Les inteïnes són dominis proteics que mitjançant un procés de tall i unió s’autoescindeixen de la cadena polipeptídica precursora i catalitzen la unió de les seqüències flanquejants (exteïnes) mitjançant un enllaç peptídic. Actualment, la trans inteïna Npu DnaE és una de les que més s’utilitza en diferents aplicacions biotecnològiques. En aquest treball s’ha estudiat i comparat la termoestabilitat que presenta la inteïna Npu DnaE formant una única cadena polipeptídica, quan es troba partida en dos fragments associats i del fragment IN aïllat. Per altra banda, s’ha estudiat com afecta a l’activitat de la inteïna les substitucions de Cys1 i Cys+1 per una Ser. Finalment, s’ha estudiat i complementat el coneixement del procés associatiu dels fragments IN i IC a partir de tres variants de Npu DnaE amb diferents llargades del fragment IC, utilitzant ressonància magnètica nuclear. / Inteins are protein domains that self-excise from a polypeptide chain precursor and catalyze the ligation of the flanking sequences (exteins) with a peptide bond. Currently, Npu DnaE is one of the best split inteins that is used in different biotechnological applications. In this work we have studied the thermal stability of this intein when it is forming a single polypeptide chain, when it is split into two fragments associated and when the IN fragment is isolated. Furthermore, we studied how the activity of the intein is altered when substituting Cys+1 and Cys1 by Ser. Finally, we have studied and complemented what is known about the associative process between IN and IC fragments. To accomplish this, we have studied by nuclear magnetic ressonance, three variants of Npu DnaE with different lengths of IC fragment.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000389155-Texto+Parcial-0.pdf: 120483 bytes, checksum: 667f3c4666244e3dd47637233492ec4f (MD5) Previous issue date: 2007 / Diferentes estudos têm demonstrado que a Hsp70 de Mycobacterium tuberculosis (TBHsp70) pode induzir a remissão de modelos de doenças auto-imunes. Entretanto, o mecanismo pelo qual esta proteína exibe propriedades imunorregulatórias necessita ser elucidado. Neste estudo, nos perguntamos se a TBHsp70 poderia suprimir a rejeição em um sistema de transplante alogeneico de tumor. Nós observamos que enquanto camundongos BALB/c (H-2d) rejeitam melanócitos B16F10 (H-2b) implantados de forma subcutânea, animais BALB/c tratados com TBHsp70 não rejeitam o enxerto de forma similar aos tratados com Dexametasona (DEXA). O tratamento com TBHsp70 inibiu a proliferação de células T induzidas por mitógeno no linfonodo drenante e, finalmente, células T CD4, CD25 e Foxp3 foram observadas no sítio de enxertia e nos linfonodos drenantes de animais tratados com esta proteína. Nossos resultados apontam para um papel imunossupressor da TBHsp70, e sugerem que a indução de células T regulatórias poderia ser o mecanismo pelo qual esta proteína suprime a rejeição ao enxerto.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000423837-Texto+Completo-0.pdf: 3323767 bytes, checksum: 8540f43fe0c310d46371629da67c4e9a (MD5) Previous issue date: 2010 / Originally, the concept of myelin considered it an evolutionary innovation exclusive to jawed vertebrates, but that dogma has been challenged by the identification of structures morphologically similar to myelin in invertebrates’ independent groups, including annelids and crustaceans. Until the present moment, the descriptions of invertebrate myelin are mainly based in morphological data and shows sheaths with varied compaction and cellular origin wrapped, both spirally or concentrically, axons with different calibers in appendages and nerve cords. To establish the myelin evolutionary origins and intergroup relationships, very important elements are missing, and that work had as objective study shrimps’ myelin from a molecular perspective. Aiming to identify the proteins components Litopenaeus vannamei myelin sheaths, a myelin enriched fraction was isolated from adult animals’ nerve cords and submitted to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPit) proteomic analysis. MudPit was chosen to sidestep the bias of 2D-PAGE against either highly charged or transmembrane proteins. From the 23668 peptides detected, 311 proteins were identified, using the algorithms Mascot and Blast, among which several are nervous system constituents previously reported in vertebrates’ myelin fractions, and many immunoglobulin peptides. When vertebrate myelin typical proteins were pursued, however, only peptides related to proteolipid protein (PLP) were identified. Further search for PLP was performed in the L. vannamei genome sequence incomplete database and resulted in the identification of additional sequences. These findings demonstrates that shrimp myelin have a proteic profile similar to vertebrates’ myelin fractions, also was identified, for the first time in that specie, amino acid sequences related to PLP, one of the most abundant protein in tetrapods’ myelin. Based on the identification of multiple peptides corresponding to immunoglobulin domains typical from adhesion proteins, was used an antibody that recognizes both mammalians’ myelin associated glycoprotein (MAG) isoforms in L. vannamei nerve cords’ frozen section. The results showed a specific binding that needs to be explored with complementary strategies to confirm the identity of shrimp’s myelin antigen. This result suggests the presence, in L. vannamei myelin, of proteins with similar characteristics to those described in vertebrate myelin. These findings, summed to complementary strategies, can contribute to know better myelin’s advent in evolution and the relationship among myelinated animals groups. / Originalmente