=0,03) pero su concentración urinaria de NT-proBNP fue similar (78 pg/ml [42-294] frente a 71 pg/ml [41-189]; p=0,62) en comparación con las de los pacientes que no sufrieron eventos clínicos. En los análisis de regresión de Cox univariables y multivariables, la concentración plasmática de NT-proBNP por encima de la mediana (3.345 pg/ml) se asoció a un mayor riesgo de eventos clínicos adversos (HR=2,35; IC del 95%, 1,41-3,93; p=0,001). Sin embargo, la concentración urinaria de NT-proBNP por encima de la mediana (73 pg/ml) no alcanzó significación estadística como factor predictivo del pronóstico de eventos en el análisis univariable (HR=1,2; IC del 95%, 0,79-1,96; p=0,46) CONCLUSIONES 1. El deterioro de la función renal glomerular se asocia con un aumento de las concentraciones de NT-proBNP plasmáticas y urinarias. Sin embargo, el filtrado glomerular renal no es predictor independiente de NT-proBNP urinario. 2a. NT-proBNP plasmático fue el mayor predictor de las concentraciones urinarias de NT-proBNP. Podría deberse a una mayor producción de NT-proBNP a nivel cardiaco como consecuencia del mayor estrés cardiovascular de los enfermos con afectación cardiaca y renal concomitante. 2b. Sugerimos que la presencia de disfunción tubular renal podría estar implicada en el aumento de niveles de NT-proBNP urinarios observados en pacientes con IR ya que, a diferencia de los marcadores de filtrado glomerular renal, alfa-1 microglobulina (parámetro de función tubular renal) fue predictor independiente de NT-proBNP urinario. Así, una disminución de la reabsorción de NT-proBNP a nivel del túbulo proximal favorecería un aumento de los niveles urinarios de NT-proBNP. 3. Consideramos que NT-proBNP urinario no debe ser utilizado con fines pronósticos en pacientes con ICA debido a que los niveles plasmáticos de NT-proBNP se asocian de forma independiente con el pronóstico de los pacientes con ICA pero, por el contrario, los niveles urinarios de NT-proBNP no presentan asociación con la aparición de eventos durante el seguimiento en este tipo de pacientes. / OBJECTIVES 1. Evaluate how glomerular renal function, as measured by eGFR, influences on urinary NT-proBNP concentration. 2. To evaluate the relationship between specific glomerular and tubular renal function biomarkers and NT-proBNP concentrations, to help identify the mechanism of renal elimination. 3. To evaluate the prognostic value of urinary NT-proBNP levels compared with plasmatic NT-proBNP levels in patients with AHF. METHODS We prospectively included 138 consecutive patients, diagnosed of ICA in Hospital Virgen de la Arrixaca. Blood and urine samples were simultaneously collected on admission. Laboratory parameters were measured in serum: glucose, creatinine, urea, albumin, sodium, uric acid, CRP, troponin T, cystatin C, and NT-proBNP BTP; and in urine: alpha-1 microglobulin, albumin (MAU) and NT-proBNP. RESULTS 1. Plasma and urinary NT-proBNP was higher in patients with a lower eGFR (p <0.001). Plasma NT-proBNP concentration correlated positively with urinary NT-proBNP (r = 0.61, p <0.001) Correlations eGFR - NT-proBNP were also significant although less robust (r = -0.44, NT-proBNP r = -0.37, NT-proBNP, p <0.001 for both). After multivariable adjustment, eFGR was only an independent predictor of plasma NT-proBNP concentrations. Plasma NT-proBNP was the main independent predictor of urinary NT-proBNP concentration. 2. Urinary Alpha-1 microglobulin levels (β = 0.50, p <0.001) and plasma NT-proBNP (β = 0.29, p <0.001) were the main independent predictor of urinary NT-proBNP concentration while creatinine, MDRD, cystatin C, BTP and MAU concentrations were not accepted as statistically significant. 3. Patients with clinical events had a higher plasma NT-proBNP concentration (4.561 pg / ml [2191-8631] vs 2,906 pg / ml [1643-5823], p = 0.03) but urinary NT-proBNP concentration was similar (78 pg / ml [42-294] vs 71 pg / ml [41-189], p = 0.62) compared with those patients who did not experience clinical events. In Cox regression univariate and multivariate analysis, the plasma NT-proBNP concentration above the median (3345 pg / ml) was associated with an increased risk of adverse clinical events (HR = 2.35, 95% , 1.41 to 3.93, P = 0.001). However, the urinary NT-proBNP concentration above the median (73 pg / ml) did not reach statistical significance as a predictor of prognosis of events in the univariate analysis (HR = 1.2, 95%, 0, 79 to 1.96, P = 0.46) CONCLUSIONS 1. Glomerular kidney disfunction is associated with increased plasma and urinary NT-proBNP concentration. However, glomerular filtration rate is not an independent predictor of urinary NT-proBNP. 