No description available.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422149-Texto+Completo-0.pdf: 415747 bytes, checksum: c509f9409deb999a7bde0e7f31c283e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Salmonella Enteritidis is a common foodborne pathogen that causes gastroenteritis and systemic infections in humans. The characterization of this bacterium is essential for epidemiological studies. In this context, two molecular methods, MLST and FAFLP, were tested for characterization of 32 S. Enteritidis isolates obtained from South of Brazil, as well as five isolates obtained from other geographical areas. Four isolates of different serovars of Salmonella (S. Panama, S. Senftenberg, S. Typhimurium and Salmonella [4,5:-:1,2]) were included as outgroup. These two techniques were already used to analyze different Salmonella serovars, but this study is the first to use them to discriminate the same S. Enteritidis isolates. The MLST scheme was performed with two housekeeping genes (hemD and mdh) combined with two virulence genes (ssaQ and slyA) to improve the discriminatory power of method. Both methods presented high discriminatory indexes calculated by Simpson’s index of diversity, 0. 99 and 0. 88 for FAFLP and MLST, respectively. These methods were efficient to differentiate isolates of distinct Salmonella serovars, but did not distinguish isolates probable epidemiologically non-related, and also did not group isolates of same phage type. These results suggested that these two techniques can be used as a tool for the epidemiological molecular characterization of S. Enteritidis isolates. / A Salmonella Enteritidis é uma das principais bactérias causadoras de gastrenterite, também podendo ser responsável por doenças sistêmicas. A adequada caracterização deste microrganismo é essencial nos estudos epidemiológicos. Neste contexto, este estudo avaliou a utilização de dois métodos moleculares, Tipificação por Sequenciamento de Múltiplos loci (MLST) e Análise de Fragmentos Polimórficos Amplificados e Fluorescentes (FAFLP), para a diferenciação de 32 isolados de S. Enteritidis oriundos de diferentes fontes do sul do Brasil, bem como de cinco isolados de S. Enteritidis provenientes de outras áreas geográficas. Também foram incluídos neste estudo quatro isolados pertencentes a outros sorovares (S. Panama, S. Senftenberg, S. Typhimurium e Salmonella [4,5:-:1,2]. As duas técnicas escolhidas para este trabalho já foram empregadas concomitantemente para analisar diferentes sorotipos de Salmonella, mas este estudo é o primeiro a utilizá-las para a diferenciação de um mesmo grupo de isolados de S. Enteritidis. O esquema desenvolvido para o MLST incluiu a amplificação de fragmentos de dois genes constitutivos (hemD e mdh) combinado com dois genes de virulência (ssaQ e slyA), aumentando, assim, a capacidade discriminatória do método. Ambas as técnicas apresentaram altos índices de poder discriminatório, calculados pelo índice de diversidade de Simpson, 0,99 e 0,88 para FAFLP e MLST, respectivamente. Além disso, os métodos avaliados também mostraram-se eficientes na discriminação de isolados de diferentes sorovares de Salmonella. Entretanto, a FAFLP e a MLST não foram capazes de diferenciar isolados provavelmente não relacionados epidemiologicamente, bem como não agruparam isolados pertencentes a um mesmo fagotipo. Desta forma, os resultados obtidos sugerem que ambas as técnicas podem ser ferramentas úteis para a análise epidemiológica molecular de isolados de Salmonella, inclusive para um sorovar com grande homogeneidade genética como a S. Enteritidis.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448460-Texto+Completo-0.pdf: 1711084 bytes, checksum: 65dd3daa12164398aab7aa839028c683 (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis remains as one of the main cause of mortality worldwide due to a single infectious agent, Mycobacterium tuberculosis. The aroK-encoded Mycobacterium tuberculosis Shikimate Kinase (MtSK), shown to be essential for survival of bacilli, catalyzes the phosphoryl transfer from ATP to the carbon-3 hydroxyl group of shikimate (SKH), yielding shikimate-3-phosphate and ADP. Here we present purification to homogeneity, and oligomeric state determination of recombinant MtSK. Biochemical and biophysical data suggest that the chemical reaction catalyzed by monomeric MtSK follows a rapid-equilibrium random order of substrate binding, and ordered product release. Isothermal titration calorimetry (ITC) for binding of ligands to MtSK provided thermodynamic signatures of non-covalent interactions to each process. A comparison of steady-state kinetics parameters and equilibrium dissociation constant value determined by ITC showed that ATP binding does not increase the affinity of MtSK for SKH. In addition, there appears to be a positive free energy coupling of 3. 