conceituava-se a mielina como uma inovação evolutiva exclusiva dos vertebrados com mandíbulas, capaz de permitir o aumento na velocidade de transmissão de impulsos nervosos graças à transmissão saltatória. Este conceito tem sido desafiado pela identificação de estruturas morfologicamente equivalentes à mielina em grupos independentes de invertebrados, incluindo anelídeos e crustáceos capazes de garantir propagação de impulsos nervosos em velocidades superiores à de vertebrados. Até o presente momento, a maioria das descrições da mielina dos invertebrados é baseada em dados morfológicos e mostram lamelas com variados graus de compactação e origem celular, envolvendo espiralmente ou concentricamente axônios de diversos calibres nos apêndices corporais ou cordões nervosos destes animais. Para estabelecer as origens evolutivas da mielina e a relação intergrupo, elementos importantíssimos, como a descrição das proteínas componentes, estão faltando. Este trabalho teve como objetivo realizar uma análise do conteúdo protéico da mielina do camarão Litopenaeus vannamei. Para identificar as proteínas componentes das lamelas da mielina uma sub-fração enriquecida em mielina preparada a partir do cordão nervoso ventral de animais adultos foi submetida à análise proteômica pela técnica de identificação multidimensional de proteínas (MudPit). MudPit foi escolhido para otimizar a chance de detecção de proteínas carregadas ou transmebranas, que não são detectadas por 2D-PAGE. Dos 23668 peptídeos detectados, 311 proteínas foram identificadas através do emprego dos algoritmos Mascot e Blast, entre as quais proteínas constituintes do sistema nervoso previamente reportadas nas frações de mielina de vertebrados. Quando proteínas típicas da mielina de vertebrados foram procuradas, apenas peptídeos relacionados à proteína proteolipídica (PLP) foram identificados. Uma busca complementar por seqüências de PLP no banco de dados de ESTs de L. vannamei resultou na identificação de seqüências adicionais. Estes achados demonstram que as proteínas presentes na mielina do L. vannamei refletem um perfil semelhante a frações de mielina de vertebrados, e também a identificação de seqüências relacionadas a PLP, uma das proteínas mais abundantes na mielina dos tetrápodes, pela primeira vez. Com base na identificação de múltiplos peptídeos correspondendo a domínios imunoglobulina típicos de proteínas de adesão na fração de mielina do camarão, utilizamos um anticorpo capaz de reconhecer as duas isoformas da glicoproteína associada à mielina (MAG) de mamíferos em cortes de cordão nervoso de L. vannamei. Os resultados demonstraram uma ligação específica que deverão ser explorados com estratégias complementares a fim de se confirmar a identidade do antígeno presente na mielina do camarão. Estes resultados sugerem a presença de proteínas com características próximas às já descritas na mielina dos vertebrados na mielina de L. vannamei. Estes achados, somados a estratégias complementares, podem contribuir para o melhor entendimento do surgimento da mielina ao longo da evolução e da relação entre os grupos de animais que apresentam mielina.

Orientador: Siu Mui Tsai / Banca: Marco Aurelio Takita / Banca: Mauricio Bacci Junior / Resumo: Linhagens de Xylella fastidiosa de diferentes hospedeiros, incluindo citros, café, pêssego, videira entre outros, foram utilizadas para construir uma relação filogenética a partir da análise de seqüências completas de nucleotídeos do espaço intergênico 16S-23S rDNA. Dadas as dificuldades encontradas frente ao uso dos primers utilizados para o sequenciamento da região genômica em questão, fez-se necessária a construção de novos primers baseada em dados após alinhamento e comparação com as seqüências disponibilizadas pelo NCBI e com as obtidas neste trabalho. Os "primers" propostos previamente para amplificação da região 16S-23S em Xylella fastidiosa, foram também testados sem muito sucesso uma vez que produzem fragmentos muito extensos e, para a obtenção de seqüências adequadas seria necessário o uso de outras técnicas moleculares mais dispendiosas para obtenção da seqüência completa, o que levaria tempo e custo maiores. Os métodos utilizados tanto para alinhamento de seqüências bem como a construção da árvore filogenética são baseados no princípio cladístico. As seqüências completas do espaço intergênico obtidas, revelaram um nível de variação de bases maior do que a encontrada em seqüências do gene 16S do mesmo organismo (99,0 a 100%), com valores de similaridade que variam em torno de 80 a 100%. A linhagem originada de plantas de pêra, que apresentou uma maior discrepância nos valores, foi tomada como um grupo externo aos dos outros hospedeiros. Baseado no cladograma apresentado, os resultados revelaram que as linhagens de citros e café puderam ser separadas quando se usa o método cladístico de análise, já pela metodologia baseada em princípios fenéticos esta separação não foi possível. Foi possível também agrupar os isolados em três... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: The phylogenetic relationships among Xylella fastidiosa isolates from different hosts were studied, using primers specific for the 16S-23S rDNA intergenic spacer region. Strains isolated from a wide range of host plants were studied - citrus, coffee, grapevine, elm, periwinkle, and others. Current methods for sequencing the 16S-23S spacer regions are laborious because of the large fragment obtained when using the specific primers. Nevertherless, the sequences obtained with this primers did not contribute with significant information, as only partial sequences were obtained. It's necessary other methods to complement in order to obtain a complete sequence of the spacer region. This methods include cloning and the use of internal primers. In order to establish an easier method to sequencing the spacer region, were constructed a new primer pair to facilitated the sequencing and the sequences obtained was complete. The 16S-23S intergenic spacer region analysis showed a higher level of variation than that found in 16S sequences, with similarity values ranging from 80% to 100%. The pear strain, that showed the most variable values, was used as the outgroup. The cladogram constructed by using cladistic methods allowed the grouping of three major clusters: the citrus-coffee-some grapevines- mulberry, the periwinkle-ambrosia, and the others hosts. The citrus and coffee strains could be phylogeneticly separated from this method while by the 16S sequences and the 16S-23S by the phenetic method they couldn't. A phenogram based on similarity data is useful for observing relationships based on share characters. However, its does not necessarily represent the evolutionary histry of the taxa. With the cladistic approach, hypothetical genealogical relationships among Xylella fastidiosa strains... (Complete abstract, click electronic address below). / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Danyelle Mayara Silva (danielemaiara@gmail.com) on 2009-09-08T21:00:32Z No. of bitstreams: 0 / Rejected by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br), reason: Danyelle, a sua submissão está incompleta; falta preencher o campo Informações adicionais (se não tiver no trabalho, vc faz conforme o modelo do manual) e carregar o arquivo protegido. Luanna on 2009-09-09T12:13:21Z (GMT) / Submitted by Danyelle Mayara Silva (danielemaiara@gmail.com) on 2009-09-16T19:26:02Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Larissa Arrais Guimaraes.pdf: 3615382 bytes, checksum: 3bcb389577949a9aaaedf45d88977f66 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T13:45:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Larissa Arrais Guimaraes.pdf: 3615382 bytes, checksum: 3bcb389577949a9aaaedf45d88977f66 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T13:45:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Larissa Arrais Guimaraes.pdf: 3615382 bytes, checksum: 3bcb389577949a9aaaedf45d88977f66 (MD5) Previous issue date: 2008 / O gênero Brachiaria é composto por apresenta espécies com plantas de modo de reprodução sexual e apomítico. Na reprodução apomítica, o saco embrionário se diferencia de uma célula não reduzida e o desenvolvimento do embrião se dá sem fertilização da oosfera. Genes tipo MADS-Box são fatores de transcrição relacionados com o desenvolvimento de órgãos florais. A caracterização desses genes homeóticos em Brachiaria brizantha poderá contribuir para o entendimento da diferenciação dos órgãos reprodutivos nos diferentes tipos de reprodução. O objetivo deste trabalho foi analisar o perfil de expressão de genes da família MADS-Box, visando relacionar a atuação destes genes com a sexualidade e a apomixia. Duas seqüências MADS-Box, contigs 38 e 119, foram identificadas em bibliotecas de cDNA de ovários em megasporogênese e megagametogênese de Brachiaria brizantha apomítica e sexual. Análises filogenéticas demonstraram que a seqüência de aminoácidos deduzida do contig 38 é próxima a AGL6 e a do contig 119 de SEPPALATA 2 (SEP2) de Arabidopsis thaliana. Análises de qRT-PCR e RT-PCR indicaram repressão dos genes referentes a ambos os contigs em ovários em megasporogênese de B. brizantha apomítica. Transcritos destes genes foram localizados em ovários, anteras e meristemas florais de plantas apomíticas e sexuais nos diversos estágios. A expressão foi equivalente em plantas apomíticas e sexuais, no caso de BbrizAGL6. Os resultados obtidos neste trabalho associados a dados da literatura em outras espécies sugerem o envolvimento dos genes correspondentes aos contigs 38 e 119 na identidade do órgão floral e do meristema de B. brizantha. Sugerimos que estes genes sejam nomeados BbrizAGL6 e BbrizSEP2, respectivamente. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Brachiaria genus has species containing sexual and apomictic plants. In apomictic reproduction, embryo sac differentiates from an unreduced cell and the embryo develops in absence of egg cell fertilization. MADS-Box genes are transcription factors that are involved in floral organ formation. The characterization of these homeotic genes in Brachiaria brizantha can contribute for the understanding of reproductive organs differentiation in apomicitc and sexual plants. The objective of the present work was to analyze the MADS-Box genes expression profile, aiming to correlate their activity with apomixis and sexuality. Two MADS-Box sequences, contigs 38 and 119, were identified in cDNA libraries of ovaries in megasporogenesis and megagametogenesis from sexual and apomictic Brachiaria brizantha. Phylogenetic analysis showed that the contig 38 deduced aminoacid sequence is close to AGL6 and contig 119 to SEPPALATA 2 (SEP2) from Arabidopsis thaliana. qRT-PCR and RTPCR analysis indicated downregulation of the genes associated to both contigs in ovaries of apomictic B. brizantha during megasporogenesis. The transcripts of these genes were localized in ovaries, anthers and floral meristems of apomictic and sexual plants in different stages of development. Their expression was equivalent in apomictic and sexual plants, in case of BbrizAGL6. The data obtained at this work compared with results from other plants species reported at the literature suggest that the genes associated to contig 38 e 119 are involved with the identity of floral organs and the meristem of B. brizantha. It is suggested that these genes were named BbrizAGL e BbrizSEP, respectively.

