Orientador : Dr. Stenio Perdigão Fragoso / Co-orientadora : Drª. Gisele Fernanda Assine Picci / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 10/06/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia Celular e Molecular / Resumo: O protozoário Trypanosoma cruzí, agente causador da Doença de Chagas, possui características incomuns em relação à organização e expressão gênicas, tais como genes arranjados em polícístrons, transcritos processados por uma reação de trans splícíng, ausência promotores clássicos da RNA Polimerase 11 e poucos fatores de transcrição codificados em seu genoma. Essas características sugerem que a regulação diferencial da expressão gênica, que permitem um ciclo de vida complexo, é controlada por mecanismos pós-transcricionais, principalmente através de elementos em eis presentes, em geral, nas regiões não traduzidas (UTRs) dos mRNAs e de proteínas ligadoras de RNA (fatores em trans). As proteínas CCCH zínc fínger, caracterizadas por possuírem três resíduos de cisteína e um de histidina que coordenam um íon zinco na sequência C-X7;8-C-X5-C-X3-H, estão entre as proteínas ligadoras de RNA que promovem o controle do processamento, estabilidade, distribuição e tradução dos mRNAs. O objetivo do presente trabalho foi estudar o papel que proteína TcZC3H31 (a qual possui três domínios CCCH zínc fínger) desempenha durante o ciclo de vida do T. cruzí, usando técnicas como nocaute gênico, superexpressão e ribonômica. Essa proteína é expressa quase que exclusivamente nas formas epimastigota e tripomastigota metacíclico. Durante a divisão celular (G2, mitose e citocinese) de epimastigotas foram observadas estruturas com alta concentração dessa proteína, as quais não são observadas nos parasitas em na fase G1 do ciclo celular. Foram obtidos parasitas nocautes para esse gene, os quais foram incapazes de se diferenciar de epimastigota para a forma tripomastigota metacíclico, enquanto parasitas superexpressando TcZC3H31 se diferenciam com maior eficiência do que os parasitas selvagens, sugerindo que essa proteína é essencial para a diferenciação do T. cruzí. Ensaios de imunoprecipitação de RNA seguida de sequenciamento (experimentos de ribonômica) permitiram a identificação de mRNAs alvos dessa proteína. A maioria dos genes identificados nessa análise codificam proteíno-quinases. O padrão de expressão de alguns RNAs alvos foi avaliado por PCR quantitativa ao longo do ciclo de vida e nos parasitas mutantes obtidos. Através dessas análises foi possível identificar um grupo de 5 genes para os quais padrão de expressão acompanha ao da proteína TcZC3H31, ou seja, seus mRNAs estão aumentados quando a proteína está superexpressa e diminuídos quando a proteína está ausente (nocaute gênico). Palavras-chave: Trypanosoma cruzí. CCCH zínc fíngers. Regulação da expressão gênica. Regulação pós-transcricional. Metaciclogênese. / Abstract: The protozoan parasite Trypanosoma cruzí is the causative agent of chagas disease and presents unusual gene expression and organization features. For example, genes are arranged in polícístrons, transcripts are processed through a trans splícíng reaction, and their genome lacks the classic RNA Polymerase li promoters and encodes only a few transcription factors. Those features suggest that the differential regulation of gene expression, required for the complexity of their life cycle, is controled at the posttranscriptional level, mainly through eis contrai elements, which are generally present in the untranslated regions (UTRs) of mRNAs and trans-acting factors, such as RNAbinding proteins (RBPs). The CCCH zínc fínger proteins are characterized by the presence of three cystein and one histidine residues that coordinate the zinc ion in the motif C-X718-C-X5-C-X3-H. They are RNA binding proteins that contrai mRNA processing, stability, distribution and translation. The aim of the present work was to to examine the role that the TcZC3H31 (a three CCCH zínc fínger motifs-containing protein) plays during the life cycle of T. cruzí. TcZC3H31 is almost exclusively expressed in the epimastigote and metacyclic trypomastigote forms. During cell division (G2, mytose and cytokinesis phases) TcZC3H31 was concentrated in structures, which were not observed in the G1 phase. T. cruzí null mutant for TcZC3H31 gene is not able to undergo differentiation to metacyclic trypomastigote forms, whereas TcZC3H31- superexpressing parasites differentiate more efficiently than wild type counterpart. These data suggest that TcZC3H31 protein is essential for T. cruzí differentiation. RNA immunoprecipitation followed by sequencing (ribonomic assays) identified the TcZC3H31 mRNA targets. Most of them encode for protein kinases. The expression pattern of some targets through the life cycle and in the mutant parasites was measured by quantitative PCR. This analysis enabled the identification of a 5 genes group wich showed an expression pattern similar to the expression of TcZC3H31 protein, with an increase of these mRNAs in response to the protein overexpression and a decrease in the protein absence (gene knockout). Key words: Trypanosoma cruzí. CCCH zínc fíngers. Gene expression regulation. Postranscriptional regulation. Metacyclogenesis.