2 kJ mol-1 for SKH binding to MtSK:Mg2+ATP binary complex, which suggest that ATP displays negative cooperativity for SKH binding. We suggest that MtSK would more appropriately be described as an aroL-encoded type II shikimate kinase. Our manuscript also gives thermodynamic description of SKH binding to MtSK and data for the number of protons exchanged during this bimolecular interaction. The negative value for the change in constant pressure heat capacity (ΔCp) and molecular homology model building suggest a pronounced contribution of desolvation of non-polar groups upon binary complex formation. Thermodynamic parameters were deconvoluted into hydrophobic and vibrational contributions upon MtSK:SKH binary complex formation. Data for the number of protons exchanged during this bimolecular interaction are interpreted in light of astructural model to try to propose the likely amino acid side chains that are the proton donors to bulk solvent following MtSK:SKH complex formation. / A tuberculose se mantém como uma das principais causas de mortalidade ao redor do mundo devido a um único agente infeccioso, o Mycobacterium tuberculosis. O gene aroK que codifica a enzima Chiquimato quinase de Mycobacterium tuberculosis (MtSK), que se mostrou essencial para a sobrevivência do bacilo, catalisa a transferência de um grupo fosforil do ATP para o chiquimato (SKH), resultando em chiquimato-3-fosfato e ADP. O presente trabalho apresenta a purificação da proteína MtSK até a homogeneidade e a determinação de seu estado oligomérico em solução. Estudos bioquímicos e biofísicos apresentados nesta tese sugerem que a reação catalisada pela MtSK monomérica segue um mecanismo de equilíbrio rápido ordenado aleatório na adição dos substratos e uma liberação ordenada sequencial dos produtos. A análise por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) das interações não covalentes da enzima MtSK com diferentes ligantes resultou na determinação de assinaturas termodinâmicas para cada um desses eventos de ligação.A comparação entre as constantes de afinidade obtidas por espectrofotometria e ITC demostraram que o ATP não aumenta a afinidade da proteína MtSK pelo SKH. Além disso, foi determinada em + 3,2 kJ mol-1 a energia livre de acoplamento do SKH ao complexo binário MTSK:Mg2+ATP, sugerindo que o ATP possui uma cooperatividade negativa em relação ao SKH. Esse trabalho sugere que a MtSK deveria ser mais apropriadamente descrita como uma chiquimato quinase do tipo II codificada pelo gene aroL. Adicionalmente, estre trabalho demonstra a descrição termodinâmica do SKH se ligando a MtSK aonde os resultados sugerem o número de prótons que estão sendo trocados durante a interação bimolecular.O valor negativo encontrado para a capacidade calorífica em pressão constante (ΔCp) e o modelo molecular por homologia criado sugerem uma pronunciada contribuição na dessolvatação de grupos apolares relacionados à formação do complexo. As constantes termodinâmicas foram separadas na contribuição hidrofóbica e vibracional relacionadas à formação do complexo binário MtSK:SKH. Os resultados obtidos relacionados à transferência de prótons durante a formação do complexo binário foram analisados tendo como referência o modelo estrutural da enzima MtSK construído neste trabalho. De acordo com as cadeias laterais que fazem contato com o SKH no modelo proposto, se pode indicar que os aminoácidos Arg58 e Arg136 atuam como fonte de prótons durante a formação do complexo binário.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000397347-Texto+Completo-0.pdf: 984527 bytes, checksum: 31dff3f15a7d672c6b5eff5f99ffff0d (MD5) Previous issue date: 2007 / Acute Lung Injury (ALI) is a syndrome of acute respiratory failure that results from pulmonary inflammation and acute pulmonary edema caused by the increased permeability of the alveolar-capillary barrier. In ALI, capillary endothelium and alveolar epithelium damage occurs resulting from the release of proinflammatory molecules, mainly cytokines, as a response to systemic insults. Free radical production is another important pathologic mechanism mediated by neurophils, which are capable of developing several clinical disorders found in ALI. It is well known that endogenous glutamate production stimulates the release of many inflammatory mediators, including aracdonic acid metabolites, free radicals and nitric oxide (NO). The first report describing a possible involvement of NMDA