As plantas possuem um arsenal de substâncias utilizadas como defesa contra patógenos e predadores. A possibilidade de utilizar tais substâncias como biopesticidas revolucionou o estudo das proteínas tóxicas. Proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) e as ureases estão entre as proteínas que são abundantes em plantas. RIPs tipo 2 como a ricina, são muito tóxicas, e podem despurinar ribossomos de várias espécies e induzir lesão em DNA, levando à interrupção da síntese protéica e morte de células. Menos tóxicas que a ricina, a maior parte das RIPs conhecidas são do tipo 1 com apenas uma cadeia polipeptídica de 25 - 32 kDa. As ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de níquel, que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. A semente do feijão-de-porco, Canavalia ensiformis, é fonte rica de isoformas de urease, entre elas, a canatoxina (CNTX). A proteína CNTX apresenta atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos, e sua toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10kDa (pepcanatox), que ocorre por ação das catepsinas do sistema digestivo dos insetos suscetíveis. Um peptídeo equivalente ao pepcanatox foi obtido por expressão heteróloga em Escherichia coli - Jaburetox-2Ec, o qual apresentou atividade tóxica contra Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus e Blatella germanica. Nesse trabalho demonstramos a atividade inseticida de cinco RIPs tipo 1 (PAP-S, gelonina, momordina, saporina-S6 e licnina) em Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis. As RIPs mostraram um efeito entomotóxico espécie-específico para as lagartas, sendo que momordina foi a menos tóxica nos bioensaios. Perda de peso mais pronunciada foi observada em S. frugiperda no 4° dia após o início dos ensaios e para a A. gemmatalis, no 10° dia. A indução da mortalidade (larval e/ou pupal) foi de 57,13% para os tratamentos em A. gemmatalis e 29,45% para S. frugiperda. Para investigar o efeito deterrente de RIPs tipo 1 em insetos, verificou-se, através do teste cometa, o nível de danos ao DNA em tecidos de S. frugiperda e A. gemmatalis que ingeriram um total de 40 μg de RIPs. Os insetos tratados com RIPs mostraram um valor 2 a 3 vezes maior de células com sinais de dano de DNA do que o controle. O dano de DNA poderia ser conseqüência do estresse oxidativo, assim analisou-se atividade de enzimas antioxidantes CAT e SOD e níveis de peroxidação lipídica (TBARS) nos extratos celulares dos insetos, mas não houve uma correlação entre dano de DNA e marcadores de estresse oxidativo. O peptídeo recombinante derivado de urease, jaburetox-2Ec, induziu uma mortalidade de 100% de S. frugiperda após ingestão de 47μg do peptídeo. Em contraste com os dados obtidos com as RIPs, o jaburetox-2Ec não causou lesões no DNA ou alterações em marcadores do balanço redox em S. frugiperda evidenciando um mecanismo de ação distinto. Em linhagens de células de insetos em cultura (Tn5B e UFL-AG-286), a análise citomorfológica sugeriu a ocorrência de citotoxicidade e lise celular com exposição a 80 e 10 μg do jaburetox-2Ec, após 4 e 7 dias de incubação, respectivamente. Para compreender a ação do peptídeo entomotóxico em células de insetos, realizou-se testes de citotoxicidade utilizando o kit CyTotox-GloP TM P incubando-se células UFL-AG-286 e Sf21 com jaburetox-2Ec. Os resultados com esse kit não foram conclusivos, sugerindo que o peptídeo recombinante seria capaz de inibir as proteases intracelulares liberadas na lise celular. Nossos resultados mostraram que RIPs tipo 1 e o jaburetox-2Ec têm efeito inseticida em lepidópteros por mecanismos distintos, sendo que as RIPs tipo 1 induzem lesão de DNA em A. gemmatalis e S. frugiperda, enquanto que jaburetox-2Ec induz alterações ainda não identificadas, que resultam em morte do inseto. / The plants have an arsenal of substances used as a defense against pathogens and predators. The possibility of using these substances as biopesticides revolutionized the study of toxic proteins. Ribosomes-inactivating proteins (RIPs) and ureases are among the proteins that are abundant in plants. Type 2 RIPS, such as ricin, are highly toxic and depurinate ribosomes of different species and induce DNA damage, arresting protein synthesis and leading to cell death. Less toxic, most of the known RIPs are type 1, composed of a single polypeptide chain of 25-32 kDa. Ureases (EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. The seed of jackbean (Canavalia ensiformis) is a rich source of ureases isoforms, one of which is canatoxin (CNTX). The protein CNTX presents insecticidal activity and its toxicity relies on an internal ~10 kDa peptide (pepcanatox) released upon hydrolysis of CNTX by digestive cathepsins of susceptible insects. A peptide equivalent to pepcanatox obtained by heterologous expression in Escherichia coli - Jaburetox-2EC, showed insecticidal activity against Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus and Blatella germanica. In this study we demonstrated the insecticidal activity of five type 1 RIPs (PAP-S, gelonin, momordin, saporin-S6 and lychnin) in Spodoptera frugiperda and Anticarsia gemmatalis. The entomotoxic effect of RIPs was species-specific and momordin was shown to be the less toxic in the bioassays. S. frugiperda had a more pronounced weight loss on the 4th day of treatment and A. gemmatalis on the 10th day. Mortality (larval and/or pupal) rate reached 57.13% for A. gemmatalis and 29.45% for S. frugiperda. To investigate the deterrent effect of type 1 RIPs in insects, the levels of DNA damage were evaluated using the comet test in tissues homogenates of S. frugiperda and A. gemmatalis fed a total of 40μg of RIPs. The RIPs-treated insects showed 2 to 3 times more cells with DNA damage, as compared to controls. To test whether DNA damage could be consequent to oxidative stress, the