Ce travail de thèse porte sur l’analyse conformationelle de biomolécules en phase gazeuse. L’étude d’objets complexes en phase gazeuse permet de connaître les facteurs intrinsèques stabilisant leur structure. La première étape de mes travaux a été le couplage entre un appareil de mobilité ionique (IMS) et un appareil de spectrométrie de masse (MS). Nous avons simulé (SimIon) et développé différentes optiques ioniques fonctionnant à haute pression (entonnoirs à ions, piège ionique). Ces modifications expérimentales nous ont permis de commencer des études conformationnelles de biomolécules en phase gazeuse.Les premières expériences avaient pour objectif d’observer les facteurs stabilisants une structure secondaire sur des séries de peptides analogues. La première étude a été réalisée sur des séries de polyalalanines et de polyglycines de formules Arg(Ala)4XxxAla4Lys et Arg(Gly)4Xxx(Gly)4Lys, où Xxx est l’un des 20 acides aminés naturels. Nous nous sommes intéressés à l’influence de l’acide aminé central sur la conformation globale. Puis nous avons observés la stabilité de l’hélice de la partie transmembranaire de la protéine M2 du virus de la grippe A et de différents mutants. Ces études ont permit de montrer l’importance de la solvatation des charges en phase gazeuse.Enfin nous avons initié une étude sur le repliement des protéines en utilisant une protéine modèle, le lysozyme. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux mécanismes de repliements en fonction du degré d’oxydation de cette dernière / This work deals with the conformational studies of biomolecules in gas phase. The gas phase allows observing the intrinsic factors that stabilize the structure.The first step of this work consisted in coupling an ion mobility tube and a mass spectrometer (IM-MS). Especially, ion optics working at high pressure had to be developed (ion funnels, cylindrical ion trap). These experimental modifications allowed us to realising conformational studies in vacuo.This work is build around two major axes. The first one deals with the understanding of the factors that stabilize the secondary structure in gas phase. We have studied series of peptides with similar sequences. We studied a series of polyalanines and polyglycines who have the following formula Arg(Ala)4XxxAla4Lys et Arg(Gly)4Xxx(Gly)4Lys, where Xxx is one of the 20 natural amino acids. We are looking the influence of central amino acid on the global structure of peptides. After that we have observed the stability of the helix of the transmembran domain of the M2 protein of virus Influenza A and some mutants. These studies allow showing the importance of the charge solvatation in the gas phase.Finally, we are initiated a study on the refolding of proteins and more particularly on a model protein: the Lysozyme. We are studied the refolding in function of oxide degrees

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Ce travail de thèse parti de l'observation que la maintenance des fonctions cellulaires est basée sur l'orchestration précise d'interactions fonctionnelles entre biomolécules telles que l'ADN, l'ARN et les protéines. Bien que ces processus basiques ne montrent pas généralement une organisation spatiale stricte, ils semblent néanmoins contraints par des schémas dynamiques ou spatiaux précis. Cela pose ainsi la question des forces pouvant, dans un microenvironnement cellulaire, diriger les différents acteurs de processus biochimiques complexes au bon endroit, au bon moment et dans le bon ordre afin d'assurer les fonctions cellulaires essentielles. L'existence de forces sélectives à longue portée de nature électromagnétique, pouvant être responsables de l'extraordinaire efficacité des machineries biomoléculaires, est prédite par la mécanique quantique et l'électrodynamique; par longue portée, nous entendons entre 0.1 à 1 micron, ce qui est bien au delà de celle des forces traditionnelles reconnues comme les forces électrostatiques, de van der Waals-London ou les liaisons hydrogènes. Aucune procédure expérimentale ne fut proposée à ce jour pour confirmer ou infirmer cette hypothèse d'une utilisation efficace de telles forces électromagnétiques dans la matière vivante. Si ces forces sélectives de recrutement à longue portée sont effectivement actives au niveau biomoléculaire, cela constituerait un pas important vers une compréhension des processus et mécanismes cellulaires fondamentaux (expression génique, division cellulaire, signalisation, etc.). / The main subject of the present thesis work stems from the observation that the maintenance of cell functions is based on a precise orchestration of functional interactions between biomolecules such as DNA, RNA and proteins. Although these basic processes generally do not exhibit strict spatial organization, they seem constrained into a very accurate temporal - or dynamic - pattern. This raises the question of what types of physical forces can, in the cellular microenvironments, bring the various actors of complex biochemical processes both in the right place, at the right time and in the right order so as to ensure the essential cellular functions. The existence of selective, long-range forces of electromagnetic nature that may be responsible for the extraordinary efficiency of the biomolecular machineries is predicted by quantum mechanics and electrodynamics ; long-range meaning here of the order of 0.1-1 micron, well beyond the traditionally recognized forces, electrostatic ones, hydrogen bonds, van der Waals-London, etc.). Yet, to date, no experimental test has been proposed to disprove or confirm the hypothesis of an effective exploitation of such electromagnetic forces in living matter. If these selective, long-range recruitment forces were found to be active at the biomolecular level, this would represent an important step forward to the understanding of fundamental cellular processes and mechanisms (gene expression, cell division, signalling, etc.).