receptors in pulmonary physiophatology was based on a treatment with a selective inhibitor to this receptor (MK-801) used for the prevention of pulmonary edema caused by the increase of NMDA instilled intratracheally in rats under mechanic ventilation. The aim of this study was to evaluate the use of NMDA receptor antagonist (MK-801) as a protection against the oxidative injury in experimental model of ALI. Adult male Wistar rats were used. The animals were randomly divided into four groups: (1) intratracheal instillation (I. T. ) of 1 mL isotonic saline (n=6); (2) ALI induction with intratracheal LPS (100 \g/100 g of body weight) plus treatment with saline administered intraperitoneally (I. P. ) after ALI (n=6); (3) ALI induction plus MK- 801 (0. 3 mg/kg administered I. P. ) after ALI (n=6); and (4) ALI induction plus MK-801 (0. 3 mg/kg administered I. T. ) after ALI (n=6). Twelve hours after the treatment, the animals were anesthetized for blood collection using retroorbital puncture and bronchoalveolar lavage (BAL) was collected as well. After that, the animals were killed by decapitation and lung tissue was colleted. The treatment with MK-801 promoted a decrease in the total protein concentration, LDH activity and in the total cell number in BAL. In the lung tissue we verified a decrease of the oxidative injury measured by TBARS and NO levels and an improvement in antioxidant levels such as CAT, SOD, GSH and SH. We also verified an improvement in the inflammatory process as observed by the histopathology analysis of lung tissue. The results obtained in this study let us to conclude that treatment with MK-801 promoted an improvement in the inflammatory process and antioxidant levels, as well as a decrease of the oxidative injury in rats with intratracheal LPS-induced ALI. / A lesão pulmonar aguda (LPA) é uma síndrome caracterizada por inflamação pulmonar aguda e persistente, com edema pulmonar devido ao aumento da permeabilidade vascular. Na LPA ocorre uma lesão do epitélio alveolar e do endotélio capilar por diferentes mediadores pró-inflamatórios, principalmente, pelas citocinas liberadas em resposta à grande variedade de insultos. A geração de radicais livres (RLs) é outro importante mecanismo de lesão utilizado pelos neutrófilos, que são capazes de gerar muitas das alterações encontradas na LPA. Sabe-se que a produção endógena de glutamato estimula uma variedade de mediadores inflamatórios, incluindo metabólitos do ácido araquidônico, RLs e óxido nítrico (NO). O primeiro relato de que os receptores NMDA poderiam estar envolvidos na fisiopatologia pulmonar ocorreu através da demonstração que o tratamento com um inibidor seletivo desse receptor (MK-801) prevenia o edema pulmonar provocado pelo aumento de NMDA instilado na traquéia de ratos sob ventilação mecânica.O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso do antagonista de receptor NMDA (MK- 801) como protetor no dano oxidativo em modelo experimental de LPA. Foram utilizados ratos Wistar, machos. Os animais foram divididos em 4 grupos experimentais: Grupo 1: Injeção intratraqueal (I. T. ) de 1 mL de solução salina (n=6); grupo 2: Indução da LPA através da injeção de LPS intratraqueal (100 \g/100 g de peso corporal) e tratamento com solução salina intraperitoneal (I. P. ) após indução da LPA (n=6); grupo 3: Indução da LPA e tratamento com MK-801 (0. 3 mg/kg I. P. ) após indução da LPA (n=6) e grupo 4: Indução da LPA e tratamento com MK-801 (0. 3 mg/kg I. T. ) após indução da LPA (n=6). Doze horas após o tratamento, os animais foram anestesiados para a retirada do sangue por punção retro-orbital, coleta do lavado broncoalveolar (LBA) e posteriormente, submetidos à eutanásia por decapitação para coleta do tecido pulmonar.O tratamento com MK-801 promoveu uma diminuição na concentração de proteínas totais, uma diminuição na atividade da lactato desidrogenase (LDH), além de diminuir o número de células inflamatórias no LBA. No tecido pulmonar ocorreu uma diminuição do dano oxidativo avaliado através dos níveis de TBARS e NO, e um aumento nos níveis de antioxidantes como a CAT, SOD, GSH e SH. Também observamos uma melhora do processo inflamatório através da análise histopatológica do tecido pulmonar. Podemos concluir através de nossos resultados que o tratamento com MK-801 promoveu uma melhora do processo inflamatório, uma melhora nos níveis de antioxidantes e uma diminuição do dano oxidativo em ratos com LPA induzida através da injeção intratraqueal de LPS.