activity of the antioxidant enzymes SOD and CAT and levels of lipid peroxidation (TBARS) were assayed in cellular extracts of S. frugiperda and A. gemmatalis fed 40 μg RIPs, but no correlations were found between DNA damage and stress markers. The urease-derived recombinant peptide, jaburetox-2Ec, induced 100% mortality of S. frugiperda fed 47 μg peptide. In contrast to the results observed for type 1 RIPs, treatment of S. frugiperda with jaburetox-2Ec did not cause damage in DNA nor modifications in redox balance markers, indicating a distinct mechanism of action. Microscopic analysis of lepidopteran insect cells in culture (lines Tn5B and UFL-AG-286) suggested cytotoxicity and cell lysis induced by incubation with 80 and 10 μg jaburetox- 2Ec, after 4 and 7 days, respectively. Aiming to understand the mode of action of the entomotoxic peptide in insects cells, the CyTotox-GloP TM Pkit was used to detect cytotoxicity in UFL-AG-286 and Sf21 cells incubated with jaburetox-2Ec. Unexpectedly, the results were not conclusive since it appears that the recombinant peptide is able to inhibit the intracellular proteases released upon cell lysis, preventing the hydrolysis of fluorogenic substrate used in the kit. In conclusion, our results demonstrated that type 1 RIPs and jaburetox-2Ec are insecticidal to lepidopterans acting through distinct mechanisms. Thus type 1 RIPs induce DNA damage in A. gemmatalis and S. frugiperda, while jaburetox-2Ec induce yet to be identified physiological changes that lead to insect death.

Gliomas são os tumores mais comuns no SNC, apresentando altas taxas de invasibilidade e proliferação, resistência à quimio e radioterapias, e elevados índices de recorrência e morte. As células-tronco tumorais constituem uma minoria dentre as células do tumor, apresentam características de células tronco neurais podendo sofrer diferenciação e auto-renovação. Linhagens celulares de gliomas, como U87, são capazes de produzir tumoresferas quando em alta confluência, que são similares às neuroesferas produzidas por células tronco neurais, e são ricas em células tronco tumorais (CSCs). Em gliomas, CSCs podem ser identificadas por expressarem o marcador de superfície CD133. Receptores purinérgicos estão envolvidos em diversos processos biológicos. O ATP induz respostas celulares como proliferação e diferenciação, e a degradação deste nucleotídeo por células de glioma é lenta, o que resulta no seu acúmulo no espaço extracelular. O objetivo deste trabalho é identificar a população de CSCs em U87 bem como o efeito do ATP na formação de esferas, expressão do marcador CD133, a expressão de genes de receptores purinérgicos e de genes marcadores de células diferenciadas (GLAST e CAMKII) e de células indiferenciadas (CD133 e OCT-4). U87 foram mantidas em condições padrão com 5% de SFB e esferas foram obtidas através de crescimento sobre ágar 1%. RNA total foi extraído de esferas e monocamada, e os genes de interesse foram amplificados em reação de RT-PCR com primers específicos. Esferas apresentam uma maior expressão de CD133, visto por citometria e imunodetecção. O mRNA de OCT-4 também foi mais expresso em esferas do que em monocamada, que expressa mais CAMKII e GLAST. ATP em uma concentração final de 100 µM reduz significativamente o número de esferas formadas (P<0.05) durante um período de 7 dias e também reduz a expressão de CD133. Dentre os receptores purinérgicos, a expressão de P2X4 foi maior em esferas, e P2X6 em monocamada. Estes resultados indicam que as esferas possuem componentes de células tronco e que a sinalização purinérgica pode estar envolvida em importantes aspectos da biologia de CSCs. / Glioblastoma multiformes are the most aggressive tumors in the CNS and are characterized by high invasion and proliferation rates, as well as for being resistant to chemo and radiotherapies. This leads to one of the worst prognosis among cancers. Cancer stem cells (CSCs) are scarce among the tumor cells, but can undergo differentiation and self-renewal, being fundamental for tumor maintenance. Tumorspheres, which resemble neurospheres, can grow in glioma cell cultures and are rich in CSC. Additionally, CSCs seem to be more resistant to radiotherapy and strategies aimed at differentiating these stem cells have potential to produce less aggressive and more efficient treatment regimes. CSCs have been identified in different tumor types as well as in established cell lines such as the human glioma cell line U87, and are characterized by the presence of the CD133 glycoprotein. Purinergic receptors are stimulated by nucleotides and nucleosides, and are involved in many biological processes, including embryonic development. ATP induces several cellular responses, such as proliferation and differentiation, and it has been demonstrated that the degradation of this nucleotide is slow in glioma cells, which results in its accumulation in the extracellular space. The aim of this work was to characterize the CSC population in U87 and the effect of ATP in sphere formation. Spheres were obtained by plating cells on a thin layer of agar. Tumorspheres presented a higher amount of CD133 marker as analyzed by flow citometry and western blotting. mRNA expression of OCT-4, a marker of undifferentiated cells, was higher in spheres, while GLAST and CAMKII, markers of differentiated glial and neuronal cells respectively, presented higher expression in the monolayer cells. Cells plated in the presence of ATP 100 µM formed 54% less spheres (P<0.05) when compared to control and also had a reduced level of CD133 marker. Among the purinergic receptors, P2X4 expression was higher in spheres, whereas P2X6 expression was higher in the monolayer. Our results indicate that spheres have components of stem cells and that the purinergic signaling is involved in important aspects of CSC biology.