Durant ces 6 dernières années, ma thématique principale de recherche s'est d'abord focalisée sur l'étude de la stabilité et des processus de fragmentation de fullerènes et des agrégats de fullerènes, puis dans celle de la stabilité et de la réactivité de molécules ou de systèmes d'intérêt biologique.<br />Un des principaux résultats de ces études concerne les agrégats moléculaires de fullerènes, qui sont en principe des agrégats de type van der Waals, donc faiblement liés et surtout électriquement isolants. Nous avons montré que les espèces stables multiplement chargées, formées suite à des collisions avec des ions lents multichargés, qui ne subissent par ailleurs aucune modification structurelle profonde suite à leur chargement par impact d'ions, deviennent contre toutes attentes de bons conducteurs électriques ! <br />Les autres observations majeures obtenues dans ces recherches sont reliées la compréhension des mécanismes responsables à l'échelle moléculaire, en phase gazeuse, de l'endommagement de systèmes moléculaires d'intérêt biologique, suite à une irradiation avec des ions. Ces études ont notamment montré : d'une part, que certains mécanismes de reconnaissance moléculaire persistent en phase gazeuse, et d'autre part, que même la présence d'un environnement biochimique simplifié modifie fortement la dynamique de l'instabilité de la charge de ces molécules d'intérêt biologique.

Cette thèse est une étude de la fragmentation en phase gazeuse de molécules d'intérêt biologique soumises à des collisions avec des ions multichargés de basse énergie (énergie cinétique de quelques keV) et des atomes alcalins ou de gaz rare. L'objectif est d'étudier les processus physique qui conduisent à la dissociation de ces systèmes soumis à une excitation électronique intense. Afin de mettre en évidence lespropriétés intrinsèques de certaines biomolécules (porphyrines et acides aminés), des expériences sur des systèmes isolés ont été effectuées. Les résultats obtenus rendent compte de la grande stabilité des porphyrines lors de l'arrachement ou de l'attachement d'électrons. La dépendance des voies de fragmentation induite par les ions multichargés en fonction de l'isomérie de l'alanine a été démontrée. Dans un second temps, la prise en compte d'un environnement modèle autour des biomolécules à mis en évidence l'apparition ou la modification des voies de dissociation provoquée par la présence d'autres molécules biologiques (agrégats de bases nucléiques) ou de molécules de solvant (eau, méthanol, acétonitrile) autour de la biomolécule étudiée. Enfin dans le but de poursuivre ces études avec des systèmes de plus grande taille, un nouveau dispositif expérimental, développé durant la thèse et basé sur une source electrospray et un quadripôle de sélection en masse, est présenté. Les tests réalisés avec ce dispositif et les améliorations proposées permettent d'envisager, à l'avenir, des études sur la dynamique de fragmentation de grands systèmes biomoléculaires chargés et hydratés provoquée par des ions multichargés de basse énergie.