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000449079-Texto+Completo-0.pdf: 13871444 bytes, checksum: e0066e8269af7789f4e8bf48e9d2231c (MD5) Previous issue date: 2013 / Melanism is a very common coat color polymorphism in felids, and has been defined as an increased production of dark melanin which generates a general darkening of the organism’s tegument. Such coloration variation in mammals is often be regulated by the action of two genes and their products: MC1R and ASIP. Eumelanin (dark pigment) is produced when the Melanocortin-1 receptor (MC1R) is activated by the binding of the Alpha Melanocyte Stimulating Hormone (α-MSH). In contrast, MC1R activation is inhibited by the binding of the antagonist peptide ASIP (Agouti Signaling Protein), whose action leads to a switch to pheomelanin (light pigment) synthesis. Melanism has been documented in 13 out of 37 extant felid species, in some cases reaching high frequencies at the population level. A previous studies has indicated that this phenotype arose multiples times in the Felidae, with three different species exhibiting unique mutations associated with this trait (EIZIRIK et al., 2003). In this context, the present study aimed to identify the mutations implicated in this phenotype in five other felid species, and to investigate in more detail the evolutionary dynamics of melanism in the Felidae. In the first article, we revealed two additional cases of species-specific mutations involved in melanism in Asian wild cats, Panthera pardus and Pardofelis temminckii, and discuss the role of the ASIP gene in the evolution of this mutant phenotype. In the second manuscript, we analyzed the evolution of melanism in an endemic lineage of Neotropical felids belonging to the genus Leopardus. This lineage includes three species of small wild cats that were the focus of this study: L. colocolo, L. guigna e L. geoffroyi. The presence of melanism in these closely-related species, along with relatively high frequencies (ranging from 20% to 30%) of this phenotype observed in some areas of their geographic distribution, suggests that natural selection may be involved in the origin and evolution of this trait. In this context, we identified three novel mutations in the ASIP and MC1R genes, each of them strongly associated with melanism in one of the analyzed species, and revealed that natural selection may have played a role in the evolutionary history of melanism in this lineage of felids. / O melanismo é um polimorfismo de coloração bastante comum em felinos, definido como a ocorrência de uma acentuada produção de melanina escura que gera o escurecimento geral do tegumento do organismo. Sabe-se que esta variação da coloração em mamíferos é frequentemente regulada pela ação de dois genes e seus produtos: MC1R e ASIP. A eumelanina (pigmento escuro) é produzida quando o receptor de melanocortina-1 (MC1R) é ativado pelo hormônio estimulante de melanócito (α-MSH). Ao contrário, a ativação do MC1R é inibida pela ligação de um antagonista chamado ‘proteína sinalizadora de agouti’ (ASIP), cuja ação leva à troca da produção de eumelanina para feomelanina (pigmento claro). O melanismo foi documentado em 13 das 37 espécies atuais de felídeos e, em alguns casos, alcança altas frequências em nível populacional. Um estudo anterior indicou que o fenótipo surgiu múltiplas vezes em Felidae, com três espécies diferentes apresentando mutações independentes associadas ao mesmo (EIZIRIK et al., 2003). Assim, este estudo teve por objetivo identificar as mutações responsáveis por esta característica em outras cinco espécies de felídeos e analisar a dinâmica evolutiva do melanismo na família Felidae. No primeiro artigo, revelamos dois casos adicionais de mutações espécie-específicas envolvidas no melanismo de felídeos asiáticos, Panthera pardus e Pardofelis temminckii e discutimos o papel do gene ASIP na evolução deste fenótipo mutante. No segundo manuscrito, uma abordagem em nível genômico foi utilizada para analisar a evolução do melanismo em uma linhagem endêmica de felídeos neotropicais pertencentes ao gênero Leopardus. Nesta linhagem estão inclusas três espécies de pequenos felídeos que foram o principal foco desta análise: L. colocolo, L. guigna e L. geoffroyi. A presença do melanismo nestas espécies evolutivamente próximas, associada a frequências relativamente altas (20-30%) deste fenótipo em determinadas áreas de suas distribuições geográficas, sugere que a seleção natural pode estar envolvida na origem e evolução dessa característica. Neste contexto, identificamos três novas mutações nos genes ASIP e MC1R, cada uma delas fortemente associada ao melanismo em uma das espécies investigadas, e revelamos que a seleção natural parece ter influenciado a história evolutiva deste fenótipo nesta linhagem de felídeos.