A Floresta Atlântica e a Floresta Amazônica estão entre as maiores e mais diversas florestas tropicais do mundo, com muitas de suas espécies apresentando distribuição disjunta. O estudo genético molecular dessas espécies é interessante, pois podem fornecer informações sobre o relacionamento histórico entre essas diferentes regiões geográficas. Entretanto, ainda poucos são os estudos sobre a distribuição da estrutura genética nestas áreas, principalmente para espécies vegetais. O estudo da diversidade genética em espécies arbóreas é de grande importância para a manutenção das fontes de germoplasma a serem usados em práticas de reflorestamento e para espécies com uma ampla distribuição geográfica que ocupam diferentes habitats que são componentes chaves na composição de diversos ecossistemas. O gênero Schizolobium (Caesapinioideae) apresenta ampla distribuição nos Neotrópicos e devido ao seu rápido crescimento é amplamente utilizado em programas de reflorestamento, além de apresentar importância econômica pela utilização da madeira. O presente estudo apresenta a primeira análise genética molecular do gênero Schizolobium, incluindo uma ampla amostragem de populações ao longo de sua distribuição geográfica. Um conjunto de 11 marcadores moleculares (cpDNA e ITS) foram usados para investigar a evolução, posição sistemática, estimar o tempo de divergência entre as duas variedades, verificar um possível evento de especiação, estudar os padrões biogeográficos entre as florestas Atlântica e Amazônica, além de investigar a estrutura filogeográfica em Schizolobium. Marcadores não-neutros também foram estudados na tentativa de serem usados para investigar a variação adaptativa relacionada ao estresse hídrico. Sequências parciais dos genes P5CS de quatro espécies arbóreas (Schizolobium parahyba, Ceiba pentandra, Bombacopsis quinata e Cedrela Odorata) foram clonadas, seqüenciadas e comparadas com sequências de outras espécies. A análise filogenética indicou que eventos de duplicação ocorreram várias vezes e em diferentes frequências ao longo da evolução das monocotiledôneas e dicotiledôneas. Apesar de ter sido detectada seleção positiva em diferentes regiões do genes P5CS, uma pequena quantidade de polimorfismo foi encontrado entre indivíduos de Schizolobium e não foram correlacionados com estresse hídrico. A monofilia do gênero Schizolobium foi bem suportada pelas análises de maxima parsimônia e Baysiana das regiões de cpDNA e de DNA nuclear. A idade do clado Schizolobium foi estimado em aproximadamente 15,6 milhões de anos (Mya) e as duas variedades divergiram a aproximadamente 3,1 Mya. Um elevado nível de divergência genética foi observado entre as populações de Schizolobium e os resultados indicam uma forte estruturação filogeográfica e um reduzido fluxo gênico entre elas. Além disso, nenhum haplótipo nuclear e de cpDNA foi compartilhado entre as duas variedades, evidenciando um isolamento entre elas. Foi observada similaridade nas sequências de cpDNA entre indivíduos de algumas populações da var. parahyba na Mata Atlântica (RJ3, ES, BA1, BA2 e BA3) com indivíduos das populações da var. amzonicum, indicando a possibilidade da existência de retenção de polimorfismo ancestral com pouco tempo para o acúmulo de divergência nestas regiões. Todos os dados moleculares produzidos sugerem a separação das duas variedades dentro do gênero Schizolobium, e que a sua atual divisão taxonômica necessita de revisão. Esses dados também fornecem importantes informações genéticas que podem ser aplicadas no campo da conservação e florestamento exploratório. / The Atlantic and the Amazon rain forests encompass the most diverse tropical forests in the world, with many species showing disjunct distribution. The molecular studies of widespread and disjunct species present particular interest, as they can provide information on the historical relationship between different geographical regions. However, there are few records about genetic structure in these areas mainly in plants species. Studies of genetic diversity of the tree species are very important to provide best practice policies for sourcing germplasm for reforestation within a range of degraded landscapes and for trees with a range of lifestyles that are key components of a diverse ecosystem composition. Schizolobium (Caesalpinioideae) is a widespread genus found in Neotropical forest, with a fast growing rate that make it extensively used in economically important reforestation programs that employ native trees. This study presents the first extensive molecular analysis within the genus Schizolobium, including a widespread sampling of populations from throughout their geographic distribution. A set of 11 molecular markers (cpDNA and nuclear) were used to address the evolution, systematic position, estimate the age of divergence between the two varieties, to study the biogeographic patterns between Atlantic and Amazonian rain forests and to investigate the phylogeographic structure of Schizolobium. Furthermore, non