2a. Plasma NT-proBNP was the main predictor of urinary NT-proBNP concentration. This may be due to increased cardiac production of NT-proBNP as a result of increased cardiovascular stress of patients with concomitant cardiac and renal involvement. 2b. Because alpha-1 microglobulin (renal tubular function parameter) was an independent predictor of urinary NT-proBNP unlike renal glomerular filtration biomarkers, we suggest that the presence of renal tubular dysfunction could be involved in increased urinary NT-proBNP levels observed in patients with renal disfunction. Thus, a decrease in NT-proBNP reabsorption at the proximal tubule would favor an increase urinary NT-proBNP levels. 3. We consider that urinary NT-proBNP should not be used for prognostic purposes in patients with AHF because plasma NT-proBNP levels was independently associated with prognosis of patients with AHF but, instead, urinary NT-proBNP levels have no association with the occurrence of events during follow-up in these patients.

Estudio de la bibliografía especializada y realización de ensayos preliminares que permitan la proposición de un mecanismo de reacción sometido a análisis cinético, que aporte expresiones útiles para un diseño experimental , aplicable para comprobar la validez del mecanismo de reacción planteado, así como para la caracterización cinética de los sistemas enzimáticos investigados, superando a otros métodos descritos en la bibliografía. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación enzimática por peroxidasas, de los colorantes Índigo Carmín (IC) y Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR), mediante un método espectrofotométrico. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de IC, por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de RBBR por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la determinación de fenoles con aplicaciones biotecnológicas, mediante un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Biodegradación de IC con peroxidasas La reacción se realizó en tubos de plástico con una concentración de enzimas HRP y SBP que varió entre 2.5-30 nM , la concentración de contaminante entre 10-120 M y la de peróxido de hidrógeno también entre 10 y 120 M , todo ello a pH óptimo de 10 mM de tampón citrato de pH 5.0 y 4.0 para HRP y SBP respectivamente, a 25 ºC.Se analizaron las reacciones en el espectrofotómetro y en el HPL, determinando los parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), la velocidad en estado estacionario VSS y la constante de biodegradación (). Biodegradación de IC con sistemas lacasa/peroxidasa-mediador Se comparó el estudio a 25 ºC de SBP con el de TvL para la degradación de IC entre con los mediadores MSG, ASG, SGA y SGO con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del colorante. Biodegradación de RBBR con sistemas lacasa-mediador Se optimizaron las condiciones de reacción para la degradación de RBBR con sistemas EML a temperatura ambiente, eligiendo el sistema mediador más eficaz para dicha reacción. Bioanálisis enzimático de fenoles Se diseña y optimiza un método de análisis enzimático espectrofotométrico para el análisis de distintos tipos de fenoles industriales (fármacos, contaminantes y fitoquímicos). La reacción se realiza en presencia de AA como reductor acoplado y biomolécula detectora, catalizada por HRP. Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente y optimizado la biodegradación enzimática de IC y RBBR por H2O2, catalizada por las peroxidasas HRP y SBP, mediante un método espectrofotométrico • Se ha conseguido la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática del IC, por varios sistemas enzima-mediador (EMS). En concreto, las enzimas SBP con H2O2 y TvL con O2, en presencia del premediador natural SGO, y de los mediadores naturales, MSG, ASG y SGA. • Se ha estudiado la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática de RBBR por TvL con O2, ante el premediador natural SGO y los mediadores naturales MSG, ASG y SGA. • Se ha desarrollado un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático, útil para la determinación de concentraciones nanomolares, de diferentes contaminantes, fármacos y fitoquímicos fenólicos de interés biotecnológico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral. / Kinetic characterization and optimization of a spectrophotometric method, for the enzymatic biodegradation by peroxidases, of the dyes Indigo Carmine (IC) and Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR). • Kinetic characterization and optimization of the IC biodegradation, by enzyme-mediator systems in the presence of natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the RBBR biodegradation, by enzyme-mediator systems with natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the determination of bioactive phenols, by using a spectrophotometric and ultrasensitive method of enzymatic bioanalysis. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Biodegradation of the dyes IC and RBBR by POD. This chapter describes a new ecofriendly alternative for removal Remazol Brilliant Blue (RBBR) and Indigo Carmine by soybean (SBP) and horseradish (HRP) peroxidases. Thus, studies for optimization of reaction conditions (pH, concentration of enzymes/substrates/hydrogen peroxide) have been proposed. Biodegradation of IC by enzyme-mediator systems. A reaction mechanism is proposed beside the pH results. This mechanism involves enzymatic and nonenzymatic reactions, in which a premediator (PM), mediator (M) and the mediator radical (MR) are considered. Vss values were determined from enzymes, mediator and IC effects. Thus, the assay conditions for biodegradation of IC, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Vss values were determined from enzyme, mediator and RBBR effects. The experimental data obtained confirmed the reliability of the reaction mechanism proposed. Thus, the assay conditions for biodegradation of RBBR, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Biodegradation of RBBR by laccase-mediator systems. Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR) biodegradation was carried out by laccase from Trametes villosa (TvL) using the natural mediators ASG, MSG, SGA and SGO Enzymatic bioanalysis of phenols. A number of analytical methods with different sensitivity, complexity, quickness and cost have been proposed The aim of this chapter is the possible determination of phenols of biotechnological interest, in nanomolar concentrations, by using an enzymatic and spectrophotometric method of bioanalysis, easy, quick and with low cost. Conclusions • It has characterized kinetically and optimized the enzymatic biodegradation of IC and RBBR by H2O2, catalyzed by the peroxidases HRP and SBP, with a spectrophotometric method. • It has reached the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of IC, by several systems enzyme-mediator (EMS). In particular, the enzyme SBP with H2O2 and TvL with O2, in presence of the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has been studied the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of RBBR by TvL and O2, with the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has carried out a spectrophotometric and ultrasensible method of enzymatic biodegradation, useful for the determination of nanomolar concentrations of different phenolic contaminants, drugs and phytochemicals of biotechnological interest. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.

Tesis por compendio de publicaciones / Las rutas de señalización mediadas por MAP quinasas (MAPK) tienen un papel fundamental en la respuesta de células eucariotas frente a estímulos ambientales. La levadura con fisión Schizosaccharomyces pombe representa un modelo particularmente adecuado para abordar estudios básicos sobre dichas rutas de señalización, debido a la gran homología funcional que existe entre sus circuitos reguladores y los de organismos superiores. En S. pombe, la ruta de MAPKs de integridad celular (CIP) participa en la regulación de numerosos procesos biológicos como la construcción de la pared celular, la citocinesis, la morfogénesis, la fusión de vacuolas durante el estrés hipotónico, y la homeostasis iónica mediante la modulación de la activación de la MAPK Pmk1 en respuesta a cambios en las condiciones ambientales. Aunque la GTPasa Rho2 es el principal activador de la ruta de integridad celular a través del ortólogo de PKC Pck2, Pmk1 puede ser activada en ausencia de ambos dependiendo de la naturaleza del estímulo recibido, lo que indica la existencia de elementos reguladores adicionales aguas arriba del módulo de MAPKs. Se ha propuesto a la GTPasa Rho1 como candidata para tal función, mientras que el ortólogo de PKC Pck1 parece regular negativamente la actividad de la CIP. Hemos investigado el posible papel de Rho1 y Pck1 como reguladores de la CIP empleando un mutante hipoactivo de Rho1 (rho1-596) y un mutante carente de Pck1 en distintos fondos genéticos. Las evidencias obtenidas mostraron que Rho1 y Pck1 son activadores de la ruta adicionalmente a Rho2 y Pck2, lo que pone de manifiesto la naturaleza ramificada de los mecanismos de señalización que actúan aguas arriba del módulo de MAPKs. Por otra parte Rho2 se localiza en la membrana plasmática y en el área de división celular, y es farnesilada in vivo en el motivo -CAAX de su extremo C-terminal, siendo esta modificación esencial para su localización y función activadora de la CIP. Sin embargo, la presencia de un residuo de cisteína previo al motivo -CAAX sugiere que Rho2 podría encontrarse palmitoilada en dicho residuo. Para estudiar la relevancia biológica de la palmitoilación de Rho2 creamos una serie de cepas que expresan versiones mutantes tanto de Rho2 como de Rho1 afectadas en lipidación, y estudiamos su localización y función biológica. Los resultados obtenidos permitieron concluir que en la levadura con fisión, la GTPasa Rho2 es palmitoilada in vivo, siendo esta modificación crítica para su correcta localización en membrana plasmática y para ejercer su regulación de la morfogénesis y la ruta de integridad celular. Por último, son numerosos los estudios que han puesto de manifiesto la importancia de la localización subcelular de los componentes de los módulos de MAP quinasas en la respuesta a estrés. En el caso de la ruta de integridad celular, la MAPK Pmk1 muestra una localización núcleo/citoplasmática constitutiva, así como en el huso mitótico, el corpúsculo polar del huso, y en el septo durante la separación celular. Sin embargo, a diferencia del modelo descrito en ERK1/2 en mamíferos, el patrón de localización de Pmk1 no se modifica en respuesta a estrés, lo que indica que tanto la forma activa como inactiva de la MAP quinasa son capaces de entrar en el núcleo. En base a esto, nos planteamos el estudio de la relevancia biológica de la localización nuclear de Pmk1 sobre su función biológica. Para ello recurrimos a la caracterización de mutantes de S. pombe que expresan una versión de Pmk1 anclada a la membrana plasmática y excluida del núcleo constitutivamente en distintos fondos genéticos. Los resultados mostraron que aunque la localización nuclear de Pmk1 en Schizosaccharomyces pombe no es crítica para ejercer la mayor parte de sus funciones biológicas, sí es necesaria para la regulación transcripcional en respuesta al estrés de pared celular, lo que revela la importancia del control espacio-temporal de la actividad de las MAPKs en los organismos eucariotas. / SUMMARY Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways play a fundamental role in the response of eukaryotic cells to environmental changes. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe has emerged as an excellent model organism to study mechanisms and cellular events linked to MAPK activation, given the significant functional homology between their regulatory circuits and those of higher cells. In S. pombe the cell integrity pathway (CIP) participates in multiple biological processes like cell wall construction, vacuole fusion during hypotonic stress, cytokinesis, morphogenesis, and ionic homeostasis by fine tuning of MAPK Pmk1 activation in response to various environmental conditions. Although the small GTPase Rho2 is a main positive regulator operating upstream the CIP through protein kinase C ortholog Pck2, Pmk1 can still be activated in the absence of either Rho2 or Pck2 depending on the nature of the stimulus, suggesting the existence of additional upstream regulatory elements to modulate its activity. The essential GTPase Rho1 is a candidate to control the activity of the CIP, whereas Pck1 appears to negatively regulate Pmk1 activity. To study the role of Rho1 GTPase and PKC ortholog Pck1 in the CIP, we characterized a S. pombe mutant that expresses hypomorphic Rho1 allele (rho1-596) and a mutant lacking Pck1 in distinct genetic backgrounds. The evidences obtained in this study revealed that Rho1 and Pck1 are positive upstream activators of the CIP in addition to Rho2 and Pck2 during cell growth and cell wall stress. This model shows the branched nature of the upstream signal network that regulates the CIP. Rho2 positively regulates the CIP and is involved in the control of cell polarity and cell wall biosynthesis in fission yeast. Rho2 locates along the plasma membrane and the division area and it has been described that becomes farnesylated in vivo at its -CAAX motif. This lipid modification appears essential for both localization and function within the MAPK pathway. Moreover, there is a second conserved cysteine residue upstream the Rho2 CAAX motif which might be palmitoylated in vivo like other Rho GTPases such as human RhoB. To investigate the role of palmitoylation in Rho2-signaling we constructed rho2Δ strains expressing the wild type, unpalmitoylated, or unprenylated versions of Rho2 as well as Rho2 chimeras fused to the carboxyl end from the essential