As mucopolissacaridoses (MPS) constituem um grupo de doenças lisossômicas caracterizadas pela deficiência de uma das enzimas responsáveis pela degradação das glicosaminoglicanos. A expressão neurológica da doença varia de acordo com cada deficiência enzimática, mas o retardo mental é característico da MPS III e de formas graves das MPS I, II e VII. Vários estudos com ressonância magnética (RM) demonstraram que atrofia cerebral, lesões na substância branca (SB) e hidrocefalia são freqüentemente observados em pacientes com MPS. Entretanto a correlação entre a RM, anormalidades bioquímicas e gravidade do quadro neurológico ainda não foi descrita na literatura. Além disso, a comparação dos achados de espectroscopia de prótons por RM (ERM) com a RM convencional é desconhecida. O objetivo deste trabalho foi analisar a aplicação da RM e da ERM na investigação de pacientes com MPS. Sessenta crianças com MPS tipos I, II, IV e VI foram avaliadas com RM e ERM. Os resultados foram comparados com tempo de doença, anormalidades bioquímicas e disfunção cognitiva. Os exames de RM foram realizados em equipamento de alto campo magnético (1.5 T). Pacientes com maior tempo de doença tiveram mais lesões na SB. A atrofia cerebral e o grau de dilatação ventricular não foram afetados pelo tempo de doença ou idade dos pacientes. Pacientes com MPS II e disfunção cognitiva apresentaram maior atrofia cerebral, hidrocefalia, lesões mais severas na substância branca e aumento da relação mioinositol/creatina na ERM. Estas informações podem ser úteis para o melhor entendimento da fisiopatogenia das MPS e do papel da RM na sua investigação. / The mucopolysaccharidosis are a group of lysosomal diseases characterized by enzymatic deficiency which leads incomplete degradation of glycosaminoglycans. Neurological expression varies according to each enzyme but mental compromise is characteristic of MPS III and the severe forms of MPS I, II and VII. Studies with magnetic resonance imaging (MRI) demonstrated that brain atrophy, white matter (WM) lesions and hydrocephalus are common in MPS patients. However, correlation among MRI, biochemical changes and severity of neurological deficit was not published so far. In addition, comparison between MR spectroscopy (MRS) and MRI is controversial. The purpose of this study was to analyze MRI and MRS findings in MPS patients. Sixty patients with MPS types I, II, IV and VI were evaluated with MRI and MRS. Results were compared with disease duration, biochemical changes and cognitive impairment. MRI exams were performed in high field MRI scanner (1.5 T). Patients with longer disease duration had more WM lesions. Brain atrophy and hydrocephalus were not affected by disease duration or patient´s age. Patients with MPS II and cognitive impairment had more brain atrophy, hydrocephalus, severe WM lesions and elevated myoinositol/creatine at MRS. These results can be useful to better understand the pathogenic process and to increase the applicability of MRI in the disease investigation.

O alelo mutante termo-condicionalmente letal pso4-1 do gene PRP19, que codifica uma proteína associada ao spliceossoma, permitiu investigar a influência deste gene no processamento de pré-mRNA, reparação do DNA e esporulação. Fenótipos relacionados a genes portadores de introns foram correlacionados à temperatura. Sistemas repórteres para processamento de pré-mRNA e RT-PCR mostraram que eficiência de processamento de mRNA no mutante pso4-1 é inversamente correlacionada com a temperatura de crescimento. Uma mutação pontual, substituindo uma leucina por uma serina foi identificada dentro da região codificadora N-terminal do alelo Pso4-1 e afeta as propriedades bioquímicas de Pso4-1p. Entre 24 clones isolados utilizando o sistema doishíbridos, 7 foram identificados como partes dos genes RAD2, RLF2 e DBR1. RAD2 codifica uma endonuclease indispensável para a via reparação por excisão de nucleotídeos (NER), RLF2 codifica a subunidade maior do fator de montagem da cromatina I, cuja deleção resulta em sinsibilidade à radiação UVC, enquanto que DBR1 codifica uma enzima que atua sobre substratos de RNA na forma lariat, degradando estruturas lariat em introns durante o processamento de mRNA. A caracterização dos fenótipos após tratamentos com mutágenos em linhagens mutantes simples e duplos de rad2∆, rlf2∆ e pso4-1 mostraram sensibilidade aumentada para para mutantes rad2∆/pso4-1 e rlf2∆/pso4-1, sugerindo uma interferência funcional destas proteínas no processo dereparação do DNA em Saccharomyces cerevisiae. O mecanismo exato de reparação de pontes inter-cadeia (ICL) em S. cerevisiae não é ainda totalmente conhecido. Identificando novos fenótipos e isolando proteínas potencialmente capazes de interagir com Pso2p através da técnica do sistema dois-híbridos, foi possível extender a caracterização deste gene específica para reparação de pontes intercadeia. Tratamentos com acetaldeído (ACA), um metabólito natural da via glicolítica, foi mais tóxico a linhagem mutante pso2 em comparação com a linhagem selvagem e também capaz de induzir a expressão da fusão contendo o promotor de PSO2 à lacZ (PSO2-lacZ) por um fator comparável à tratamentos com outros agentes indutores de ICLs, indicando que o metabólito natural ACA pode causar danos do tipo ICL em S. cerevisiae. A utilização do sistema dois-híbridos permitiu isolar partes de proteínas codificadas por nove diferentes genes, entre eles a proteína quinase Pak1p, um supressor de mutações termosensíveis da DNA Polimerase alfa. Pak1p interage com a extremidade C-terminal conservada de Pso2p, uma região da proteína recentemente nomeada β-CASP entre v ortólogos conhecidos do gene PSO2. A integridade do domínio β-CASP é essencial para a reparaçãode DNA proficiente como demonstrado em ensaios de complementação com mutantes pso2 ∆. Comparação da sobrevivência após tratamento com agentes mutagênicos de simples mutantes pso2 ∆ e pak1 ∆ assim com o dulpo mutante pso2 ∆/pak1 ∆ revelaram que o gene PAK1 é necessário para reparação do DNA proficiente como na linhagem selvagem. A interação epistática dos dois alelos mutantes na linhagem duplo mutante sugere que Pak1p atua na mesma via de reparação a qual PSO2 pertence e que PAK1 constitui um novo locus envolvido na reparação do DNA em S. cerevisiae.