neutral markers were studied to attempt of access the adaptive variation in neotropical tree species. Partial sequences of P5CS genes from four Neotropical trees (Schizolobium parahyba, Ceiba pentandra, Bombacopsis quinata e Cedrela Odorata) were cloned and compared to those of other plant taxa. The molecular phylogenetic analysis indicated that P5CS duplication events have occurred several times following the emergence of flowering plants and at different frequencies throughout the evolution of monocots and dicots. Besides, positive selection was observed at different regions of P5CS paralogous genes, but a low polymorphism was found among individual of different areas and did not associate with water stress. The monophyletic nature of Schizolobium was well supported by both the Maximum Parsimony and Bayesian analyses of the cpDNA and nuclear regions. The Schizolobium crown node was estimated to have arisen 15.6 million years ago (Mya) and the two varieties has been diverged approximately 3.1 Mya. High levels of genetic divergence were found among the populations of Schizolobium and the results indicate a strong phylogeographic structure and a reduced gene flow between them. Besides, the cpDNA and nuclear haplotypes is not sharing between the two varieties, indicated a genetic isolation between them. The cpDNA sequence similarity of some populations from Atlantic forest (RJ3, ES, BA1, BA2 e BA3) with the var. amazonicum was observed and this may be due retention of ancestral polymorphisms with insufficient time for the accumulation of differences in these regions. The molecular data suggest the separation of the two varieties of genus Schizolobium, and current taxonomic status needs revision. These data also provides important genetic information for conservation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Aquicultura, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:40:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 325857.pdf: 1403219 bytes, checksum: 14868a2fb367ef52ef27642cd362e5e4 (MD5) Previous issue date: 2013 / A mitilicultura no Brasil se baseia no cultivo do mexilhão Perna perna (Linnaeus, 1758), que é encontrado em todo o litoral brasileiro, sendo especialmente abundante do Espírito Santo a Santa Catarina. Nos últimos anos foi lançada a hipótese de que P. perna seja uma espécie exótica no litoral brasileiro. A hipótese baseia-se na análise da malacofauna de sítios arqueológicos. Todas as contestações levantadas não remetem a uma conclusão, pois precisam de estudos específicos, com metodologias claras, aliando arqueologia, ecologia e biologia molecular. O objetivo deste trabalho foi estudar a condição de nativo ou exótico do mexilhão Perna perna no Brasil, a partir de levantamento dos resultados em sítios arqueológicos, de técnicas moleculares e de datação de conchas com C14. A datação de conchas de P. perna do sítio arqueológico do Rio do Meio/Jurerê, Florianópolis/SC, indicou que as amostras têm a idade de 720±30 e 780±30 anos. O cálculo do tempo de divergência indicou que a separação das populações brasileiras e africanas ocorreu por volta de 200 mil anos. Os resultados apontam a presença da espécie no território brasileiro muito antes do descobrimento do Brasil pelos portugueses no ano de 1500, indicando que Perna perna é de fato uma espécie nativa.<br> / Abstract : The mussel farming in Brazil is based on brown mussel Perna perna (Linnaeus, 1758), which is found throughout the Brazilian coast, with especial abundance from Espírito Santo to Santa Catarina state. In recent years, it was suggested that Perna perna is an exotic species for the Brazilian coast. The hypothesis is based on the analysis of the zooarchaeology studies in archaeological sites of Brazil. All objections raised do not offer to a conclusion, because they need specific studies with clear methodology, combining archeology, ecology and molecular biology. The objective of this work was to study the condition of the brown mussel Perna perna in Brazil if native or exotic, from survey results in archaeological sites, molecular techniques and dating of shells with C14. The dating indicated that the shells were 720±30 and 780±30 years old, respectively. The calculation of divergence time indicated that the separation of the African and Brazilian mussel populations occurred around 200 thousand years ago. The results indicate the presence of the P. perna species in Brazilian territory long before the discovery of Brazil by the Portuguese in 1500, indicating that P. perna is actually a native species of Brazil.