Made available in DSpace on 2015-05-22T12:36:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000468555-Texto+Completo-0.pdf: 8199104 bytes, checksum: 8319f77be38697b0864185d6a700fdf3 (MD5) Previous issue date: 2015 / Glioblastoma (grade IV) is among the most prevalent primary intracranial tumors and is considered a challenge in oncology and neurosurgery due to the highly aggressive nature, and the elevated mortality rates. The location of the tumor and its invasive nature avoid the standard-of-care therapy, which includes surgical resection followed by radiotherapy and chemotherapy. Nevertheless, the current gold standard treatment has not been effective to prevent tumor evolution, as indicated by the poor survival rates. In this context, we analyzed the GPCRs for kinin and the high-voltagegated calcium channels (VGCC) as feasible new therapeutic approaches in malignant gliomas. Thereby, the signaling triggered by bradykinin or the disruption of calcium signaling might contribute with pivotal mechanisms underlying glioma progression, such as cell proliferation. Therefore, the aim of this study was to further evaluate the relevance of B1 (B1R) and B2 (B2R) kinin receptors as well as the P/Q- and N-type VGCC in glioma development, by using in vitro and in vivo glioma model. Cell culture assay showed that the treatment with the selective B1R des-Arg9-BK (1-100 nM) and B2R BK (1-100 nM) agonists induced a marked enhancement of cell proliferation and viability through ERK1/2 and PI3K/Akt signaling, according to evaluation of U-138MG and U-251MG cell lines. Meanwhile, the incubation of either B1R SSR240612 (1-30 μM) or B2R HOE-140 (1-100 μM) antagonists induced a marked cell death with mixed apoptosis/necrosis characteristics. The in vivo mouse model of GL261-induced glioma of C57/BL6 or B1R and B2R knockout mice showed an uncontrolled tumor growing in KOB1R mice. Conversely, there was no significant change of the tumor development in KOB2R mice. Notably, the genetic ablation or the pharmacological combined antagonism of B1R and B2R (SSR240612; 25 nmol/site + HOE-140; 50 pmol/site) diminished the tumor progression as well as the mitotic index of the GL261-induced glioma. To understand the potential anti-tumor effects of the blockade of P/Q- and Ntype VGCC, we used animal-derived inhibitors namely PhTx3-3 (P/Q-type blocker) and Phα1β (N-type blocker) from P. nigriventer, or MVIIC (P/Q-type blocker) and MVIIA (N-type blocker) from C. magus. The PhTx3-3 (0. 3 - 100 pM), Phα1β (0. 3 - 100 pM) and MVIIA (0. 3 - 100 pM) displayed a significant inhibitory effect on proliferation and viability of M059J, U-138MG and U-251MG glioma tested cell lines, and evoked cell death mainly with apoptosis characteristics. In the glioblastoma in vivo model, the Ntype VGCC blockade by either Phα1β (50 pmol/site; i. c. v. and i. t. ) or MVIIA (10 pmol/site; i. c. v. ) caused significant reductions of glioma growth and progression. Of note, the N-type inhibition by Phα1β and MVIIA led to a marked increase of GFAPactivated astrocytes and Iba-1-positive microglia in the peritumoral area, which might be related to the inhibitory effects of immune system in tumor development. Using molecular and pharmacological approaches, our data provide clear evidence on the beneficial effects of the simultaneous inhibition of both B1R and B2R as well as the P/Q- and N-type blockade on glioma development. Thus, we propose that the combined selective antagonism of B1R and B2R, such as the P/Q-, and especially N type high-VGCC inhibition could markedly modify the tumor progression, which might represent an attractive alternative for the treatment of malignant gliomas in the future. / O glioblastoma apresenta a maior incidência entre todos os gliomas e se caracteriza como o mais agressivo e fatal (grau IV) dos tumores primários do SNC. Atualmente o glioblastoma é considerado uns dos grandes desafios da oncologia e da neurocirurgia, devido ao seu caráter altamente agressivo. A sobrevida média dos pacientes é bastante baixa e o prognóstico é desfavorável, já que a grande maioria destes tumores apresenta um padrão difuso e infiltrativo de crescimento, o que dificulta as abordagens atuais para a terapia tumoral. Neste estudo foram analisados os efeitos dos receptores da família dos GPCRs de cininas e dos canais de cálcio voltagemdependentes (CCVD) como base para possíveis alvos no tratamento dos gliomas malignos, a fim de caracterizar novas abordagens terapêuticas. O efeito da sinalização desencadeada pela BK e da sinalização Ca2+-dependente pode estar envolvida na regulação do crescimento e progressão dos gliomas e na migração das células tumorais. Neste sentido, este trabalho visou explorar o papel dos receptores B1 (B1R) e B2 (B2R) de cininas e da sinalização de Ca2+ via CCVD tipo-P/Q e -N em modelo de glioma in vitro e in vivo. Ensaios em cultura celular utilizando as linhagens de glioma humano U-138MG e U-251MG demonstraram que a ativação dos B1R e B2R pelo uso dos agonistas desarg 9-BK (1-100 nM) e BK (1-100 nM) aumentou a proliferação das linhagens celulares testadas, através da ativação das vias ERK1/2 e PI3K/Akt. Enquanto que a exposição aos antagonistas seletivos para estes receptores, SSR240612 (1-30 μM) e HOE-140 (1- 100 μM), provocou intensa morte celular com características de necrose/apoptose. A parte in vivo compreendeu a técnica de implante das células GL261 de glioma (grau IV) em animais C57/BL6 e knockout para os B1R e B2R. A deleção apenas do B1R provocou um importante crescimento