A transferência gênica baseada em retrovírus permite o carregamento e integração de um material genético exógeno ao genoma de uma célula alvo, o que permite a expressão estável do transgene tanto in vitro quanto in vivo. Até o momento não existiam lentivetores que permitam a clonagem de diferentes genes sob promotores de expressão gênica regulada por tetraciclina e também a análise de expressão através do IRES - sistema repórter. No presente trabalho, foi criada uma série de lentivetores contendo plasticidade estrutural para permitir a clonagem de diferentes genes, sítios únicos de clivagem para clonagem de diferentes promotores, elemento TRE para regular a expressão do transgene com tetraciclina ou doxiciclina e o sítio IRES expressando duas proteínas repórteres: GFP ou DsRed. A série de vetores produzidos, denominados pLR1, pLR2 e pLR3 possue o promotor RSV antecedido pelo elemento TRE e um sítio de clonagens múltiplas. Além disso, o pLR2 possui o sistema IRES-GFP e o pLR3 o sistema IRES-DsRed para geração de mRNA bicistrônico. A eficiência funcional de cada um dos elementos utilizados nas estruturas de cada um dos plasmídeos os transforma numa boa ferramenta biotecnológica para transferência gênica estável. / Gene transfer based upon lentiviral vectors allows the integration of exogenous genes into the genome of a target cell, turning these vectors into a powerful tool that allows stable expression of transgenes in mammalian cells both in vitro as well as in vivo. Currently, no plasmids for lentivirus are available that allow cloning of different genes to be regulated for different promoters or regulates by tetracycline and, also, that permit the analysis of the expression through a IRES - reporter gene system. In this work, we have generated a series of lentiviral vectors containing: a malleable structure to allow the cloning of different target genes in a multicloning site (mcs); unique sites to exchange promoters; TRE element to regulate the transgene expression with molecules such as tetracycline or doxicycline, and internal ribosome entry site followed by one of two reporter genes: GFP or DsRed. The series of vectors were named pLR1, pLR2 and pLR3. This vector serie has the RSV promoter flanked by a TRE element and a multicloning site. Also, the pLR2 plasmid has the IRES-GFP sequence after the mcs while pLR3 has IRES-DsRed for the generation of a bicistronic mRNA. The functional efficiency of each element used in the different plasmid structures transforms the plasmid serie into a powerful biotechnology tool for stable gene transfer.