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-31 / Objetivo geral: Caracterizacao fenotipica e genotipica de S. aureus resistentes a oxacilina (MRSA), coletados de hemoculturas provenientes de diversos centros participantes do projeto SCOPE - Brasil, no periodo de Junho de 2007 a Julho de 2009. Objetivos especificos: (i) avaliar a distribuicao dos tipos de SCCmec atraves das tecnicas de PCR convencional e PCR multiplex das diferentes instituicoes participantes; (ii) detectar a possivel presenca do gene lukF codificador da toxina PVL (Panton Valentine Leukocidin); (iii) avaliar a similaridade genetica das amostras utilizando as tecnicas de PFGE e MLST e (iv) determinar as concentracoes inibitorias minimas a oxacilina e vancomicina. Material e Metodos: Foram avaliados 62 isolados de MRSA provenientes do primeiro episodio de infeccao de corrente sanguinea (ICS) de pacientes hospitalizados em 11 centros medicos de diferentes regioes do pais. Os isolados resistentes a oxacilina foram submetidos a PCR convencional para a deteccao do gene nuc e lukF e PCR multiplex para identificar os tipos de SCCmec. Foi feito diluicao em agar e EtestR para vancomicina, PFGE e MLST. Resultados: Do total de 62 amostras, 29 amplificaram para o SCCmec tipo III, 16 amplificaram para o SCCmec tipo II, 9 amostras amplificaram para o SCCmec tipo IV, 6 amplificaram para SCCmec tipo I e 2 amostras nao foram identificadas pelas metodologias de PCR multuplex utilizadas. A amostra com SCCmec subtipo IVc apresentou o gene que codifica PVL. As amostras com SCCmec tipo I, II e III apresentaram CIM >256 ƒÊg/ml para oxacilina por EtestR com excecao de uma delas com SCCmec tipo II com CIM igual a 128 ƒÊg/ml. Seis amostras do total de nove com SCCmec tipo IV apresentaram CIM.48 ƒÊg/ml. Observamos CIMs de 1,0, 1,5 e 2,0 ƒÊg/m para vancomicina por EtestR. Quando feito a diluicao em agar, duas amostras tiveram CIM igual a 2,0 ƒÊg/ml, todas as outras apresentaram valores entre 0,5 e 1,0 ƒÊg/ml. Dentre as 8 amostras de MRSA que foram submetidas a tecnica de MLST, verificou-se ST105 em amostras com SCCmec tipo I; ST5 e ST105 para amostras com SCCmec tipo II; ST239 para amostras carreando SCCmec tipo III e ST5 e ST1176 relacionados a amostras apresentando SCCmec tipo IV. Conclusoes: Houve predominio de amostras de MRSA carreadoras de SCCmec tipo III e relacionadas geneticamente ao clone CEB. Foram detectadas amostras portando SCCmec tipo II e IV relacionados aos clones Nova Iorque/Japao e Pediatrico em diferentes hospitais e regioes do pais e ausencia do clone Chile/Cordoba. Apenas uma amostra com SCCmec tipo IV (subtipo IVc) nao relacionada a nenhum clone foi produtora de PVL. Apenas dois ancestrais geneticos comuns (CC5 e CC8) nas amostras estudadas foram observados pela tecnica de MLST, sendo caracterizado um novo ST1176. Nao foram detectadas amostras resistentes a vancomicina. / General objective: Phenotypic and genotypic characterization of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) collected from bloodcultures from several centers participants of Brazilian SCOPE Project, from June 2007 to July 2009. Specific Objectives: (i) to assess the different types of SCCmec distribution through conventional and multiplex PCR for the different participant institutions; (ii) to detect the possible presence of lukF gene, which codes for PVL toxin (Panton Valentine Leukocidin); (iii) to assess the genetic similarity of these samples through PFGE and MLST and (iv) to determine the oxacillin and vancomycin minimal inhibitory concentration (MIC). Material and Methods: Sixty two MRSA isolated from the first episode of bloodstream infection (BSI) were evaluated. These samples came from patients hospitalized at the 11 medical centers from different regions of the country. The oxacillin-resistant isolated were submitted to conventional PCR to detect nuc and lukF genes and to multiplex PCR to identify SCCmec types. Agar dilution and E-test for vancomycin were performed. The strains were molecular typed by PFGE and MLST. Results: From the total of 62 samples, 29 amplified SCCmec type III, 16 SCCmec type II, 9 SCCmec type IV, 6 SCCmec type I and 2 could not be identified. A sample with SCCmec subtype IVc carried the gene which codifies for PVL. Samples with SCCmec types I, II and III showed MIC > 256 ƒÊg/ml for oxalicin by EtestR. Just one of them, with SCCmec type II, presented MIC = 128 ƒÊg/ml. From the nine samples with SCCmec type IV, six presented MIC . 48 ƒÊg/ml. MICs of 1.0, 1.5 e 2.0 ƒÊg/ml were also observed for vancomycin by EtestR. Regarding the agar dilution, two samples presented MICs of 2.0 ƒÊg/ml and all the others showed values between 0.5 e 1.0 ƒÊg/ml. From the 8 MRSA samples typed by MLST, it was observed ST105 in a sample with SCCmec type I; ST5 and ST105 in samples with SCCmec type II, ST239 with SCCmec type III and ST5 and ST1176 with SCCmec type IV. Conclusion: The majority of samples were MRSA carrying SCCmec type III and genetically related to CEB clone. Also were detected samples SCCmec type II and IV, related to New York/Japan and Pediatric clones in different hospitals at different regions of the country. Only one sample SCCmec type IV (subtype IVc) not related to any clone was positive for PVL. Only two common genetic ancestral (CC5 and CC8) were observed through MLST and a new ST1176 was characterized. No vancomycin-resistant isolate was detected. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações