Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o causador do cancro de plantas cítricas. Entre os potenciais fatores de virulência codificados por Xac, está o Sistema de Secreção do Tipo IV (T4SS), um grande complexo multiprotéico que atravessa o periplasma e as membranas interna e externa de bactérias Gram-negativas. O T4SS está envolvido com secreção de proteínas e/ou DNA para o meio extracelular ou diretamente no interior da célula do hospedeiro. Este Sistema requer tipicamente 12 proteínas para realizar suas funções: VirB1-VirB11 e VirD4. O T4SS codificado pelo cromossomo de Xac está aparentemente incompleto, devido a não codificar nenhuma proteína com similaridade de seqüência a VirB7. Os objetivos deste trabalho são estudar a estrutura, função e interações das proteínas do T4SS de Xanthomonas. Foram clonados 23 genes que codificam proteínas ou domínios relacionados ao T4SS, e os polipeptídeos foram produzidos de forma recombinante em E. coli. Treze deles foram purificados e submetidos a estudos estruturais, espectroscópicos e de interações proteína-proteína. A estrutura em solução de Xac262224-139 foi resolvida, apresentando uma região N-terminal desenovelada de aproximadamente 30 resíduos e um domínio globular. Este polipeptídeo oligomeriza em troca química rápida na escala de tempo de RMN e o seu N-terminal desenovelado reconhece o domínio C-terminal de VirB9 (VirB9154-255) em troca lenta. Análise de RMN demonstrou que VirB9154-255 possui uma estrutura flexível em solução, sofrendo uma marcante mudança conformacional na presença de Xac262224-139. Ambas proteínas se tornam rígidas após a interação. Xac2622 é o equivalente a VirB7 em Xanthomonas, baseado na localização do seu gene no lócus do T4SS, localização subcelular predita do polipeptídeo codificado e sua interação com VirB9. Porém, diferente de outras proteínas da família VirB7, Xac2622 possui um domínio globular adicional, com topologia e estrutura similares a domínios presentes apenas em proteínas associadas à membrana externa de bactérias Gram-negativas. Nocaute do gene xac2622, contudo, não afetou a virulência de Xac na infecção de plantas de laranja pêra. O domínio enovelado de Xac2622 foi cristalizado, e os cristais obtidos difrataram até uma resolução de 1,0 Å, pertencendo ao grupo espacial C2221. O modelo preliminar possui Rfactor de 0,121 e Rfree de 0,147. Foram obtidos cristais de outras 3 proteínas relacionadas ao T4SS de Xac, porém somente um deles difratou em alta resolução (2,0 Å, pertencendo ao grupo espacial C2). O potencial sinal de secreção pelo T4SS de Xanthomonas é um domínio C-terminal conservado de aproximadamente 115 resíduos, encontrado nos substratos putativos do T4SS. Caracterizamos um destes domínios, presente na proteína Xac2609, e ele é intrinsicamente desestruturado. Essa observação pode ter implicações funcionais, visto que os substratos são desenovelados antes de sua passagem pelo canal de secreção do T4SS / Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a gram-negative bacterial phytopathogen that infects citrus. One possible virulence determinant is a chromosomally encoded Type IV Secretion System (T4SS), a multiprotein complex that spans the bacterial periplasm and both inner and outer membranes. The T4SS is used by some bacteria to secrete proteins and/or DNA to the extracellular milieu or the host interior. The model T4SS from Agrobacterium tumefaciens is made up of twelve structural proteins: VirB1-VirB11 and VirD4. The Xanthomonas T4SS is apparently incomplete because of the lack of a polypeptide with sequence similarity to VirB7. The aim of this project is the study of structure-function relationships in the Xanthomonas T4SS. Twenty-three T4SS protein-coding genes, including full-length proteins or domains, were cloned and the proteins were produced in different E. coli strains. Thirteen polypeptides were purified and some of them were submitted to structural, spectroscopic and protein-protein interaction studies. We used NMR to solve the solution structure of Xac262224-139 which consists of an unfolded N-terminal segment of ~30 residues followed by a globular domain. Xac262224-139 oligomerizes in fast exchange at the NMR time scale and interacts via its unfolded N-terminus with the VirB9 C-terminus (VirB9154-255) in slow exchange. NMR analysis showed that VirB9154-255 has a flexible structure in solution. However, this polypeptide undergoes a significant conformational modification in the presence of Xac2622,24-139 and both proteins become rigid upon interaction. Xac2622 is the Xanthomonas VirB7, based on the chromosomal localization of its gene, predicted subcellular localization and protein interaction analysis. But surprisingly, unlike other VirB7 proteins, Xac2622 has an extra C-terminal folded domain whose topology and structure are strikingly similar to that of periplasmic domains found in outer membrane proteins of many bacterial Secretion Systems. Knockout of the xac2622 gene, however, does not affect the Xac virulence in orange leaf infection assays. The Xac2622 folded domain was also crystallized, and these crystals diffracted up to 1.0 Å resolution and belong to the space group C2221. The preliminary refined model has Rfactor of 0.121 and Rfree of 0.147. Crystals of three other T4SS proteins have been obtained, but only one of them diffracted to high resolution (2.0 Å; space group C2). Xac2610 is a hypothetical protein whose gene is located in the T4SS locus, and its interactions were studied with VirB9, VirB11 and Xac2609, a putative T4SS substrate. The potential T4SS secretion signal is a conserved, approximately 115 residues, C-terminal domain found in the putative substrates of the Xanthomonas T4SS. This sequence mediates interactions with VirD4. We have characterized this domain from one substrate and it is mainly unfolded. This observation may have functional implications, as the substrates are unfolded before their secretion through the T4SS channel