tumoral nos animais knockout para este receptor, enquanto que os animais com deleção de B2R não tiveram o desenvolvimento tumoral alterado. Notavelmente, tanto a deleção gênica como o antagonismo farmacológico combinado dos receptores B1 e B2 (SSR240612; 25 nmol/sítio + HOE-140; 50 pmol/sítio) diminuiu o crescimento tumoral e o índice mitótico dos gliomas implantados. Para compreender o envolvimento dos CCVD tipo-P/Q e -N na fisiopatologia dos gliomas foram utilizadas frações da toxina da aranha Phoneutria nigriventer (PhTx3-3 bloqueadora de canais do tipo-P/Q; Phα1β bloqueadora de canais do tipo-N) e ω-conotoxinas provenientes do Conus magus (MVIIC bloqueadora de canais do tipo- P/Q; MVIIA bloqueadora de canais do tipo-N). Os experimentos in vitro evidenciaram que o bloqueio dos canais de Ca2+ tipo-P/Q e -N pelas toxinas PhTx3-3 (0. 3 - 100 pM), Phα1β (0. 3 - 100 pM) e MVIIA (0. 3 - 100 pM) inibiram a proliferação e a viabilidade das linhagens celulares M059J, U-138MG e U-251MG de glioma humano, com intensa característica de morte celular por apoptose. Os resultados utilizando o modelo de glioblastoma in vivo, demonstraram que ambas as toxinas bloqueadoras dos canais do tipo-N, Phα1β (50 pmol/sítio) e MVIIA (10 pmol/sítio), foram efetivas em diminuir o crescimento e a progressão tumoral nos animais tratados, com intensa ativação de astrócitos e micróglia, destacando o possível envolvimento do sistema imune na inibição do crescimento tumoral. Através do uso de ferramentas moleculares e farmacológicas, nossos resultados demonstraram o envolvimento importante tanto dos B1R e B2R de cininas, como dos CCVD tipo-P/Q e -N no desenvolvimento dos gliomas malignos. Desta maneira, podemos propor que o bloqueio farmacológico combinado de antagonistas seletivos para os receptores B1 e B2, assim como a inibição dos CCVD tipo-P/Q e -N surgem como potenciais alvos terapêuticos no manejo dos tumores cerebrais e podem representar alternativas promissoras no tratamento dos gliomas.

Made available in DSpace on 2015-05-22T12:36:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000468567-Texto+Completo-0.pdf: 3711593 bytes, checksum: 32dee061e07f3464cbf1a35564001f4c (MD5) Previous issue date: 2014 / Eucalyptus is an economically important woody species, especially as a raw material in many industrial sectors. Brazil ranks the second worldwide position in acreage, totalizing approximately three million hectares. Eucalyptus species are very susceptible to pathogens such as Botrytis cinerea (gray mold), which leads to mortality of cuttings in rooting phase. Biological control of plant diseases using soil microorganisms has been considered an alternative to reduce the use of pesticides and pathogen attack. Plant growth promoting rhizobacteria can act directly on plant development for production of phytohormones or indirectly as antagonists to pathogens, as well as promote changes in secondary metabolism, and hence inducing of systemic resistance. In this study, the direct roleof Streptomyces isolates in plant development was evaluated through the production of auxin and rhizogenic potential in Eucalyptus grandis and E. globulus plants, as well as indirectly, by modulation of the secondary metabolism, and induction of sistemic resistence in plantselicited with Streptomyces sp. and challenged with the pathogenic fungus B. cinerea. Metabolic responses were evaluated throughactivity of plant defense enzymes (PPO and POX) and induced secondary compounds (total phenolics and quercetinic-flavonoids fraction). The incidence and progression of gray mold disease on plants elicited Streptomyces sp. PM9, and coculture of these microorganisms (Streptomyces and B. cinerea) were also evaluated. Streptomyces sp. PM5 and PM9 isolates produced more auxin than the other isolates tested. Streptomyces sp. PM9 showed the highest rhizogenic potential on Eucalyptus sp. and modulated secondary metabolism of these plants. Antagonism of this isolated over B. cinerea was evidenced. Plants elicited with Streptomyces sp. PM9 and challenged with B. cinerea showed changes in PPO and POX enzymes and levels of phenolic compounds at different time points of analysis, which may be related to initial defense response. Phenolic compounds chlorogenic acid and gallic acid were, on average, the most abundant, while caffeic acid, benzoic acidand catechin were induced at specific time points. A delay in the onset of disease was significant in plants of E. grandis elicited with Streptomyces. The induction of resistance, disease delay and antagonism against B. cinereaindicate the capacity of Streptomyces sp. PM9 as an inducer of plant systemic resistance, and poses this microorganism as a potential candidate for biological control programs in nurseries of Eucalyptus. Interaction of rhizobacteria with eucalyptus plant, as well as the modulation of defense mechanisms may contribute to the establishment of new biocontrol strategies applied to forestry. / O eucalipto é uma espécie lenhosa economicamente importante, destacando-se como matériaprima em diversos setores industriais. O Brasil ocupa a segunda posição mundial em área plantada, totalizando aproximadamente três milhões de hectares. As espécies de eucalipto são muito suscetíveis a patógenos como Botrytis cinerea (mofo-cinzento), o qual leva à mortalidade de estacas em fase de enraizamento. O controle biológico de doenças em plantas utilizando microrganismos do solo tem sido considerado uma alternativa para reduzir o uso de agroquímicos e o ataque de patógenos. Rizobactérias