La microscopie multiphoton est une technique d'imagerie optique dont une des caractéristiques les plus remarquables est de fournir une information micrométrique en profondeur dans les tissus intacts. Un autre intérêt est la possibilité de visualiser la structure d'une cellule ou d'un tissu en utilisant des sources de contraste endogènes qui permettent une imagerie très peu invasive. De plus, divers modes de contrastes tels que la fluorescence excitée à deux photons (2PEF), la génération de seconde harmonique (SHG) ou la génération de troisième harmonique (THG) sont facilement combinables, et les applications de la microscopie multiphoton sont ainsi nombreuses et variées, dans des domaines comme les neurosciences, la cancérologie, l'embryologie,... Cependant, des progrès sont encore nécessaires dans la compréhension des contrastes optiques non-linéaires endogènes observés dans les tissus. Dans ce contexte, la génération de seconde harmonique par le collagène fibrillaire soulevait différentes questions au début de ce travail, notamment sur la spécificité de la SHG en fonction du type de collagène et sur le rôle de sa structure chirale en triple hélice dans la forte amplitude des signaux observés. L'étude du collagène est particulièrement intéressante car il représente 30 % du contenu total du corps humain en protéines. Constituant principal de la matrice extracellulaire d'une grande variété de tissus et d'organes, le collagène est impliqué dans tout remodelage de la matrice extracellulaire et dans de nombreuses pathologies, mais on manque actuellement d'outils performants pour visualiser son architecture tridimensionnelle à l'échelle micrométrique. Dans ce contexte, la microscopie SHG est un outil prometteur pour visualiser la distribution du collagène dans les tissus. Ce travail de thèse a débuté avec des expériences de génération de seconde harmonique en surface résolue en polarisation sur des films minces de molécules de collagène de type I et IV, qui nous ont permis de démontrer que la microscopie SHG est une sonde de l'organisation macromoléculaire du collagène et non pas du type de collagène. Nous avons appliqué ensuite ces résultats à l'étude de la fibrose collagénique pulmonaire et rénale dans des modèles murins, une accumulation pathologique de collagène fibrillaire qui peut conduire à une insuffisance rénale terminale ou à une insuffisance respiratoire souvent létale à terme. Nous avons démontré que la microscopie multiphoton permet de visualiser la morphologie de ces tissus, de mettre en évidence toutes les caractéristiques de ces pathologies et d'évaluer quantitativement le remodelage de la matrice extracellulaire au cours de l'évolution de la fibrose. Finalement, nous avons proposé des scores de fibrose basés sur des densités volumiques de pixels SHG qui nous ont permis d'apprécier le rôle de certains facteurs (cellules/enzymes d'assemblage) responsables de la fibrose. Ce travail devrait ainsi permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces pathologies fibrosantes.

Pour exprimer sa fonction biologique, une protéine doit adopter une conformation spatiale unique et très précisément définie. On parle de " repliement " vers la structure " native ". La compréhension des mécanismes accompagnant ce processus est actuellement l'un des principaux enjeux de la recherche en biophysique. Dans ce contexte, nous avons mis en place une technique originale de mesure du dichroïsme circulaire, permettant de suivre avec précision les dynamiques structurales de petites molécules chirales en phase aqueuse, sur des échelles de temps allant de la picoseconde à la nanoseconde. Appliquée dans le domaine de l'ultraviolet, elle permet d'étudier les premières étapes du repliement de structures secondaires modèles. Le principe de cette technique repose sur la mesure de l'ellipticité induite par un milieu chiral sur une onde initialement polarisée linéairement. Après avoir présenté cette nouvelle méthode, nous montrerons comment la mettre en œuvre expérimentalement. Nous la comparerons ensuite aux techniques usuelles de mesure du dichroïsme circulaire, et l'appliquerons à l'étude de trois molécules (myoglobine, [Ru(phen)3]2+, 1,1'-Binaphthol). Enfin, nous nous intéresserons aux premiers résultats expérimentaux obtenus dans le cadre de l'étude du repliement en hélices alpha de polypeptides modèles. Deux techniques d'initiation du repliement seront examinées : l'excitation optique d'un chromophore greffé à l'extrémité de la chaîne peptidique, puis l'induction optique d'un saut de température.