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-01-03T12:37:26Z No. of bitstreams: 1 DissARFKM.pdf: 5277245 bytes, checksum: eb3373a6818032ff6003ee650addae1a (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2017-01-16T17:13:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissARFKM.pdf: 5277245 bytes, checksum: eb3373a6818032ff6003ee650addae1a (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2017-01-16T17:13:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissARFKM.pdf: 5277245 bytes, checksum: eb3373a6818032ff6003ee650addae1a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-16T17:13:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissARFKM.pdf: 5277245 bytes, checksum: eb3373a6818032ff6003ee650addae1a (MD5) Previous issue date: 2016-08-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Chagas Disease is a sickness that affects the population present of Latin America and it is classified by the World Health Organization as a Neglected Tropical Diseases. Chagas disease is caused by the flagellated parasite Trypanosoma cruzi, which belong to the same family as Trypanosoma brucei and Leishmania sp., and has a complex life cycle, going from an invertebrate host to a vertebrate one. In order to survive and proliferate in these host changes, T. cruzi must adapt itself to osmotic and oxidative stresses, changes in the environmental ion composition and shifts in energy sources. To perform this adaptation, the amino acid Lproline has presented an important and essential participation that affects the protozoan life cycle, such as support of the mitochondrial metabolism, the host-cell invasion and metacyclogenesis. T. cruzi 1-Delta-Pyrroline-5-Carboxylate Dehydrogenase (TcP5CDH) is involved in the catabolism of proline holding a major role in its conversion by transforming pyrroline-5-carboxylate into L-glutamate (the second step of the catabolic path) and, thus, seeming to be a promising molecular target for new drug development. The amino acids sequence of PP5CDH was used for conservation analysis, secondary structure prediction, identification of functional domains, and building of tertiary structure computer models with the techniques of Molecular Modeling and Molecular Docking. The TcP5CDH (MW: 60 kDa) was expressed in a heterologous fashion in Escherichia coli, and purified with affinity and size exclusion chromatography, resulting in approximately 2 mg/L of expression. The Dynamic Light Scattering assays where carried out with the recombinant P5CDH in the concentrations of 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 mg/mL, and presented an apparent molecular weight of 223,4 kDa (Rh: 12,01 nm), 246,4 kDa (Rh: 12,53 nm), 310,5 kDa (Rh: 13,83 nm) e 312,0 kDa (Rh: 12,13,86 nm), respespectively. The Circular Dichroism spectroscopy was performed with 0.2 mg/mL of TcP5CDH in the presence and absence of 100 μM of NAD+, L-Glu, and its inhibitor Disulfiram, presenting a Tm of Tm 60,01 ºC, 59,76 ºC, 57,76 ºC e 58,18 ºC, showing that TcP5CDH has a more thermic stability without ligands. Also, a deconvolution was made showing that TcP5CDH has 23% of alfa-helix, 12,3% of antiparallel beta-sheetst and 12,4% parallel beta-sheets, 18,3% of turns 41,7% of disorganized structures. These results will contribute to the understanding of the pathway of L- proline in T. cruzi and the possible future development of new drugs. / A Doença de Chagas é uma enfermidade que afeta a população presente nos países da América Latina e é classificado pela Organização Mundial da Saúde como uma Doença Tropical Negligenciada. A Doença de Chagas é causada pelo parasita flagelado Trypanosoma cruzi, pertencente à mesma família dos parasitas Trypanosoma brucei e a Leishmania sp., organismo que possui um complexo ciclo de vida, passando de um hospedeiro invertebrado para um vertebrado. Para sobreviver e proliferar nessa mudança de hospedeiro, o T. cruzi precisa se adaptar a estresses oxido-redutivos e osmóticos, mudanças da composição iônica do ambiente e mudanças na fonte de energia. Para realizar essas mudanças, o aminoácido Lprolina apresenta uma importante participação que afeta o ciclo de vida do parasita como suporte no metabolismo mitocondrial, invasão de células hospedeiras e na metaciclogênese. A 1-Delta-Pyrrolina-5-Carboxilato Desidrogenase de T. cruzi (TcP5CDH) está envolvida no catabolismo da prolina tendo um papel importante na sua conversão através da transformação da pirroline-5-carboxilato em L-glutamato (a segunda etapa da via) e, assim, parece ser um alvo molecular promissor para desenvolvimento de novos fármacos. A sequência de aminoácidos da P5CDH foi utilizada para análises de conservação, predição de estruturas secundárias, identificação de domínios funcionais e modelos computacionais da estrutura terciária através da técnicas de Modelagem por Homologia e Ancoramento Molecular. A TcP5CDH (MW: 60 kDa) foi expressa de forma heteróloga em Eschericia coli, purificada por cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular e, em seguida, concentrada, resultando em aproximadamente 2 mg/L de expressão. Os experimentos de Espalhamento Dinâmico da Luz foram realizados com a P5CDH recombinante nas concentrações de 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 mg/mL e apresentaram uma massa molecular aparente de 223,4 kDa (Rh: 12,01 nm), 246,4 kDa (Rh: 12,53 nm), 310,5 kDa (Rh: 13,83 nm) e 312,0 kDa (Rh: 12,13,86 nm), respectivamente. A Espectroscopia de Dicroísmo Circular foi realizado utilizando 0,2 mg/mL da TcP5CDH e com a proteína na presença de 100 μM de NAD+, L-Glu e do inibidor Dissulfiram, apresentando uma Tm 60,01 ºC, 59,76 ºC, 57,76 ºC e 58,18 ºC, respectivamente. Além disso, uma deconvolução foi realizada mostrando que a TcP5CDH possui 23% de alfa-hélices, 12,3% de folhas-beta antiparalelas, 12.4% de folhas-beta paralelas, 18,3% de voltas e 41,7% de regiões desorganizadas Estes resultados irão contribuir no entendimento da via da L-prolina em T. cruzi e no possível desenvolvimento futuro de novos fármacos.