promotoras de crescimento vegetal podem agir diretamente no desenvolvimento das plantaspela produção de fitormôniosou indiretamente, como antagonistas a fungos patogênicos, além de causar alterações no metabolismo secundário, com consequente indução de resistência sistêmica. Neste trabalho, avaliou-se a ação direta no desenvolvimento vegetal de isolados rizobacterianos do gênero Streptomyces através da produção de auxinas e potencial rizogênico de Eucalyptus grandis e E. globulus, bem como oefeito modulador no metabolismo secundárioe a indução de resistência sistêmica em plantas eliciadas com Streptomyces sp. e desafiadas com o fungo patogênico B. cinerea. As respostas metabólicas foram avaliadas através das atividades de enzimas realacionadas à defesa vegetal (PPO e POX) e dos compostos secundários induzidos (compostos fenólicos totais e fração flavonóides quercetínicos).A incidência e progressão da doença mofo cinzento em plantas eliciadas com Streptomyces sp. PM9, e cocultivo destes microrganismos (Streptomyces e B. cinerea) também foram avaliados. Os isolados de Streptomycessp. PM5 e PM9 apresentaram maior produção de auxina que os demais isolados testados. Streptomyces sp. PM9 apresentou o maior potencial rizogênico em plantas de Eucalyptus sp. emodulou o metabolismo secundário destas plantas. Oantagonismo deste isolado sobre B. cinerea foi evidenciado. As plantas eliciadas com Streptomyces sp. PM9 e desafiadas com B. cinereaapresentaram alterações nas enzimas PPO e POXe nos níveis de compostos fenólicos totais em diferentes tempos de análise, as quais foram relacionadas à resposta inicial de defesa. Os compostos fenólicos ácido gálico e clorogênico foram, em média, os mais abundantes, embora os ácidos cafeico e benzoico e a catequina tenham sido induzidos em momentos específicos. O retardo no estabelecimento da doença foi significativo em plantas de E. grandis eliciadas com Streptomyces. Os resultados de indução de resistência, retardo da doença eantagonismocontra B. cinerea, demonstram a capacidade de ação de Streptomycessp. PM9 como indutor de resistência sistêmica vegetal, colocando este microrganismo como potencial candidato aos programas de controle biológico em viveiros de mudas de Eucalyptus. A interação da planta de eucalipto com a rizobactéria, bem como a modulação dos mecanismos de defesa podem contribuir para o estabelecimento de novas estratégiasde biocontrole aplicado à silvicultura.

Made available in DSpace on 2015-05-22T12:36:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000468517-Texto+Completo-0.pdf: 6892081 bytes, checksum: c5aa659f71c5093d831d4810c3ab482c (MD5) Previous issue date: 2014 / The understanding of gene function in the externally visible characteristcs (EVC) expression has several uses in human population evolution studies or in forensic investigations. To this last, some effort has been done to discover an efficient and easy model for prediction of skin and eye color in humans. The obvious advantage of the prediction of such EVCs through the use of DNA is to be incorporated as routine in forensic labs and to be applied to police investigations. In our study we combined the genotyping of eight SNPs in pigment-related genes (rs4778138 - OCA2; rs12913832 - HERC2; rs16891982 - SLC45A2; rs8045560 - MC1R; rs1426654 - SLC24A5; rs2733832 - TYRP1; rs1042602 - TYR; rs916977 - HERC2) with different analytical approaches. Considering this SNP panel we evaluated allele frequencies from HAPMAP and ALFRED data obtained from subjects with High Melanin Content (HMC; from African populations), and Low Melanin Content (LMC; from European populations) and defined the alleles H (to predict HMC subjects) and alleles L (to predict LMC subjects). The cumulative distribution of alleles H and alleles L in two phenotypically different color groups of 134 South Brazilian subjects showed that 82% of HMC subjects (N = 61) had eight or more allele H and 100% of LMC subjects (N = 73) had less than eight allele H, with accuracy value of 96. 3%.We performed other analyses using AUC (Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve), PGL (Calculation of Pathway Genetic Load), and GP (Genetic Probability) approaches. The AUC was 0. 99 in predicting both HMC and LMC phenotypes; PGL showed the eight SNPs panel had 93% of concordance between genotype and HMC or LMC phenotypes; and GP approach showed 91% of concordance between prediction and HMC or LMC phenotypes. Our high-throughput genotyping technology combined with different analytical approaches reached very high accuracy to predict the extreme phenotypes of human pigmentation. We believe this forensic DNA phenotyping (FDP) technique would be particularly useful in cases in which the genetic profiles of crime scenes were not found in the DNA data banks or to help classify degraded cadavers skeletons, or biological clues of dismissed people. / A compreensão da função e expressão dos genes envolvidos nos traços externamente visíveis (EVC; do inglês externally visible characteristics) têm sido amplamente utilizada em vários estudos de evolução humana e investigações forenses. Para este último propósito, vários esforços têm sido feitos para descobrir um modelo eficiente e fácil para a predição da cor da pele e dos olhos em seres humanos. A vantagem óbvia da predição de tais EVCs, através da utilização do DNA, é sua incorporação na rotina em laboratórios forenses, sendo assim aplicada em investigações policiais. Em nosso estudo, relacionamos o genótipo de oito SNPs em genes relacionados