GTPase Rho1, and we study their location and Rho2-dependent signalling within the CIP. Our results showed that in fission yeast Rho2 becomes palmitoylated in vivo and this modification is required for plasma membrane localization and proper signaling to the CIP. Pmk1 is constitutively localized in both cytoplasm and nucleus, as well as in the mitotic spindle and septum during cytokinesis. However, contrary to the current model for ERK1/2, its localization pattern appears unaffected by its activation status. In this context, we questioned the biological significance of nuclear localization of MAPK Pmk1. We have addressed this issue by characterization of mutants expressing Pmk1 versions excluded from the cell nucleus and anchored to the plasma membrane in different genetic backgrounds. We have found that nuclear localization of Pmk1 is not critical to exert their biological functions, although its presence in the nucleus is necessary for transcriptional regulation under cell wall stress. These evidences highlight the relevance of the spatial/temporal activity control of MAPK activity in eukaryotes.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en el mundo. Los elevados niveles de colesterol y lipoproteína de baja densidad (LDL), que se han relacionado a un aumento de la cantidad de LDL oxidado (oxLDL) destacan entre los factores de riesgo. OxLDL se ha relacionado con el desarrollo de fibrosis cardíaca posterior al daño miocárdico y a la activación o inhibición del proceso autofágico en diferentes modelos celulares. Los miofibroblastos cardíacos (MFC) son células diferenciadas de fibroblastos cardíacos. Son los principales productores de matriz extracelular (MEC) luego del daño tisular, formando un tejido de cicatriz. Una vez terminada su función, los MFC mueren por apoptosis. Sin embargo, se ha identificado la persistencia de MFC en el corazón después del daño, condición que favorece el desarrollo de fibrosis. No hay evidencias que relacionen oxLDL, autofagia y sobrevida celular. En esta memoria se propuso la siguiente hipótesis: “oxLDL induce autofagia y aumenta la sobrevida en miofibroblastos cardiacos”. Los objetivos a desarrollar fueron: a) Evaluar el efecto de oxLDL en autofagia de MFC y b) Determinar el efecto de autofagia y oxLDL en sobrevida de MFC. Se trabajó con MFC estimulados con oxLDL a diferentes concentraciones y tiempos, con el fin de evaluar el efecto en el flujo autofágico. Para ello, se cuantificaron los niveles de LC3-I y LC3-II mediante Western blot. Se utilizó H2O2 como estímulo de muerte para estudiar los efectos de oxLDL y autofagia en la viabilidad celular por conteo con azul de Tripán. Los resultados de este trabajo indicaron que: a) oxLDL por sí solo no indujo activación de la autofagia, sin embargo disminuye la acumulación de LC3-II inducida por cloroquina. b) Autofagia inducida por rapamicina disminuye la viabilidad celular ante estímulo de muerte de H2O2. c) oxLDL no afecta la viabilidad celular ante estímulo de muerte H2O2, no obstante disminuye la muerte celular inducida por rapamicina y H202 / Cardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide. A major risk factor in these diseases is high levels of cholesterol and low-density lipoprotein (LDL), and this has been correlated with high levels of oxidized low-density lipoprotein (oxLDL). OxLDL is linked to fibrosis development after myocardial injury and this has been correlated with activation or inhibition of autophagic process in various cellular models. Cardiac myofibroblasts (CMF) are a differentiated phenotype from cardiac fibroblasts (CF). They are the main extracellular matrix producers after tisular injury, MFC make a scar and then die via apoptosis. Nevertheless, CMF in cardiac tissue have been identified after their work, this condition promotes fibrosis development and cardiac failure. There is no evidence of relationship between oxLDL, autophagy and cellular survival. The following hypothesis was proposed to this work: “oxLDL induces autophagy activation and enhances cardiac myofibroblast survival”. Specifics objectives to answer the hypothesis were: a) To evaluate the effect of oxLDL on autophagy of MFC, and b) To determine the effects of oxLDL and autophagy on MFC survival. To fulfill the proposed objectives MFC were stimulated with oxLDL and its effects were observed on autophagic flux. LC3-I and LC3-II levels were quantified by Western blot. H2O2 was used as a death stimulus to observe oxLDL and rapamycin-induced autophagy on cellular survival the viable cells where counted by tripan blue method. The results of this works show that: a) oxLDL has no effect on LC3-II levels under normal conditions, but dimish LC3-II chloroquine-induced LC3-II accumulation. b) Rapamycin-induced autophagy dimishes cell survival on death stimulus H2O2. c) oxLDL has no effect on cell survival, but reverts loss of cell viability on MFC treated with H2O2 and rapamycin

Investigaciones en nuestro y otros laboratorios han demostrado que la hormona 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) modula los niveles de Ca2+ intracelular en células de músculo esquelético y tejido óseo por un mecanismo genómico, característico de hormonas esteroideas en el cual la hormona interacciona con un receptor intracelular específico (VDR: vitamin D receptor). Esta molécula exhibe una localización citoplásmica/nuclear, siendo el complejo hormona-receptor el responsable de la regulación de la expresión de genes portadores de elementos de respuesta a VDR. Sin embargo, 1,25(OH)2D3 modula también los niveles de Ca2+ intracelular a través de un mecanismo rápido, no genómico, independiente de la transcripción génica y de la síntesis proteica que implica acciones directas del esteroide sobre la membrana celular. Las acciones rápidas, no nucleares de 1,25(OH)2D3 requieren la activación de varios sistemas de señalización (adenilil ciclasa/AMPc/PKA; PLC/DAG/IP3/Ca2+/PKC), integrados en un mecanismo complejo que involucra proteínas G, interacción positiva entre las vías PKA y PKC e incremento en la fosforilación de proteínas de membrana. En conjunto, estos eventos conducen a una rápida y transitoria liberación de Ca2+ de los depósitos internos y activación de canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VDCC) tipo L, con el consecuente influjo sostenido de Ca2+ desde el medio extracelular. En el presente trabajo empleando el indicador fluorescente de Ca2+ Fura-2, se caracterizaron los efectos de la hormona 1,25(OH)2D3 sobre los niveles de Ca2+ citosólico en cultivos de osteoblastos de rata. Estos estudios pusieron de manifiesto que la fase de influjo de Ca2+ inducido por 1,25(OH)2D3 es mediada por los canales VDCC ya caracterizados, indicando además que existe una contribución parcial a la entrada de Ca2+ mediada por canales no dependientes de voltaje operados por el nivel de Ca2+ de los depósitos internos. Se introduce así el novedoso concepto sobre la participación de canales SOC (Store Operated Channels; CCE: Capacitative Ca2+ Entry ) en la respuesta rápida de Ca2+ a la hormona. A partir de este hallazgo, estudiamos y caracterizamos esta entrada capacitativa de cationes en líneas celulares derivadas de epitelio mamario y de cáncer mamario, ambas de origen humano. Estos canales, activados por depleción y/o movilización de Ca2+ de depósitos internos, independientes de voltaje y regulados por múltiples eventos de señalización intracelular, estarían constituídos por proteínas de la familia de genes TRP, originalmente descriptos en células fotoreceptoras de Drosophila (mutantes trp: Transient Receptor Potential). Sus genes han sido clonados, secuenciados y su funcionalidad como canales responsables del influjo de Ca2+ tipo SOC, ha sido demostrada mediante expresión de proteínas TRP en sistemas heterólogos. Además, en el sistema fototransductor de Drosophila, TRP forma parte de un complejo de señalización multiproteico junto con RH1 (rodopsina), NORPA (PLC específica de células fotoreceptoras), INAC (PKC específica de células fotoreceptoras) y una proteína adaptadora (scaffold protein) denominada INAD (Inactivation No After potential D) responsable de asociar todos los componentes en un complejo. INAD posee dominios PDZ, responsables de su función adaptadora mediante interacciones proteína-proteína. Recientes estudios bioquímicos, moleculares y electrofisiológicos, sugieren que INAD representa una subunidad constitutiva del canal TRP con función adaptadora en la formación del complejo supramolecular de señalización. Esta organización multiproteica de los componentes de señalización proporciona las bases estructurales para una eficiente y rápida activación y regulación de la entrada de Ca2+ a través de canales TRP. Se describieron recientemente homólogos de INAD en distintos tipos de células de vertebrados, donde se observó que cumplen función adaptadora en la formación de complejos de señalización integrados por receptores hormonales, canales iónicos y quinasas. En este trabajo mostramos evidencias de una proteína homóloga a INAD en osteoblastos de rata y su participación en el influjo capacitativo. En síntesis, en la presente Tesis Doctoral se muestran evidencias de influjo capacitativo de calcio en distintos tipos celulares, habiendo caracterizado este influjo y