BRÍGIDO, Jandenilson Alves Brígido. Prevalência e distribuição de sorotipos de Aggregatibacter actinomycetemcomitans isolados de pacientes brasileiros com doença periodontal. 2012. 65 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-02-20T14:57:33Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_jabrígido.pdf: 1741380 bytes, checksum: 165d564920f5f974946713389b299927 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-02-21T12:23:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_jabrígido.pdf: 1741380 bytes, checksum: 165d564920f5f974946713389b299927 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-21T12:23:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_jabrígido.pdf: 1741380 bytes, checksum: 165d564920f5f974946713389b299927 (MD5) Previous issue date: 2012 / Studies suggest that subjects with severe periodontal lesions are more likely to colonize Aggregatibacter actinomycetemcomitans. This species is genetically heterogeneous and can be grouped into six serotypes (a-f), which may differ regarding virulence characteristics. Ethnic differences and geographic population can influence the distribution and prevalence of these serotypes regarding periodontal disease. The aims of this dissertation, comprised of two manuscripts, were to review the literature concerning A. actinomycetemcomitans serotypes regarding to periodontal status and geographic origin of individuals (chapter 1); and to investigate the prevalence and distribution of A. actinomycetemcomitans serotypes in Brazilian subjects with chronic and aggressive periodontitis, identifying possible relationship of the different A. actinomycetemcomitans serotypes with periodontal disease (chapter 2). In study 1 was performed a systematic review of the pertinent literature related to the issue and in study 2, subgingival plaque sample of 71 subjects with aggressive or chronic periodontitis positive to A. actinomycetemcomitans were analysed by polymerase chain reaction (PCR). The literature analysis presented in study 1 showed that different ethnic groups are preferentially colonized by different A. actinomycetemcomitans serotypes. Serotypes a, b and c were largely found, and serotype c was the most prevalent in the majority of studies. The results of study 2 demonstrated that serotype c was detected with the highest frequency and serotypes d-f were not detected. It was also observed that individuals with aggressive periodontitis showed higher prevalence of both serotypes b and c (p<0.05), and in chronic periodontitis subjects the serotype c was significantly more prevalent (p<0.05). In conclusion, the results of these studies suggest that the relationship between the different serotypes and periodontal conditions remains unclear (chapter 1). Serotype c was dominant among Brazilian subjects with periodontal disease and aggressive periodontitis subjects were associated both serotypes b and c (chapter 2). / Estudos indicam que indivíduos com lesões periodontais mais severas apresentam maior probabilidade de serem colonizados por Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Essa espécie é geneticamente heterogênea e pode ser agrupada em seis sorotipos (a-f), que podem diferir quanto a suas características de virulência. As diferenças étnicas e populações geográficas podem influenciar na distribuição e prevalência desses sorotipos em relação ao tipo de doença periodontal. Os objetivos dessa dissertação, constituída por dois artigos, foram: revisar a literatura concernente aos sorotipos de A. actinomycetemcomitans em relação à condição periodontal e origem geográfica dos indivíduos (capítulo 1); e avaliar a prevalência e distribuição dos sorotipos de A. actinomycetemcomitans em pacientes brasileiros com periodontite crônica e agressiva, identificando a possível relação dos diferentes sorotipos de A. actinomycetemcomitans com a patologia periodontal (capítulo 2). No estudo 1, foi realizada uma revisão sistemática da literatura pertinente ao assunto e no estudo 2, amostras de biofilme bacteriano subgengival de 71 pacientes com periodontite agressiva ou crônica positivos para A. actinomycetemcomitans foram analisadas através da reação em cadeia da polimerase (PCR). A análise da literatura apresentada no estudo 1 mostrou que diferentes grupos étnicos são preferencialmente colonizados por diferentes sorotipos de A. actinomycetemcomitans. Os sorotipos a, b e c foram largamente encontrados e o sorotipo c foi o mais prevalente na maioria dos estudos. Os resultados do estudo 2 demonstraram que o sorotipo c foi encontrado com maior frequência e os sorotipos d-f não foram detectados. Foi verificado também que indivíduos com periodontite agressiva apresentaram maior prevalência de ambos os sorotipos b e c (p<0.05), e que em pacientes com periodontite crônica o sorotipo c foi significativamente mais prevalente (p<0.05). Em conclusão, os resultados desses estudos indicam que a relação entre os diferentes sorotipos e a condição periodontal permanece obscura (capítulo 1). O sorotipo c foi dominante entre pacientes brasileiros com doença periodontal e os indivíduos com periodontite agressiva foram associados com os sorotipos b e c (capítulo 2).