com a pigmentação (rs4778138 - OCA2; rs12913832 - HERC2; rs16891982 - SLC45A2; rs8045560 - MC1R; rs1426654 - SLC24A5; rs2733832 - TYRP1; rs1042602 - TYR; rs916977 - HERC2) com diferentes abordagens analíticas. Este painel de SNPs considerou as frequências alélicas obtidas de dados do HapMap e Alfred a partir de indivíduos com Alto Conteúdo de Melanina (HMC; do inglês High Melanin Content; a partir de populações africanas), e Baixo Conteúdo de Melanina (LMC; do inglês Low Melanin Content; a partir de populações europeias) e definiu os alelos H (para predizer os HMC) e alelos L (para predizer os LMC). A distribuição cumulativa dos alelos H e L nos dois grupos com características de pigmentação fenotipicamente distintas, dos 134 indivíduos da nossa população, mostrou que 82% dos indivíduos HMC (N = 61) tinham oito ou mais alelos H e 100% dos indivíduos de LMC (N = 73) tinham menos de oito alelo H, com o valor de precisão de 96,3%.Outras abordagens como AUC (do inglês; Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve), cálculo de PGL (do inglês; Pathway Genetic Load) e GP (do inglês; Genetic Probability) foram realizadas. A análise AUC foi de 0,99 tanto para a predição fenotípica dos HMC quanto LMC; as análises PGL, para o painel com 8 SNPs, teve 93% de concordância genótipo-fenótipo nos HMC ou LMC; e a abordagem GP mostrou 91% de concordância para predição dos fenótipos HMC e LMC. Nossa tecnologia de genotipagem de alto rendimento, combinada com diferentes abordagens analíticas, chegou a uma precisão muito alta para predizer os fenótipos extremos de pigmentação humana. Acreditamos que esta técnica de fenotipagem forense pelo DNA (FDP; do inglês forensic DNA phenotyping), seria particularmente útil nos casos em que os perfis genéticos de locais de crime não fossem encontrados no bancos de dados de DNA ou para ajudar a classificar cadáveres degradados, esqueletos, ou vestígios biológicos de pessoas desaparecidas.

Made available in DSpace on 2015-07-09T02:04:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000471802-Texto+Parcial-0.pdf: 3735530 bytes, checksum: 4d5d2bdf0acc100c891cf110e11d4904 (MD5) Previous issue date: 2015 / Biomolecular recognition processes are intrinsically related to protein flexibility. To understand how ligands interact with its partners, how proteins can cooperate with each other, or why aggregation process occurs, are particularly important, not only to biophysics, but also in the rational drug design process. X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance, and molecular dynamics simulations are broadcasted approaches used to try to comprehend flexibility in biological macromolecules, although, this is not an easy task. This Ph. D. thesis will discuss the role of the flexibility using two different systems, (i) Mycobacterium tuberculosis EPSP synthase and (ii) Calmodulin from Mus musculus. Our main goal with this first system was to analyse in detail the structural information of the EPSP synthase, using molecular dynamics simulation. As a result, we have hypothesised how EPSP synthase flexibility could affect its activity, as well as its implications in the process of molecular docking experiments. Calmodulin project was developed during a ten month internship at the University of Cambridge. Our main goal was to study the influence of peptide mutated sequences in the process of molecular recognition, using nuclear magnetic resonance and isothermal titration calorimetry. As a product of this work, we have observed the impact of the linker domain to the peptide recognition, as well as, we have presented the importance of the entropy‐ enthalpy balance in the association with Calmodulin. / O reconhecimento biomolecular está diretamente ligado à capacidade de uma proteína a suportar mudanças conformacionais, ou seja sua plasticidade. Compreender como ocorre a associação de ligantes com seus receptores, como proteínas se interrelacionam, porque ocorrem os processos de agregação, são de extrema importância, não apenas para a área da biofísica, como também para o desenho racional de fármacos. Técnica como cristalografia por difração de raios X, ressonância magnética nuclear e dinâmica molecular, são algumas das principais abordagens para o estudo da flexibilidade em macromoléculas biológicas. No entanto, esta não é uma tarefa simples. Esta tese de doutorado versará sobre o papel da flexibilidade em dois sistemas distintos, (i) a enzima EPSP sintase de Mycobacterium tuberculosis e (ii) a proteína Calmodulina de Mus musculus.A Parte 1 trará como modelo de estudo a enzima EPSP sintase de Mycobacterium tuberculosis. O nosso objetivo com esta parte foi analisar em detalhes as informações estruturais desta enzima, por meio da técnica de dinâmica molecular. Como resultados, propomos como a flexibilidade pode atuar na modulação da atividade enzimática, a hipótese dos cinco mínimos locais de energia, bem como, suas implicações para o processo de docagem molecular a partir de uma estrutura. A Parte 2 foi desenvolvida durante o período de doutorado sanduíche e teve como alvo a proteína Calmodulina de Mus musculus. O objetivo na Parte 2 desta tese foi estudar a influência de mutações no processo de reconhecimento molecular com a Calmodulina, por meio das técnicas de ressonância magnética nuclear e calorimetria por titulação isotérmica. Como resultados, observamos a influência da região de dobradiça para o reconhecimento dos peptídeos avaliados, bem como, um processo de balanço entrópico‐entálpico na associação destas moléculas.

Made available in DSpace on 2015-07-22T02:04:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000472479-Texto+Completo-0.pdf: 1633754 bytes, checksum: 4a4e4307d99c258ef92fc1b916f00e9e (MD5) Previous issue date: 2015 / Potato is currently the third most consumed food crop after rice and wheat, and it is a valuable resource for alleviating poverty in undeveloped countries. However, potato crop fields are attacked by numerous pests and pathogens, which represent a threat to the global potato production. Unlike animals, plants do not possess an adaptive immune system. Therefore, each individual plant cell needs to be able to perceive the pathogen, release signals to neighbor cells, and produce a defense response. Plant cells recognize the pathogen through Pattern Recognition Receptors (PRRs), triggering a signaling cascade that results in the activation of defense-related genes, which characterize the occurrence of Systemic Acquired Resistance (SAR). Among the factors involved in the regulation of defense-related genes, salicylic acid is widely known as an elicitor of plant defense against biotrophic pathogens. Besides this hormone, it has been demonstrated that a bacterial extract of Xanthomonas axonopodis pv. citri (referred to as XTH) is capable of inducing resistance against pectolytic bacteria via poorly understood mechanisms. Considering the different signaling pathways involved in plant defense, we intended to investigate the occurrence of systemic resistance in Solanum tuberosum plants treated with XTH or salicylic acid, by analyzing the expression of PR-1b, PR-2, ChtA, PAL, Pin2, JAZ1/TIFY10A, and ERF1 genes. Our results suggest that XTH is capable of inducing systemic resistance in potato plants via concomitant activation of the salicylic acid, jasmonic acid, and ethylene signaling pathways. / A batata é atualmente o terceiro alimento mais consumido no mundo, depois do arroz e do trigo, além de ser um recurso importante no combate à fome em países subdesenvolvidos. Entretanto, plantas de batata são atacadas por diversas pragas e patógenos, que representam uma ameaça à produção global de tubérculos. Ao contrário dos animais, as plantas não possuem um sistema imune adaptativo. Dessa forma, as plantas dependem que cada célula, individualmente, tenha a capacidade de perceber o patógeno, sinalizar às células vizinhas e produzir uma resposta de defesa. As células vegetais percebem o contato do patógeno através de Receptores de Reconhecimento de Padrões (PRRs), desencadeando cascatas de sinalização que levam à ativação de genes de defesa, os quais caracterizam a ocorrência de Resistência Sistêmica Adquirida (SAR). Dentre os fatores envolvidos na regulação de genes relacionados à defesa, o ácido salicílico é amplamente conhecido como um eliciador da defesa vegetal contra patógenos biotróficos. Além deste hormônio, foi demonstrado que o extrato bacteriano de Xanthomonas axonopodis pv. citri (denominado de indutor XTH) possui a característica de induzir resistência contra fitobactérias pectolíticas através de mecanismos ainda pouco conhecidos. Considerando as diferentes vias de sinalização envolvidas na defesa vegetal, pretendeu-se investigar a ocorrência de resistência sistêmica em plantas de Solanum tuberosum tratadas com indutor XTH ou ácido salicílico, através da análise transcricional dos genes PR-1b, PR-2, ChtA, PAL, Pin2, JAZ1/TIFY10A e ERF1. Os resultados sugerem que o indutor XTH tem a capacidade de induzir resistência sistêmica em plantas de batata através da ativação concomitante das vias de sinalização do ácido salicílico, jasmonato e etileno.

Orientador: Wesley Conde Godoy / Banca: Marcelo Nogueira Rossi / Banca: Hiraldo Serra / Banca: Lucas Del Bianco Faria / Banca: Claudio José Von Zuben / Resumo: Este estudo foi caracterizado pela combinação entre experimentação laboratorial e aplicação da teoria populacional. O trabalho foi subdividido em três partes intituladas: Análise de sobrevivência, estrutura de estágios e canibalismo em populações experimentais de Chrysomya albiceps; Curvas de sobrevivência e predação larval entre estágios de vida de Chrysomya albiceps e Modelo de interação intraguilda para predação larval: uma proposição teórica inicial para moscas-varejeiras. Os resultados foram estatisticamente avaliados principalmente com a aplicação de análise de sobrevivência e modelos matemáticos de estrutura de estágios de vida, crescimento populacional dependente da densidade e com formulações fundamentadas em modelos predador-presa. As análises exploraram principalmente a caracterização de padrões estatísticos e matemáticos sob a perspectiva da dinâmica populacional intra e interespecífica. O resultados foram discutidos à luz das teorias populacionais empregadas, dos dados empíricos obtidos e do conteúdo teórico-empírico existente dentro e fora do grupo taxonômico estudado. / Abstract: One important attribute for individuals of a species is the existence of age classes and life stages. Within each age class, the individuals of a species behave differently, have different types of dependence on the environment and different resource needs. Population dynamics has more frequently been studied in insects with simple mathematical models, which include no stage structure. They provide essential information in terms of temporal and/or spatial dynamics. However, there are several examples of insect species, which exhibit important interactive processes in specific life-stages. The objective of the present study was investigate the population dynamics of C. albiceps employing a combination of mathematical models, survival analysis and laboratory experiments, focusing on survival among life stages and its structure. The study also considered the influence of density-dependence and cannibalism during immature stages on the population dynamics of C. albiceps. The implications of the patterns of dynamic behavior obtained as well as the influences received from cannibalism and density dependence were discussed. / Doutor