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-04-26T22:28:02Z No. of bitstreams: 1 MarceloJoseSantiagoLisboa_DISSERT.pdf: 3090785 bytes, checksum: 44b33d32778eb8492274ab6f9eccf838 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-05-02T22:09:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MarceloJoseSantiagoLisboa_DISSERT.pdf: 3090785 bytes, checksum: 44b33d32778eb8492274ab6f9eccf838 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-02T22:09:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarceloJoseSantiagoLisboa_DISSERT.pdf: 3090785 bytes, checksum: 44b33d32778eb8492274ab6f9eccf838 (MD5) Previous issue date: 2015-08-26 / A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) ? uma doen?a de car?ter heredit?rio onde ocorre a aus?ncia da prote?na distrofina, levando a quadros de les?o miopatia grave decorrentes do aumento do estresse oxidativo e influxo de Ca+. Les?es na musculatura lisa intestinal podem comprometer a motilidade local devido a altera??es da estrutura da pr?pria t?nica muscular, bem como, a mudan?as morfofuncionais das estruturas do plexo mioent?rico. Este trabalho teve por objetivo avaliar as mudan?as ocorridas na t?nica muscular e nos neur?nios mioent?ricos colin?rgicos do ?leo de camundongos mdx e, os efeitos da suplementa??o com ?cido asc?rbico (AA) nestes dois componentes. Foram utilizados 30 camundongos machos C57BL/10 e 30 C57BL/10Mdx separados em grupos de acordo com a idade e tratamento (n=10): controle com 30 dias de idade (C30); distr?fico com 30 dias de idade (D30); controle com 60 dias de idade (G60); distr?fico com 60 dias de idade (D60); controle com 60 dias de idade suplementados com ?cido asc?rbico (200mg/kg de peso corporal) (CS60) e, distr?fico com 60 dias de idade suplementados com ?cido asc?rbico (200mg/kg de peso corporal) (GDS60). Ap?s o per?odo experimental os animais foram eutanasiados e os ?leos foram coletados e processados seguindo a rotina histol?gica e corados pela t?cnica de Tricr?mico de Masson e, para t?cnica histoqu?mica da Acetilcolinesterase em preparados totais de membrana. Os dados demonstraram que a espessura da t?nica muscular (?m) e a ?rea de m?sculo liso (?m2) do ?leo foi menor nos grupos distr?ficos, especialmente no grupo D30. Nos animais de DS60 a espessura da t?nica muscular foi semelhante aos de C60. Houve redu??o da densidade neuronal colin?rgica do plexo mioent?rico do ?leo foi menor nos animais D30, por?m esta foi semelhante nos animais de 60 dias sem tratamento (C60 e D60) e, maior nos animais DS60. ?rea do perfil do corpo celular (?m2) foi semelhante nos animais de C30-D30 e C60-D60, por?m est? foi maior em DS60. A raz?o ?rea nuclear/?rea citoplasm?tica foi menor em D30 e DS60 e, maior em D60. Desta forma podemos concluir que em camundongos mdx ocorrem altera??es significativas na morfologia da t?nica muscular e, consequentemente, mudan?as morfol?gicas e funcionais dos neur?nios colin?rgicos do plexo mioent?rico do ?leo, bem como, que a suplementa??o com AA teve efeito neuroprotetor nestes animais pois prevenindo a perda neuronal. / The Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a hereditary disease where there is a lack of dystrophin protein, leading to severe injury myopathy frames resulting from increased oxidative stress and Ca + influx. Lesions on intestinal smooth muscle can compromise the local motility due to changes in the very muscular layer structure as well as the morphological and functional changes in the myenteric plexus structures. This study aimed to evaluate changes in the muscular wall and myenteric cholinergic neurons of the ileum of mdx mice, and the effects of supplementation with ascorbic acid (AA) in these two components. 30 male C57BL / 10 and 30 C57BL / 10Mdx separated into groups according to age and treatment (n = 10) were control at 30 days old (C30); dystrophic 30 days of age (D30); control with 60 days of age (C60); dystrophic with 60 days of age (D60); control at 60 days of age supplemented with ascorbic acid (200mg / kg body weight) (CS60) and dystrophic 60 days of age supplemented with ascorbic acid (200mg / kg body weight) (DS60). After the trial period the animals were euthanized and ileus have been collected and processed following the histological routine and stained by Masson's technique of Masson and for immunohistochemical technique of acetylcholinesterase in total membrane prepared. The data demonstrated that the thickness of the muscularis (?m) and smooth muscle area (?m 2) of the ileum was lower in dystrophic groups, especially Group D30. In animal DS60 the thickness of the muscular layer was similar to the C60. Decreased cholinergic neuronal density of the myenteric plexus of the ileum was lower in D30 animals, but this was similar in animals 60 days without treatment (C60 and D60) and higher in DS60 animals. Cell body profile area (?m 2) was similar in animals of C30-C60 and D30-D60, but is was higher in DS60. The nuclear area ratio / cytoplasmic area was lower in D30 and DS60 and higher in D60. Thus we conclude that mdx mice occur in significant changes in the morphology of the muscular layer and, consequently, morphological and functional changes of cholinergic neurons of the myenteric plexus of the ileum and that supplementation with AA had neuroprotective effects in these animals as preventing loss Neuronal.