L'objectif de cette thèse était de développer des techniques de mesure de l'oxygénation cérébrale par IRM dans le contexte de l'angiogénèse tumorale. Nous avons mis en place une méthode de mesure de l'oxygénation tissulaire a partir de l'IRM du fluor-19. La réalisation d'une antenne RMN et une étude sur fantôme ont permis de calibrer la relation pO2/R1 pour la molécule d'héxafluorobenzène. Après injection intracérébrale du produit, des analyses de la pO2 dans des cerveaux de rats sains ont montré que les mesures étaient précises et variaient avec l'inspiration de différents gaz. Nous avons également développé une nouvelle méthode de mesure de l'oxygénation sanguine basée sur la quantification de l'effet BOLD. Un modèle mathématique et la combinaison de techniques de mesure du volume sanguin, du T2, T2* et de B0 ont permis d'obtenir des mesures quantitatives de la SO2. Ce protocole a été corrélé, sur cerveaux de rat sains, à des analyses de gaz du sang sous différentes conditions respiratoires. Des études sur des tumeurs cérébrales et pendant des traitements anti-cancéreux ont permis de comparer nos estimations de la SO2 a d'autres paramètres vasculaires comme le volume sanguin, l'index de taille des vaisseaux ou la perméabilité. Nous avons également confronté notre approche a l'histologie du pimonidazole, un marqueur de l'hypoxie. Enfin, nous avons développé des simulations informatiques pour estimer la précision des mesures IRM basées sur des modèles mathématiques. La combinaison de deux approches numériques récentes a permis d'intégrer a nos simulations des données réalistes de microvascularisation acquises par microscopie intravitale. Les résultats suggèrent que la modélisation des vaisseaux sanguins par des cylindres droits est justifiée, mais que la densité ou l'orientation des vaisseaux sanguins pourraient être sources d'une surestimation du volume sanguin par RMN.

Les gliomes de haut grade sont des tumeurs cérébrales de très mauvais pronostic. Le traitement standard proposé combine la chirurgie, la radiothérapie et parfois l'utilisation de témozolomide (agent de chimiothérapie). Une limitation majeure de la radiothérapie provient de la radiosensibilité des tissus sains. La radiothérapie stéréotaxique par rayonnement synchrotron est une technique innovatrice dont le principe est de combiner un rayonnement basse énergie (inférieur à 100 keV) à la présence d'atomes lourds dans la zone tumorale afin d'augmenter la dose déposée et ainsi accroître le différentiel de dépôt de dose entre la tumeur et les tissus sains environnants. Dans cette étude, plusieurs composés contenant des atomes lourds tels que les agents de chimiothérapie : cisplatine/carboplatine, un analogue d'une base de l'ADN : la 5-iodo-2'-désoxyuridine (IUdR) ou bien des nanoparticules d'or ont été considérés. Des études cellulaires ont permis de quantifier les facteurs d'augmentation de dose induits par la présence de ces composés dans l'environnement extracellulaire pour certains et intracellulaire pour d'autres. Lors d'études in vivo effectuées sur des rats porteurs de gliomes, la toxicité, cinétique de distribution et la localisation de ces composés a été déterminée, ainsi que l'efficacité potentielle du traitement associant injection cérébrale et irradiation basse énergie.

Ce travail s'attache tout autant à améliorer les techniques d'acquisition qu'à préciser les modèles physiologiques qui permettent la caractérisation de la perfusion cérébrale en IRM. La fonction d'entrée artérielle (AIF), sur laquelle repose de nombreux modèles, a été mesurée par une technique d'imagerie optique au niveau de la carotide chez le rat. La reproductibilité et la répétabilité de l'AIF sont examinées et une fonction modèle est proposée. Nous comparons ensuite deux techniques de mesure de l'index de taille des vaisseaux (VSI) chez le rat porteur d'un gliome. La technique de référence, utilisant un agent de contraste (AC) de type USPIO, est confrontée à l'approche dynamique qui estime ce paramètre au passage d'un bolus de Gd. Cette dernière technique présente l'avantage d'être utilisée en clinique. Les résultats obtenus à 4,7T par ces deux approches sont semblables et l'utilisation du VSI dans les protocoles cliniques est fortement encouragée à haut champ. Les mécanismes en jeu (relaxivités R1 et R2*) sont alors étudiés via une approche en multi-échos de gradient. Une séquence spirale multi-échos est développée et une méthode qui permet la refocalisation entre chaque écho est présentée. Cette séquence est utilisée pour caractériser l'impact des effets R1 au passage de deux injections successives de Gd. Enfin, nous avons développé un outil de simulant le signal RMN sur une géométrie 2D tenant compte de la perméabilité de la BHE et de la diffusion de l'AC dans l'espace interstitiel. A TE court, l'effet de la diffusion sur le signal est négligeable. A contrario, les effets de la diffusion et la perméabilité semblent pouvoir être séparés à temps d'écho long. Enfin nous montrons que, lors de l'extravasation de l'AC, l'homogénéisation du champ magnétique local lié à la baisse de différence de susceptibilité magnétique à l'interface vasculaire est rapidement contre balancée par les perturbations induites par les interfaces cellulaires du compartiment extravasculaire.

Le mouillage dʼun gel présente un intérêt fondamental pour la physique, lʼindustrie mais aussi en biologie: lors, par exemple, de la migration en masse de bactéries Bacilus Subtilis sur des milieux de culture gélosés où celle-ci synthétise un puissant tensioactif appelée surfactine. Un dispositif de reconstruction optique a été mis au point afin de suivre l'évolution de la surface libre d'une goutte posée à la surface d'un gel d'agar. Une goutte contenant de la surfactine s'étale spontanément. Lorsqu'elle entame sa rétraction, un front de surfactant apparaît tout autour de ses bords et se propage selon une dynamique de croissance radiale en loi de puissance du temps. Nous obtenons des exposants d'étalement remarqueblement faibles. Des scénarios expliquant cette dynamique lente sont proposés. Cette dynamique présente une dépendance vis à vis de la concentration du gel en polymères mais aussi vis à vis de la physico-chimie du milieu employé, montrant ainsi le caractère non-universel de cet exposant pour des gels aux propriétés mécaniques identiques. Nous discutons des similitudes entre nos observations et le swarming de B.Subtilis, pour lequel la dynamique du front et la croissance dendritique semblent fortement corrélées. Etonnamment, nous observons une situation de mouillage partiel dans le cas d'une goutte d'eau déposée à la surface d'un gel qui est pourtant constitué jusqu'à 99,5% du même liquide. Nous mesurons une hystérésis de mouillage importante partiellement lié au caractère déformable.du substrat Les modèles existants échouent à décrire nos mesures, nous proposons un modèle tenant compte de la tension de surface du gel qui prédit mieux nos observations.

Dans ce manuscrit nous abordons les propriétés mécaniques de fibres de chromatine à l'échelle de la molécule unique. La chromatine est la structure nucléoprotéique qui contient le génome des cellules eucaryotes. À ce titre, cette fibre est soumise à de nombreuses contraintes mécaniques, telle la torsion, lors des processus de transcription, de réplication ou bien encore de réparation. Une revue des connaissances concernant la chromatine est présentée dans un premier chapitre. En particulier, nous introduisons l'influence d'une histone, appelée histone de liaison. Cette protéine permet à la fibre d'accéder à un niveau de compaction supérieur. Ensuite nous donnons les outils théoriques et expérimentaux d'étude du substrat chromatinien. Nous détaillons les propriétés topologiques de la chromatine. Le dispositif d'étude que nous avons utilisé, les pinces magnétiques, est décrit. Il permet d'exercer sur une fibre unique des contraintes mécaniques de tension et de torsion controlées. Enfin nous présentons les résultats obtenus sur des fibres de chromatine reconstituées en présence ou non de l'histone de liaison. À l'aide des pinces magnétiques, nous avons pu mettre en évidence le fait que l'histone de liaison ne modifie pas l'élasticité torsionnelle remarquable de la chromatine, même si la fibre est dans un état plus condensé. Sous forte déformation torsionnelle positive, le nucléosome subit une transition chirale qui permet de relâcher la contrainte topologique appliquée à la fibre. Nous avons pu montrer que ce changement conformationnel peut tout à fait se dérouler au sein des fibres contenant l'histone de liaison. Les implications biologiques de ces phénomènes sont examinées. La capacité propre à la chromatine à supporter la contrainte de torsion pourrait avoir un rôle dans le maintien de l'organisation chromatinienne lors du cycle cellulaire.

La première partie de ma thèse porte sur la modélisation de la dénaturation de l'ADN. J'ai tout d'abord utilisé le modèle statistique de Poland-Scheraga pour montrer que, lors de l'électrophorèse 2D, on peut prédire les positions finales des fragments avec une précision meilleure que l'incertitude expérimentale. J'ai ensuite amélioré un modèle dynamique développé dans l'équipe en variant ses paramètres pour obtenir un meilleur accord avec des résultats expérimentaux nouveaux, tels la dénaturation mécanique, l'évolution de la température critique avec la longueur de la séquence, et la résolution en température. Dans la seconde partie de ce travail, je propose un modèle qui décrit les interactions non-spécifiques entre l'ADN et les protéines. Ce modèle est basé sur une description "billes et ressorts" déjà existante de l'ADN, qui inclut des interactions d'élongation, de pliage et électrostatiques, alors que je décris les interactions entre l'ADN et la protéine par des énergies électrostatiques et de volume exclu. Pour la protéine, j'ai tout d'abord considéré une simple bille, puis un réseau de treize billes interconnectées. J'ai étudié la dynamique de ce modèle en utilisant un algorithme de dynamique brownienne qui tient compte des interactions hydrodynamiques et montré qu'il donne des résultats en bon accord avec les expériences. J'ai par exemple observé que la protéine visite bien les différents sites de l'ADN par une succession de diffusion 3D et de glissement 1D le long de l'ADN. J'ai également montré que ce processus, appelé facilitated diffusion, ne peut pas accélérer beaucoup la vitesse de recherche de la protéine, contrairement à ce qui est parfois soutenu.

La cellule remodèle sa membrane en permanence, ce qui entraîne la formation de tubes de membrane façonnés par des protéines. Nous étudions trois cas impliquant de tels tubes. Le premier est le polymère hélicoïdal de dynamine, qui enveloppe les tubes de membrane puis les coupe en hydrolysant le GTP. Nous montrons que le recrutement de la dynamine dépend de la courbure de la membrane. Nous formulons des hypothèses et proposons des expériences pour comprendre la nucléation du polymère de dynamine et ses interactions avec la membrane. Nous donnons une description hydrodynamique généralisée du changement de conformation coopératif de la dynamine induit par le GTP et réconcilions des résultats expérimentaux apparemment contradictoires par des arguments mécaniques. La dynamique aux temps longs de l'assemblage dynamine-membrane est diffusive et dominée par une friction effective entre dynamine et membrane, ce qui est confirmé expérimentalement. Notre second sujet est le complexe ESCRT-III, qui tubule les membranes planes de l'intérieur. Nous expliquons cette déformation par une instabilité de flambage inédite se produisant lorsque des filaments courbés qui s'attirent se lient à la membrane. Cette hypothèse peut être vérifiée expérimentalement. Un régime métastable pour la membrane plane est mis en évidence, et pourrait être utilisé par la cellule pour former des tubes rapidement. Troisièment, nous nous tournons vers les stéréocils, des protrusions cellulaires à base d'actine essentielles pour l'audition. Nous expliquons leur forme par la dynamique de détachement de protéines liant l'actine, et rendons compte de résultats expérimentaux. Si ces protéines sont autorisées à se réattacher, notre modèle prévoit une transition de phase dynamique vers un état de croissance non-bornée, et des simulations numériques suggèrent que la longueur des protrusions diverge en loi de puissance avec un exposant anormal.

La polymérisation d'actine fournit la force qui produit directement la motilité dans un grand nombre de cas, mais certaines observations suggèrent que la motilité amiboïde fasse appel à d'autres mécanismes. En utilisant le modèle d'Entamoeba histolytica, il avait été précédemment observé que ces cellules produisent des protrusions transitoires, nécessaires au mouvement. Des mutations affectant l'activité de la myosine et des molécules d'adhésion inhibent l'activité protrusive et la motilité [Coudrier et al., 2005]. En nous appuyant sur ces observations, nous avons fait l'hypothèse que les mouvements amiboïdes d'Entamoeba histolytica sont contrôlés par une instabilité dynamique cyclique du cortex cellulaire : la membrane plasmique produit un bleb par détachement du cytosquelette cortical, sous l'action d'une pression interne due à la contraction acto-myosine, puis le cortex se reforme sous la surface du bleb. L'expansion initiale rapide (plus rapide que les vitesses maximales de polymérisation d'actine) et l'analogie avec des blebs apoptotiques produits par rupture protéolytique des liens cytosquelette-membrane, étaient des indications fortes que Entamoeba histolytica se déplace en émettant des blebs initialement dépourvus de cortex, ce que nous avons pu confirmer par microscopie de fluorescence sur des amibes dont l'actine-F était marquée. Expérimentalement, la formation des protrusions a été analysée en détails par vidéo-microscopie. Les protrusions se développent tout d'abord durant quelques centaines de millisecondes à de très hautes vitesses (jusqu'à quelques dizaines de μm/sec). Ensuite, leur expansion se poursuit avec une membrane ayant une forme localement sphérique et en l'absence d'organites intracellulaires dans la protrusion. A un stade ultérieur, le cortex d'actine basal disparaît et l'expansion qui s'ensuit s'ac- compagne d'un large flot d'organites intracellulaires. Les protrusions peuvent soit être rétractées, soit stabilisées. Le cycle de blebbing / stabilisation conduit à des mou- vements cellulaires sans direction persistante, qui se poursuivent des heures durant. Nous présentons ici un modèle physique décrivant les paramètres de contrôle de cette instabilité dynamique. En utilisant la pression d'aspiration d'une micropipette, nous pouvons produire des protrusions, et la géométrie contrôlée de l'expérience donne lieu à des événements protrusifs reproductibles, qui peuvent être décrits en détail par une modélisation quantitative appropriée. De telles instabilités corticales pourraient donc représenter une façon distincte de générer de la motilité cellulaire, pertinente entre autres dans un contexte d'invasion pathogène ou dans le cadre des mouvements de cellules immunitaires.