Orientador: Reinaldo José Fazzio Feres / Banca: Maria Magdalena Vázquez Gonzalez / Banca: Fernando Barbosa Noll / Resumo: Opilioacaridae é um pequeno e raro grupo de ácaros de vida livre, com seus aspectos biológicos e ecológicos pouco conhecidos. Das 37 espécies conhecidas no mundo, 15 são encontradas no Novo Mundo, sendo 12 pertencentes ao gênero Neocarus e as outras três pertencentes ao gênero Caribeacarus, podendo ser diagnosticados pelas setas modificadas no tarso do palpo e no telotarso da perna I. Apesar das descrições recentes, não existe uma proposta de parentesco entre suas espécies. Com intuito de preencher esta lacuna, apresenta-se a primeira hipótese de relacionamento filogenético entre as espécies de Neocarus. Do material analisado, 20 táxons terminais e 37 caracteres foram incluídos na análise. Utilizou-se o NONA com 1000 replicações e 100 árvores armazenadas por replicação, com pesagens iguais de caracteres, através da busca heurística TBR, utilizando a otimização ACCTRAN e o WinClada como interface. A análise filogenética produziu 20 árvores igualmente parcimoniosas com 73 passos, com índice de consistência 68 e índice de retenção 74. A árvore de consenso estrito encontrada apresentou 83 passos, índice de consistência 60 e índice de retenção 63. Para verificar o suporte dos ramos, foi utilizado o índice de Bremer, com 1000 replicações e considerando árvores com 5 passos adicionais. O monofiletismo de Neocarus não foi observado, sendo parafilético em relação à Caribeacarus, com as relações entre suas espécies não totalmente estabelecidas, apresentando politomias. O material tipo de algumas espécies não pôde ser obtido para análise taxonômica, assim como algumas estruturas não puderam ser observadas. A espécie Neocarus ojastii se enquadra na diagnose de Caribeacarus, sugerindo-se uma nova combinação, bem como a espécie N. calakmulensis que pode se tratar de uma sinonímia de N. nicaraguensis / Abstract: Opilioacaridae is a small and rare group of free-living mites, their biological and ecological aspects unfamiliar. Of the 37 known worldwide species, 15 are found in the New World, which 12 belong to the genus Neocarus and the other three belong to the genus Caribeacarus and can be diagnosed by the setae in the modified tarsus of palp and telotarsus I. Despite recent descriptions, there is no proposed relationship between their species. In order to fill this gap, we present the first hypothesis of phylogenetic relationships among species of Neocarus. Of the material analyzed, 20 characters and 37 terminal taxa were included in the analysis. We used NONA with 1000 replicates and 100 trees stored for replication, with equal weights of characters through the TBR heuristic search using the ACCTRAN optimization and WinClada as interface. Phylogenetic analysis produced 20 equally parsimonious trees with 73 steps, with a consistency index of 68 and a retention index of 74. The strict consensus tree had found 83 steps, consistency index 60 and 63 retention rate. To check the support of branches was used Bremer index, with 1000 replications and considering trees with 5 additional steps. The monophyly of Neocarus was not observed, being paraphyletic with respect to Caribeacarus, and the relationships between their species is not fully established, presenting polytomies. The type material of some species could not be obtained for taxonomic analysis, as well as some structures could not be observed. The Neocarus ojastii fits the diagnosis of Caribeacarus, suggesting a new combination, as well N. calakmulensis that can treat a synonymy of N. nicaraguensis / Mestre

Orientador: Mary Massumi Itoyama / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo-Oliveira / Banca: Fernanda Cristina Alcântara dos Santos / Resumo: Heteroptera é uma Subordem da Ordem Hemiptera, que possui cerca de 40 mil espécies distribuídas em oitenta famílias, dentre elas está a família Pentatomidae que se destaca por ser uma das maiores famílias com cerca de 4.100 espécies, representando, aproximadamente, 11% do total de espécies de Heteroptera. As espécies de Pentatomidae Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris e Thyanta perditor foram estudadas nesse trabalho devido ao sua importância econômica, tendo em vista que são espécies fitófagas que causam grandes perdas em diversas culturas. Os machos das espécies foram coletados na região de São José do Rio Preto, os testículos foram fixados e posteriormente processados para analise em microscopia eletrônica de transmissão, os blocos obtidos foram trimados, cortados, contrastados e analisados com microscópio eletrônico de transmissão Leo - Zeiss, do Centro de Microscopia e Microanálise (IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP) e com o microscópio eletrônico de transmissão Jeol JEM - 100 CXII da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP). As eletromicrografias das espécies estudadas apresentaram características ultraestruturais semelhantes às encontradas para diversos indivíduos de diferentes ordens, dentre essas características estão a formação do acrossomo, a partir de uma grande vesícula secretada pelo complexo de Golgi e que se localiza na região apical/lateral do núcleo. O núcleo, também, sofre transformações semelhantes às relatadas para grande parte dos insetos passando de um estado grande e esférico com a cromatina dispersa para um estado pequeno e fusiforme e com a cromatina extremamente condensada. Outra estrutura observada foi o adjunto do centríolo que se mostrou uma estrutura eletrondensa na região basal do núcleo. Também foi observada a migração das mitocôndrias para um polo celular... / Abstract: Heteroptera is a suborder of the Hemiptera order, which has approximately 40,000 species distributed in eighty families, among them is the Pentatomidae family that stands out for being one of the largest families with approximately 4,100, representing approximately 11% of the total species of Heteroptera. The species of Pentatomidae Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris and Thyanta perditor were studied in this work because of their economic importance, given that they are phytophagous species that cause great losses in several crops. Males of the species were collected in the region of São José do Rio Preto, the testes were fixed and then processed for analysis by transmission electron microscopy, the obtained blocks were trimmed, cut, contrasted and analyzed with transmission electron microscope Leo - Zeiss, of the Centro de Microscopia e Microanálise (IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP) and the transmission electron microscope Jeol JEM - 100 CXII of Faculdade de Medicina of Ribeirão Preto (FMRP-USP). The species have similar ultrastructural characteristics to those found in many individuals of different orders, among these features is the acrosome formation from a large vesicle secreted by Golgi apparatus and located in the apical/lateral area of the nucleus. The nucleus also undergoes changes similar to those reported for most insects, passing of a great and spherical state with chromatin dispersed to a small and fusiform state and highly condensed chromatin. Another structure was observed the centriolar adjunct that showed electrodense structure in the basal region of the nucleus. We also observe the migration of mitochondria for the cell and its subsequent fusion was observed forming the mitochondrial complex or "Nebenkern", which later splits to form two symmetrical mitochondrial derivatives, with the presence of paracrystalline structures / Mestre

Orientador: Mary Massumi Itoyama / Banca: Patrícia Simone Leite Vilamaior / Banca: Maria Etelvina Pinto Fochi / Resumo: A Subordem Heteroptera contém cerca de 75 famílias, incluindo Coreidae, na qual pertencem as espécies Corecoris fuscus, Leptoglossus gonagra, L. zonatus e Sphictyrtus fasciatus, analisadas no presente trabalho. Os indivíduos dessa família são conhecidos por serem exclusivamente fitófagos e alimentam-se de plantas de valor comercial. Apesar da grande diversidade desta subordem, há poucos estudos relacionados com a ultraestrutura da espermátide dessas espécies. Assim, nesse trabalho, por meio da microscopia eletrônica de transmissão, foi analisado o desenvolvimento da espermiogênese na cabeça e no flagelo, com ênfase na formação do acrossomo, do adjunto do centríolo e dos derivados mitocondriais. O acrossomo tem origem a partir do complexo de Golgi, por meio da formação de uma vesícula pró-acrossomal e concomitante a esse processo é formado o adjunto do centríolo. O acrossomo determina o polo anterior do espermatozoide e o adjunto do centríolo determina o polo posterior. Observou-se também que no início do processo espermiogênico, as mitocôndrias encontram-se espalhadas no citoplasma, então gradualmente se fundem e dão origem ao complexo mitocondrial, o qual se divide, posteriormente, em duas subestruturas, denominadas derivados mitocondriais. Essas se posicionam bilateralmente ao axonema, o qual possui o padrão típico de disposição dos microtúbulos de 9 + 9 + 2. O processo de formação do acrossomo e dos derivados e a conformação dos microtúbulos do axonema são típicos de insetos. Além do padrão de microtúbulos do axonema, foram encontradas características sinapomórficas de Heteroptera, como a presença de duas estruturas paracristalinas em cada derivado mitocondrial e a presença de pontes que ligam os derivados mitocondriais ao microtúbulos axonemais, os quais são ferramentas importantes para auxiliar análises filogenéticas e taxonômicas / Abstract: The suborder Heteroptera contains about 75 families, including Coreidae, to which the species Corecoris fuscus, Leptoglossus gonagra, L. zonatus and Sphictyrtus fasciatus belong. Individuals of this family are known for being exclusively phytophagous and feeding on commercially valuable plants. Despite this suborder great diversity, there are only few studies on the ultrastructure of these species spermatid. Thus, in this study, through transmission electron microscopy, we analyzed the development of spermiogenesis in the head and the flagellum of C. fuscus, L. gonagra, L. zonatus and S. fasciatus, with emphasis on the formation of the acrosome, of the centriole adjunct and on development of mitochondrial derivatives. The acrosome originates from the Golgi complex through the formation of a pro-acrosomal vesicle and concomitant to this process, is formed the centriole adjunct. The acrosome determines the anterior pole of the sperm and the centriole adjunct determines the posterior pole. It was also observed that at the beginning of the spermiogenic process, the mitochondria are scattered within the cytoplasm, then gradually fusing and originating the mitochondrial complex, which is subsequently divided into two substructures, called mitochondrial derivatives. They are positioned bilaterally to the axoneme, having the typical pattern arrangement of the microtubule, which is 9 + 9 + 2. The process of acrosomes and derivatives formation and the conformation of axoneme's microtubules are typical of insects. Besides the pattern of axoneme's microtubules, synapomorphic features of Heteroptera were found, as the presence of two paracrystalline structures in each mitochondrial derivative and the presence of bridges connecting derivatives mitochondrial to the axonemal microtubules, which are important tools to assist in phylogenetic and taxonomic analyzes / Mestre