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-04-04T19:21:31Z No. of bitstreams: 1 KadignaCarlaSilvaCosta_DISSERT.pdf: 1273103 bytes, checksum: 42e60354cd1cf82d4ae965a4a92de036 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-04-12T23:33:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KadignaCarlaSilvaCosta_DISSERT.pdf: 1273103 bytes, checksum: 42e60354cd1cf82d4ae965a4a92de036 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T23:33:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KadignaCarlaSilvaCosta_DISSERT.pdf: 1273103 bytes, checksum: 42e60354cd1cf82d4ae965a4a92de036 (MD5) Previous issue date: 2016-12-14 / Os morcegos atuam de diversas maneiras na regula??o dos ecossistemas. Dentre seus representantes, Artibeus planirostris ? uma esp?cie frug?vora, que atua tanto como dispersora de sementes quanto como polinizadora. Diante da escassez de estudos sobre a biologia reprodutiva de morcegos, sobretudo em machos, e da car?ncia de informa??es sobre a reprodu??o dos indiv?duos da ordem quir?ptera no Nordeste do Brasil, este estudo teve por objetivo quantificar o processo espermatog?nico de A. planirostris, bem como sua varia??o sazonal, atrav?s de an?lises morfol?gicas e morfom?tricas dos test?culos. Os animais foram coletados nos anos 2013 e 2014, entre as esta??es seca (n=10) e chuvosa (n=10), no campus central da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Natal-RN). Ap?s eutan?sia os test?culos foram coletados e processados histologicamente para inclus?o em historesina e analise sob microscopia de luz. As l?minas histol?gicas foram fotografadas e a morfometria foi realizada utilizando-se o software Image-Pro Plus. Os resultados obtidos quanto ? morfometria e biometria foram comparados pelo teste de Kruskall Wallis ou pelo teste de Student, considerando-se um n?vel de signific?ncia de 5% (p<0,05). Considerando-se as duas esta??es, os animais apresentaram ?ndice gonadossom?tico m?dio de 0,54%. Os t?bulos semin?feros representaram cerca de 92% do par?nquima testicular, sendo o restante representado pelo intert?bulo. Os t?bulos semin?feros foram compostos por cerca de 27% de l?men, 60% de epit?lio semin?fero e 4% de t?nica pr?pria. Dentre os par?metros morfom?tricos analisados, apenas o l?men apresentou varia??o significativa entre as esta??es, de modo que o maior percentual foi encontrado na esta??o chuvosa, com cerca de 29%. O di?metro tubular e a altura do epit?lio semin?fero apresentaram m?dias de 142 ?m e 43 ?m, respectivamente. Obteve-se comprimento tubular m?dio por grama de test?culo de 64,7 m e ?ndice tubulossom?tico de 0,47 %. A popula??o celular do epit?lio semin?fero mostrou-se composta por espermatog?nias, espermat?citos prim?rios na transi??o de pr?-lept?teno para lept?teno, em zig?teno e em paqu?teno, esperm?tides arredondadas e alongadas e c?lulas de Sertoli. Apenas a popula??o de espermat?citos prim?rios em pr?-lept?teno/lept?teno apresentou varia??o entre as esta??es, com maiores valores na esta??o seca. Obteve-se ?ndice mit?tico anual de 14%, ?ndice mei?tico de 3%, rendimento geral da espermatog?nese de 51 c?lulas e ?ndice de c?lulas de Sertoli de 6 c?lulas. A an?lise da frequ?ncia dos est?dios do ciclo do epit?lio semin?fero mostrou que os est?dios mais e menos frequentes foram, respectivamente, o 1 e o 6. Os est?dios 1 e 4 variaram estatisticamente entre as esta??es, sendo que o est?dio 1 foi mais frequente na esta??o chuvosa e o est?dio 4 foi mais frequente na esta??o seca. O intert?bulo foi composto predominantemente por c?lulas de Leydig, as quais apresentaram maiores percentuais no par?nquima testicular na esta??o seca, assim como a propor??o volum?trica dos vasos linf?ticos. Os demais componentes intertubulares n?o variaram estatisticamente entre as esta??es, bem como os par?metros analisados quanto ? morfometria das c?lulas de Leydig. Estas c?lulas apresentaram n?mero por grama de test?culo com m?dia anual de 5,63x107c?lulas, e ?ndice Leydigossom?tico de 0,005%. Observou-se grande investimento em t?bulos semin?feros, com baixa capacidade de suporte pelas c?lulas de Sertoli, e grande investimento em c?lulas de Leydig no par?nquima testicular, sobretudo na esta??o seca, bem como na popula??o de espermat?citos prim?rios em pr?-lept?teno/lept?teno indicando padr?o espermatog?nico anual cont?nuo no Nordeste do pa?s em A. planirostris. / Bats act in several ways to regulate ecosystems. Among its representatives, Artibeus planirostris is a frugivorous species, which acts both as a seed disperser and as a pollinator. Due to the scarcity of studies on the reproductive biology of bats, especially in males, and the lack of information about the reproduction of the specimens of order chiroptera in the Brazilian Northeast, this study aimed to quantify the spermatogenic process of A. planirostris, as well as its seasonal variation, through the morphological and morphometric analysis of the testes. The animals were collected in the years of 2013 and 2014, between the dry (n = 10) and rainy seasons (n = 10), at the central campus of the Federal University of Rio Grande do Norte (Natal-RN). After euthanasia, the testes were collected and processed histologically for embedding in historesin and analyzed under light microscopy. The histological slides were photographed and the morphometry was performed using the Image-Pro Plus software. The results of morphometry and biometry were compared by the Kruskall Wallis test or by the Student test, with a significance level of 5% (p <0.05). Considering the two seasons, the animals had a mean gonadosomatic index of 0,54%. The seminiferous tubules represented about 92% of the testicular parenchyma, the remaining being represented by the intertubule. The seminiferous tubules were composed of about 27% of lumen, 60% of seminiferous epithelium and 4% of tunica propria. Among the analyzed morphometric parameters, only the lumen showed significant variation between the seasons, so that the highest percentage was found in the rainy season, with about 29%. The tubular diameter and height of the seminiferous epithelium presented a mean of 142 ?m and 43 ?m, respectively. It was obtained a mean tubular length per gram of testis of 64.7 m and tubulesomatic index of 0.47%. The cell population of the seminiferous epithelium was composed of spermatogonia, primary spermatocytes in the transition from pre-leptotene to leptotene, zygotene and pachytene, rounded and elongated spermatids and Sertoli cells. Only the population of primary spermatocytes in pre-leptotene/leptotene presented variation between seasons, with higher values in the dry season. The annual mitotic index was 14%, the meiotic index was 3%, the overall spermatogenesis yield was 