SILVEIRA, Virgínia Régia Souza da. Detecção de leucotoxina de Aggregatibacter actinomycetemcomitans em portadores de periodontite agressiva e seus familiares. 2010. 61 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-19T13:50:31Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_vrssilveira.pdf: 1110307 bytes, checksum: 76e5d7512470953689ce41023e12a6fd (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-02T16:16:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_vrssilveira.pdf: 1110307 bytes, checksum: 76e5d7512470953689ce41023e12a6fd (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-02T16:16:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_vrssilveira.pdf: 1110307 bytes, checksum: 76e5d7512470953689ce41023e12a6fd (MD5) Previous issue date: 2010 / Aggregatibacter actinomycetemcomitans is a pathogen strongly associated with the etiology of aggressive periodontitis. The purpose of this study was to evaluate by polymerase chain reaction (PCR) the presence of highly and minimally leukotoxic clones of A. actinomycetemcomitans in patients with aggressive periodontitis (AgP) and their family members (FM). Thirty five patients with AgP (33,9 ± 7,1 years), 33 FM (22,8 ± 11,4 years) and 41 patients with chronic periodontitis (CP) (44,1 ± 9,4 years) were clinical analyzed through plaque index (PI), gingival index (GI), probing depth (PD) and clinical attachment level (CAL). Subgingival biofilm samples were collected from the interproximal periodontal sites (> PD and > CAL) of each patient and their microbiological analysis were taken by PCR, concerning A. actinomycetemcomitans was observed and its leukotoxic clones. The PD and CAL average of this sites were: AgP – 9,8 mm e 10,7 mm, FM – 5,3 mm e 4,6 mm e CP – 8,2 mm e 9,4 mm. Statistically significant difference was observed among the groups. The presence of A. actinomycetemcomitans was observed in 23 (51,1%) patients with aggressive periodontitis and in others ones, 16 (30,1%) with chronic periodontitis. Among them 37 (94,8%) showed minimally leukotoxic clones and 2 (5,1%) highly leukotoxic clone, one was AgP group, the other was FM group, also with aggressive disease. Concerning to periodontal status of the FM group, 30,3% had aggressive periodontitis, 36,3% chronic periodontitis and 33,3% were periodontally normal or had gingivitis. Among them 12,2% were A. actinomycetemcomitans positive. The higher values of PD and CAL were observed in aggressive periodontitis patients that were A. actinomycetemcomitans positive when compared with A. actinomycetemcomitans negative patients (p<0.05). The presence of A. actinomycetemcomitans was correlated with aggressive periodontitis clinical status (Odds ratio=3,1; CI: 1,4-7,0; p=0,009). The majority of the patients with aggressive periodontitis exhibited a generalized form of disease and were positives to minimally leukotoxic A. actinomycetemcomitans clones. The family members had any type of chronic or aggressive periodontal disease. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans é um patógeno intensamente relacionado com a etiologia da periodontite agressiva. O objetivo deste estudo foi avaliar, via reação em cadeia da polimerase, a presença de clones de A. actinomycetemcomitans que exibem alta ou mínima leucotoxicidade em indivíduos portadores de periodontite agressiva (PAG) e em seus membros familiares (FAM). Trinta e cinco indivíduos com PAG (33,9 ± 7,1 anos), 33 FAM (22,8 ± 11,4 anos) e 41 portadores de periodontite crônica (PC) (44,1 ± 9,4 anos) foram analisados clinicamente pelo índice de placa (IP), índice gengival (IG), profundidade de sondagem (PS) e nível de inserção clínico (NIC). Amostras de biofilme subgengival foram coletadas de todos os indivíduos do sítio interproximal com maior PS e maior NIC e analisadas microbiologicamente por meio de PCR, quanto à presença de A. actinomycetemcomitans e de seus clones leucotóxicos. Médias de PS e NIC desses sítios foram: PAG – 9,8 mm e 10,7 mm, FAM – 5,3 mm e 4,6 mm e PC – 8,2 mm e 9,4 mm, tendo sido observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos. A presença de A. actinomycetemcomitans foi observada em 23 (51,1%) portadores de periodontite agressiva e em 16 (30,1%) portadores de periodontite crônica. Dentre eles, 37 (94,8%) exibiram clones de mínima leucotoxicidade e 2 (5,1%) clones de alta leucotoxicidade, um do grupo PAG e outro do grupo FAM, também com doença agressiva. Quanto à condição periodontal do grupo FAM, 30,3% apresentaram periodontite agressiva, 36,3% periodontite crônica e 33,3% estavam periodontalmente saudáveis ou mostravam gengivite. Dentre eles, 12,2% estavam positivos para a presença de A. actinomycetemcomitans. Maiores valores de PS e NIC foram observados nos pacientes com periodontite agressiva positivos para A. actinomycetemcomitans quando comparados àqueles pacientes negativos, com diferença estatisticamente significante. A presença de A. actinomycetemcomitans foi associada à condição clinica de periodontite agressiva (odds ratio=3,1; intervalo de confiança: 1,4-7,0; p=0,009). A maioria destes indivíduos exibiu uma forma generalizada de doença e estavam positivos para clones de mínima leucotoxicidade de A. actinomycetemcomitans. Os familiares externaram em sua maioria algum tipo de doença periodontal crônica ou agressiva.