estudiado exhaustivamente la modulación de cationes en el interior celular. Particularmente en osteoblastos, un sistema íntimamente relacionado con el metabolismo del calcio, demostramos la única evidencia existente sobre modulación de canales SOC por un esteroide y más precisamente, la participación de proteínas TRP e INAD asociadas a este mecanismo fisiológico vinculado a la homestasis de cationes intracelulares. / Evidences from our laboratory and others have demonstrated that the hormone 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) modulates intracellular Ca2+ levels in skeletal muscle cells and bone tissue through a genomic mechanism, typical for steroidal hormones via specific an intracellular receptor (VDR: Vitamin D Receptor). Such molecule exhibits a cytoplasmatic-nuclear localization and the hormone-receptor complex is responsible for gene expression regulation of VDR responsive elements. Nevertheless, 1,25(OH)2D3 also modulates intracellular Ca2+ levels through a non genomic, rapid mechanism, independent of gene transcription and protein synthesis, implying direct steroid actions on the cellular membrane. Rapid or non genomic actions of 1,25(OH)2D3 requires the activation of diverse signal systems (adenylyl cyclase/cAMP/PKA; PLC/DAG/IP3/Ca2+/PKC), forming a complex mechanism that involves G proteins, positive interaction between PKA and PKC and increased protein phosphorylation. Altogether, these events lead to a rapid and transient Ca2+ release from internal stores and activation of Voltage Dependent Ca2+ Channels (VDCC) type L, followed by a sustained Ca2+ influx from the extracellular medium. In the present work by using the fluorescent Fura-2 Ca2+ dye, the effect of 1,25(OH)2D3 hormone on cytosolic Ca2+ levels in rat osteoblast cells were characterized. We have demonstrated that the 1,25(OH)2D3-induced Ca2+ influx phase is mediated by the well known VDCC channels and also that a Ca2+ partial entry contribution may occur by a non voltage dependent channels and operated by the status of internal Ca2+ stores. In this way we introduce a novel concept of SOC channels (Store Operated Channels; Capacitative Ca2+Entry) in rapid response of Ca2+ for the hormone. Accordingly, we have studied and characterized the capacitative cation entry in other cellular system derived from breast epithelium and breast cancer, both from human origen. These channels, activated by depletion and/or Ca2+ mobilization from internal stores, voltage independent and regulated by multiple intracellular signal events, involve proteins encoded by the trp family genes, first described in photoreceptor cells from Drosophila (mutants in trp: Transient Receptor Potential). Trp genes have been cloned and sequenced, their functionality as channels responsible from Ca2+ influx type SOC has been demonstrated through heterologous expression of TRP proteins. In addition, in Drosophila photoreceptor system, TPR is part of a multiproteic signal complex together with RH1 (rhodopsin), NORPA (PLC specific of photoreceptor cells), INAC (PKC specific of photoreceptor cells) and a scaffold protein named INAD (Inactivation No After potential D) responsible for the association of all components into a complex. INAD exhibits PDZ domains, responsible of its adaptor function through protein-protein interaction. Recently several biochemical, molecular and electrophysiologycal studies, suggests that INAD represents a constitutive subunit of TRP channels with an adaptor function in the supramolecular signaling complex assemble. This multiproteic organization of the signaling components provides the structural basis for an efficient and rapid activation and regulation of Ca2+ entry through TRP channels. INAD homologous sequences have been recently described in different vertebrate cells types, whereas it has been observed that plays scaffolding functions allowing the assembly of a complex composed by hormone receptors, ion channels and kinases. We demonstrated the presence of an INAD homologous protein in rat osteoblasts and its relationship to the capacitative Ca2+ influx. In summary, the present Doctoral Thesis describes the capacitative calcium entry in different cell types. We have characterized this influx and exhaustively studied the intracellular cation modulation. In particular, we have focused our efforts on osteoblast cells, a system closely dependant on calcium metabolism, and present the first evidence of SOC channels modulation by a steroid hormone and more precisely, the involvement of TRP and INAD proteins associated to this physiological mechanism in the control of intracellular Ca2+ homeostasis.