51 cells and the Sertoli cell index was 6 cells. The analysis of the frequency of the stages that compose the seminiferous epithelium cycle showed that the most and least frequent stages were, respectively, the 1 and the 6. Stages 1 and 4 varied statistically between seasons, with stage 1 being more frequent in the rainy season and stage 4 being more frequent in the dry season. The intertubule was predominantly composed of Leydig cells, which presented higher percentages in the testicular parenchyma in the dry season, as well as the volumetric proportion of the lymphatic vessels. The other intertubular components did not vary statistically between the seasons, as well as the parameters analyzed for Leydig cell morphometry. These cells presented a number per gram of testis with an annual mean of 5,63x107 cells and a Leydyssomatic index of 0.005%. It were observed a large investment in seminiferous tubules, with a low support capacity by Sertoli cells, and great investment in Leydig cells in the testicular parenchyma, especially in the dry season, as well as in the population of pre-leptotene/leptotene primary spermatocyte, indicating annual continuous spermatogenic pattern in the Northeast of the Brazil in A. planirostris.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-06-02T23:17:43Z No. of bitstreams: 1 EpifanioFernandesDaSilva_DISSERT.pdf: 1808656 bytes, checksum: a66e4e7210681ca2462da4ceef086da5 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-06-12T21:13:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 EpifanioFernandesDaSilva_DISSERT.pdf: 1808656 bytes, checksum: a66e4e7210681ca2462da4ceef086da5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-12T21:13:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 EpifanioFernandesDaSilva_DISSERT.pdf: 1808656 bytes, checksum: a66e4e7210681ca2462da4ceef086da5 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / INTRODU??O: A agressividade ? um comportamento comum a diversas esp?cies animais, incluindo humanos. Entretanto, a viol?ncia e a impulsividade, associadas ? agressividade, s?o um problema social e podem ser consideradas patol?gicas, pois est?o presentes em v?rios transtornos psiqui?tricos. Diversas ?reas encef?licas est?o associadas ? express?o do comportamento agressivo, como a am?gdala, hipot?lamo e c?rtex pr?-frontal. V?rios sistemas de neurotransmiss?o est?o mediando o comportamento agressivo, dentre eles: serotonina, dopamina, noradrenalina e GABA. De maneira geral, os alvos terap?uticos dispon?veis para controle da agressividade modulam a fun??o dos sistemas de neurotransmissores acima. A nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) ? um heptadecapept?deo que atua como ligante do receptor NOP. Evid?ncias cl?nicas e pr?-cl?nicas mostram o envolvimento do sistema N/OFQ ? receptor NOP com transtornos psiqui?tricos, incluindo aqueles nos quais a agressividade est? associada. OBJETIVO: Este trabalho investigou o efeito de f?rmacos cl?ssicos e ligantes do receptor NOP no comportamento agressivo de camundongos machos, por meio do teste do residente-intruso. M?TODOS: Foram utilizados camundongos Swiss machos. Valproato 300 mg/kg, L?tio 50 mg/kg, Carbamazepina 20 mg/kg e Diazepam 1 mg/kg foram os f?rmacos cl?ssicos utilizados nesse estudo. Dentre os ligantes NOP utilizados destacam-se: Ro 65-6570 (0,01 ? 1 mg/kg), agonista pleno, AT-090 (0,01-0,1 mg/kg), agonista parcial, SB-612111 (1- 10 mg/kg), antagonista NOP. Para o teste do residente-intruso, camundongos machos foram isolados por 7 dias (residentes). Nos 8? e 11? dia, foram realizadas sess?es de avalia??o da agressividade, por meio da inser??o de um camundongo intruso na caixa do residente por 10 min. No dia 8, a agressividade basal foi avaliada sem qualquer tratamento pr?vio; no dia 11, o mesmo camundongo residente foi novamente avaliado, ap?s ter recebido o tratamento relativo ao seu grupo experimental. O campo aberto foi utilizado para avaliar o efeito dos f?rmacos na atividade locomotora. RESULTADOS: Valproato, L?tio, Carbamazepina reduziram o comportamento agressivo no teste do residente-intruso, enquanto que o tratamento com Diazepam n?o afetou a agressividade dos residentes. A administra??o de Ro 65-6570 (em todas as doses testadas) e AT-090 (na dose mais alta), aumentou o comportamento agressivo. J? o agonista parcial, AT-090, nas menores doses, reduziu discretamente a agressividade dos residentes. O tratamento com SB-612111 n?o modificou o comportamento agressivo dos animais. Nenhum dos tratamentos alterou a atividade locomotora dos animais. CONCLUS?O: Os f?rmacos cl?ssicos utilizados na cl?nica para tratamento de transtornos psiqui?tricos, os quais incluem sintomas de agressividade, foram eficazes em controlar a agressividade nos camunodngos residentes. Por outro lado, a ativa??o do receptor NOP tende a aumentar o comportamento agressivo, enquanto que o bloqueio deste sinal n?o foi modifica este comportamento. Em ?ltima an?lise, com estes dados sugere-se que os agonistas NOP poderiam promover como efeito adverso aumento da agressividade. / INTRODUCTION: Several species including humans display aggressive behavior. However, violence and impulsivity related to aggressiveness represent a social problem. Indeed, aggressive behavior can be considered symptoms of many psychiatric disorders. Some of the brain areas involved in aggression include amygdala, hypothalamus, and prefrontal cortex. Aggressiveness is modulated by different neurotransmitters, such as serotonin, dopamine, noradrenaline and GABA. These systems represent the therapeutic targets available to treat aggressiveness. The nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) is a heptadecapeptide acting as endogenous ligand of NOP receptor. Clinical and preclinical findings suggest the involvement of N/OFQ ? NOP receptor system with psychiatric disorders, including those related to aggressiveness. AIM: This study investigated the effects of standard drugs as well as NOP receptor ligands on aggressiveness in mice submitted to the resident-intruder test. METHODS: Male Swiss mice were used to develop this study. Valproate 300 mg/kg, Lithium 50 mg/kg, Carbamazepine 20 mg/kg, and Diazepam 1 mg/kg were used as standard drugs. The NOP ligands Ro 65-6570 (0.01 ? 1 mg/kg), full agonist, AT-090 (0,01 ? 0,1 mg/kg), partial agonist, and SB-612111 (1 ? 10 mg/kg), antagonist, were used. In the resident-intruder test, male mice were housed individually for 7 days (residents) before the experiment. The aggressiveness of each resident mouse was tested twice, at 8th and 11th days, by inserting an intruder mouse in the resident cage for 10 min. Day 8 of experiment, the basal aggressiveness of resident mice was recorded without pharmacological treatment; Day 11 of experiment, the same mouse was re-tested after being treated. The open field was used to evaluated the spontaneous locomotor activity . RESULTS: Valproate, Lithium, and Carbamazepine reduced the aggressive behavior of resident mice, while Diazepam did not affect the agressiveness. Ro 65-6570 (at all doses) and AT-090 (at the highest dose), increased aggressiveness. The partial agonist, AT-090, at lowest doses, slightly reduced aggressive behavior. The treatment with SB-61211 did not modified the aggressive behavior of mice. None of the treatments affected the locomotor activity. CONCLUSION: Standard drugs used in therapy for psychiatric disorders were effective on aggressiveness control in the resident mice. In contrast, the activation of NOP receptor tends to increase the aggressive behavior, while the blockade of this signal did not modify this behavior. Ultimately, these data suggest that NOP agonists could increase aggressive behavior as an adverse event.

Bacteria use specialized systems, called secretion systems, in order to translocate substrates to the environment or to other cells, or even to uptake molecules from the exterior environment. Six different secretion systems have been described in Gram-negative bacteria. The Type IV Secretion System (T4SS) is involved in translocation of virulence factors, bacterial conjugation, uptake and release of DNA, and in the secretion of antibacterial toxins. The T4SS channel corresponds to a toroidal upramolecular complex consisting of 14 repetitions of the VirB7-VirB9-VirB10 heterotrimer. This channel, also called \"core complex\", is divided in two layers, an outer layer consisting of the VirB7 lipoprotein in complex with the C-terminal domains of VirB9 (VirB9CT) and VirB10 (VirB10CT), and an inner layer composed by the N-terminal domains of VirB9 (VirB9NT) and VirB10 (VirB10NT). Xanthomonas citri pv. citri (Xac) is a gram-negative bacterium that infects citrus plants causing a disease called \"citrus canker\". Although not directly involved in causing the disease, the chromosomally encoded T4SS is responsible for the secretion of toxins, working as a bacterial killing machine (Souza et al., 2015). The three-dimensional structure of Xac\'s VirB7 obtained by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy (PDB 2L4W) revealed that, unlike the canonical VirB7, Xac\'s VirB7 consists of a flexible N-terminal domain followed by a C-terminal globular domain. The flexible N-terminal tail is involved in interaction with VirB9CT. In this thesis, the NMR structure of the complex formed between VirB9CT and a peptide derived from the N-terminal tail of Xac-VirB7 (VirB7NT) was solved. This complex is stabilized by hydrophobic interactions involving the side chains of particular amino acid residues such as Phe30, Trp34 and Val37 in VirB7, and Arg250, Tyr167 and Tyr169 in VirB9. Mutations of such amino acids affect not only the stability of the VirB9:VirB7 complex in vitro, but also reduce the T4SS activity and impairs its assembly in vivo. Furthermore, the ability of forming VirB7:VirB7 oligomers is essential for a functional T4SS, although it is not required for assembling the complex. The structural propensity and flexibility of a fragment derived from the proline-rich region (PRR) of the N-terminal tail of VirB10 (VirB10NT - residues 85 to 182) were studied. Measurements of the {1H}-15N heteronuclear NOE showed that VirB10NT is highly flexible on a sub-nanosecond time scale. Analysis of chemical shifts and NOEs showed that the ensemble and time average conformation of VirB10NT consists of a short alpha helix between residues 151-163, and that this helix is involved in interactions with VirB9NT. These findings provide the first compelling evidence for the interaction between the N-terminal domains of VirB9 and VirB10, and for the existence of significant flexibility within Xacs T4SS. / Bactérias usam sistemas especializados, denominados sistemas de secreção, a fim de translocar substratos para o ambiente ou para outras células, ou até mesmo para capturar moléculas do meio externo. Seis diferentes sistemas de secreção foram descritos em bactérias gram-negativas. O Sistema de Secreção do Tipo IV (T4SS) está envolvido na translocação de fatores de virulência, conjugação bacteriana, absorção e liberação de DNA, e secreção de toxinas antibacterianas. O canal do T4SS (core complex) corresponde a um complexo formado por 14 repetições do heterotrimero VirB7-VirB9-VirB10. A camada externa deste canal é constituída por VirB7 em complexo com os domínios C-terminal de VirB9 (VirB9CT) e VirB10 (VirB10CT). Os domínios N-terminal de VirB9 (VirB9NT) e VirB10 (VirB10NT) formam a camada interna do core complex. Xanthomonas citri pv. citri (Xac) é uma bactéria gram-negativa que infecta plantas cítricas causando uma doença chamada \"cancro cítrico\". Embora não esteja diretamente envolvido na infecção, o T4SS cromossomal secreta toxinas capazes de matar outras bactérias gram-negativas. VirB7 de Xac possui uma cauda N-terminal flexível e um domínio globular C-terminal ausente em outras proteínas VirB7. VirB7 interage com VirB9CT através de sua cauda N-terminal. Nesta tese, a estrutura de RMN do complexo formado por VirB9CT e um peptídeo derivado do segmento N-terminal de VirB7 foi resolvida. O complexo é estabilizado, principalmente, por interações hidrofóbicas envolvendo as cadeias laterais de determinados resíduos de aminoácidos, particularmente a Phe30, o Trp34 e a Val37 em VirB7 e a Arg250, a Tyr167 e a Tyr169 em VirB9. A substituição de alguns destes aminoácidos por alanina afeta não só a constante de dissociação do complexo in vitro, como também a atividade e a montagem do T4SS in vivo. Além disso, resíduos específicos envolvidos em oligomerização de VirB7 são essenciais para a manutenção de um T4SS funcional, embora não sejam essenciais para a montagem do sistema. Estudos estruturais, de dinâmica e de interações de um fragmento derivado da região rica em prolinas (proline-rich region - PRR) contida no N-terminal de VirB10 (VirB10NT - resíduos 85-182) também foram realizados. Medidas de {1H}-15N NOE heteronuclear mostraram que VirB10NT é altamente flexível. Análises de deslocamentos químicos e NOEs mostrou que VirB10NT forma uma hélice curta entre os resíduos 151-163. Ensaios de interação por RMN indicaram que esta hélice está envolvida em interações com VirB9NT. Estes resultados são a primeira evidência convincente para a especificidade de interação entre os domínios N-terminal de VirB9 e VirB10. Estes dados apontam também para a existência de flexibilidade dentro do T4SS de Xac.

Orientadores: Fernando José Von Zuben, Rodrigo Villares Portugal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:36:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Righetto_RicardoDiogo_M.pdf: 5898819 bytes, checksum: c98b9e2b61390aa847a4a6040d3f550b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Análise de Partículas Isoladas é uma técnica que permite o estudo da estrutura tridimensional de proteínas e outros complexos macromoleculares de interesse biológico. Seus dados primários consistem em imagens de microscopia eletrônica de transmissão de múltiplas cópias da molécula em orientações aleatórias. Tais imagens são bastante ruidosas devido à baixa dose de elétrons utilizada. Reconstruções 3D podem ser obtidas combinando-se muitas imagens de partículas em orientações similares e estimando seus ângulos relativos. Entretanto, estados conformacionais heterogêneos frequentemente coexistem na amostra, porque os complexos moleculares podem ser flexíveis e também interagir com outras partículas. Heterogeneidade representa um desafio na reconstrução de modelos 3D confiáveis e degrada a resolução dos mesmos. Entre os algoritmos mais populares usados para classificação estrutural estão o agrupamento por k-médias, agrupamento hierárquico, mapas autoorganizáveis e estimadores de máxima verossimilhança. Tais abordagens estão geralmente entrelaçadas à reconstrução dos modelos 3D. No entanto, trabalhos recentes indicam ser possível inferir informações a respeito da estrutura das moléculas diretamente do conjunto de projeções 2D. Dentre estas descobertas, está a relação entre a variabilidade estrutural e manifolds em um espaço de atributos multidimensional. Esta dissertação investiga se um comitê de algoritmos de não-supervisionados é capaz de separar tais "manifolds conformacionais". Métodos de "consenso" tendem a fornecer classificação mais precisa e podem alcançar performance satisfatória em uma ampla gama de conjuntos de dados, se comparados a algoritmos individuais. Nós investigamos o comportamento de seis algoritmos de agrupamento, tanto individualmente quanto combinados em comitês, para a tarefa de classificação de heterogeneidade conformacional. A abordagem proposta foi testada em conjuntos sintéticos e reais contendo misturas de imagens de projeção da proteína Mm-cpn nos estados "aberto" e "fechado". Demonstra-se que comitês de agrupadores podem fornecer informações úteis na validação de particionamentos estruturais independetemente de algoritmos de reconstrução 3D / Abstract: Single Particle Analysis is a technique that allows the study of the three-dimensional structure of proteins and other macromolecular assemblies of biological interest. Its primary data consists of transmission electron microscopy images from multiple copies of the molecule in random orientations. Such images are very noisy due to the low electron dose employed. Reconstruction of the macromolecule can be obtained by averaging many images of particles in similar orientations and estimating their relative angles. However, heterogeneous conformational states often co-exist in the sample, because the molecular complexes can be flexible and may also interact with other particles. Heterogeneity poses a challenge to the reconstruction of reliable 3D models and degrades their resolution. Among the most popular algorithms used for structural classification are k-means clustering, hierarchical clustering, self-organizing maps and maximum-likelihood estimators. Such approaches are usually interlaced with the reconstructions of the 3D models. Nevertheless, recent works indicate that it is possible to infer information about the structure of the molecules directly from the dataset of 2D projections. Among these findings is the relationship between structural variability and manifolds in a multidimensional feature space. This dissertation investigates whether an ensemble of unsupervised classification algorithms is able to separate these "conformational manifolds". Ensemble or "consensus" methods tend to provide more accurate classification and may achieve satisfactory performance across a wide range of datasets, when compared with individual algorithms. We investigate the behavior of six clustering algorithms both individually and combined in ensembles for the task of structural heterogeneity classification. The approach was tested on synthetic and real datasets containing a mixture of images from the Mm-cpn chaperonin in the "open" and "closed" states. It is shown that cluster ensembles can provide useful information in validating the structural partitionings independently of 3D reconstruction methods / Mestrado / Engenharia de Computação / Mestre em Engenharia Elétrica

Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o causador do cancro de plantas cítricas. Entre os potenciais fatores de virulência codificados por Xac, está o Sistema de Secreção do Tipo IV (T4SS), um grande complexo multiprotéico que atravessa o periplasma e as membranas interna e externa de bactérias Gram-negativas. O T4SS está envolvido com secreção de proteínas e/ou DNA para o meio extracelular ou diretamente no interior da célula do hospedeiro. Este Sistema requer tipicamente 12 proteínas para realizar suas funções: VirB1-VirB11 e VirD4. O T4SS codificado pelo cromossomo de Xac está aparentemente incompleto, devido a não codificar nenhuma proteína com similaridade de seqüência a VirB7. Os objetivos deste trabalho são estudar a estrutura, função e interações das proteínas do T4SS de Xanthomonas. Foram clonados 23 genes que codificam proteínas ou domínios relacionados ao T4SS, e os polipeptídeos foram produzidos de forma recombinante em E. coli. Treze deles foram purificados e submetidos a estudos estruturais, espectroscópicos e de interações proteína-proteína. A estrutura em solução de Xac262224-139 foi resolvida, apresentando uma região N-terminal desenovelada de aproximadamente 30 resíduos e um domínio globular. Este polipeptídeo oligomeriza em troca química rápida na escala de tempo de RMN e o seu N-terminal desenovelado reconhece o domínio C-terminal de VirB9 (VirB9154-255) em troca lenta. Análise de RMN demonstrou que VirB9154-255 possui uma estrutura flexível em solução, sofrendo uma marcante mudança conformacional na presença de Xac262224-139. Ambas proteínas se tornam rígidas após a interação. Xac2622 é o equivalente a VirB7 em Xanthomonas, baseado na localização do seu gene no lócus do T4SS, localização subcelular predita do polipeptídeo codificado e sua interação com VirB9. Porém, diferente de outras proteínas da família VirB7, Xac2622 possui um domínio globular adicional, com topologia e estrutura similares a domínios presentes apenas em proteínas associadas à membrana externa de bactérias Gram-negativas. Nocaute do gene xac2622, contudo, não afetou a virulência de Xac na infecção de plantas de laranja pêra. O domínio enovelado de Xac2622 foi cristalizado, e os cristais obtidos difrataram até uma resolução de 1,0 Å, pertencendo ao grupo espacial C2221. O modelo preliminar possui Rfactor de 0,121 e Rfree de 0,147. Foram obtidos cristais de outras 3 proteínas relacionadas ao T4SS de Xac, porém somente um deles difratou em alta resolução (2,0 Å, pertencendo ao grupo espacial C2). O potencial sinal de secreção pelo T4SS de Xanthomonas é um domínio C-terminal conservado de aproximadamente 115 resíduos, encontrado nos substratos putativos do T4SS. Caracterizamos um destes domínios, presente na proteína Xac2609, e ele é intrinsicamente desestruturado. Essa observação pode ter implicações funcionais, visto que os substratos são desenovelados antes de sua passagem pelo canal de secreção do T4SS / Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a gram-negative bacterial phytopathogen that infects citrus. One possible virulence determinant is a chromosomally encoded Type IV Secretion System (T4SS), a multiprotein complex that spans the bacterial periplasm and both inner and outer membranes. The T4SS is used by some bacteria to secrete proteins and/or DNA to the extracellular milieu or the host interior. The model T4SS from Agrobacterium tumefaciens is made up of twelve structural proteins: VirB1-VirB11 and VirD4. The Xanthomonas T4SS is apparently incomplete because of the lack of a polypeptide with sequence similarity to VirB7. The aim of this project is the study of structure-function relationships in the Xanthomonas T4SS. Twenty-three T4SS protein-coding genes, including full-length proteins or domains, were cloned and the proteins were produced in different E. coli strains. Thirteen polypeptides were purified and some of them were submitted to structural, spectroscopic and protein-protein interaction studies. We used NMR to solve the solution structure of Xac262224-139 which consists of an unfolded N-terminal segment of ~30 residues followed by a globular domain. Xac262224-139 oligomerizes in fast exchange at the NMR time scale and interacts via its unfolded N-terminus with the VirB9 C-terminus (VirB9154-255) in slow exchange. NMR analysis showed that VirB9154-255 has a flexible structure in solution. However, this polypeptide undergoes a significant conformational modification in the presence of Xac2622,24-139 and both proteins become rigid upon interaction. Xac2622 is the Xanthomonas VirB7, based on the chromosomal localization of its gene, predicted subcellular localization and protein interaction analysis. But surprisingly, unlike other VirB7 proteins, Xac2622 has an extra C-terminal folded domain whose topology and structure are strikingly similar to that of periplasmic domains found in outer membrane proteins of many bacterial Secretion Systems. Knockout of the xac2622 gene, however, does not affect the Xac virulence in orange leaf infection assays. The Xac2622 folded domain was also crystallized, and these crystals diffracted up to 1.0 Å resolution and belong to the space group C2221. The preliminary refined model has Rfactor of 0.121 and Rfree of 0.147. Crystals of three other T4SS proteins have been obtained, but only one of them diffracted to high resolution (2.0 Å; space group C2). Xac2610 is a hypothetical protein whose gene is located in the T4SS locus, and its interactions were studied with VirB9, VirB11 and Xac2609, a putative T4SS substrate. The potential T4SS secretion signal is a conserved, approximately 115 residues, C-terminal domain found in the putative substrates of the Xanthomonas T4SS. This sequence mediates interactions with VirD4. We have characterized this domain from one substrate and it is mainly unfolded. This observation may have functional implications, as the substrates are unfolded before their secretion through the T4SS channel