Ce travail de thèse a démontré la possibilité de mesurer la relaxation d'un complexe biomoléculaire ainsi que son hétérogénéité structurale, en associant la microfluidique et la fluorescence résolue en temps (FRT). Je présente de quelle façon la FRT permet d'obtenir une information sur la structure d'une molécule et comment on la mesure, notamment grâce à une caméra à balayage de fente. J'introduis ensuite la microfluidique de gouttes, permettant de mélanger deux réactifs en quelques millisecondes et de suivre la relaxation du complexe au cours de la propagation des micro-réacteurs. Puis, la mesure d'une cinétique avec un couple de molécules modèle démontre la preuve de principe, faisant l'objet d'un article soumis. Enfin la mesure de FRT par comptage de photons uniques dans des gouttes uniques est décrite. Elle ouvre une perspective d'application pour le criblage à haut débit : un brevet a été déposé.

La voie pulmonaire suscite un intérêt grandissant pour l'administration systémique des peptides et protéines thérapeutiques, aujourd'hui encore administrés essentiellement par voie parentérale. Un microsystème a été conçu pour permettre de faciliter et accélérer les études in vitro de criblage de différentes biomolécules actives et de sélectionner les formulations les plus adaptées à leur pénétration à travers l'épithélium pulmonaire, en vue de sélectionner les meilleurs candidats à une administration par voie pulmonaire. Organisé en deux configurations distinctes, ce microsystème permet dans un premier temps d'obtenir des barrières épithéliales pulmonaires polarisées et jointives (cellules Calu-3) en seulement 7 jours dans des micropuits de 1mm², sans avoir à renouveler le milieu nutritif ni avoir recours à un appareillage externe associé au microsystème. Grâce à la mise au point d'une technique simple de fabrication, des plateformes de culture contenant jusqu'à 12 micropuits en parallèle sont aujourd'hui fabriquées de manière standardisée. L'évaluation du passage de molécules est ensuite réalisée sous une deuxième configuration dédiée à la mesure de la perméabilité des barrières épithéliales cultivées en micropuits. La capacité de différents candidats (nanoparticules et biomolécules) à traverser l'épithélium pulmonaire a été étudiée. Le passage de nanoparticules de PLGA revêtues de chitosane ainsi que le passage de l'insuline ont été démontrés avec succès. Enfin, l'électrophorèse capillaire couplée à une détection par fluorescence induite par laser (EC-LIF), compatible avec les faibles volumes manipulés dans ce microsystème, a été exploitée pour la détection et la quantification de l'insuline après passage des barrières pulmonaires miniaturisées. A cette fin, l'insuline a soit été marquée par le FITC, soit complexée à un anticorps ou a un aptamère fluorescents. A l'heure actuelle, seule la méthode développée pour le marquage de l'insuline par le FITC est utilisable à des fins de quantification, mais le recours à un aptamère a montré des premiers résultats encourageants.

La diffusion de neutrons à petits angles (SANS) est une méthode utilisée pour l'étude d'une large variété de particules en solution. Combinée à un marquage isotopique et à la variation de contraste, elle permet d'obtenir des informations structurales uniques sur des complexes biologiques impliquant plusieurs partenaires, la rendant particulièrement intéressante pour l'étude des mécanismes de translocation. Dans les trois grands domaines de la vie, jusqu'à 30% des protéines doivent être sécrétées hors de la cellule ou intégrées dans sa membrane. Ces mécanismes complexes impliquent deux grands chemins de translocation qui dépendent de multiples protéines cytoplasmiques et membranaires.L'Holotranslocon est un large complexe protéique membranaire composé de sept sous-unités : le translocon triméric SecYEG et les sous-unités accessoires SecD-SecF-YidC-YajC. Cet assemblage peut sécréter des protéines vers l'extérieur de la cellule et en intégrer dans la bicouche lipidique. Nous avons utilisé une sélection de méthodes biophysiques pour analyser différentes stratégies de préparation et la diffusion de neutrons pour analyser les caractéristiques structurales de ce complexe. Nous avons étudié l'efficacité des protocoles actuels pour la production d'un échantillon suffisamment concentré et homogène mais aussi la possibilité d'utiliser des Amphipols comme substitut aux détergents classiquement utilisés pour la purification de ce complexe. Nous avons également tenter de deutérer HTL pour étendre les possibilités offertes par le SANS dans ce contexte. Alors que les caractérisations biophysiques utilisées n'ont pas permis d'améliorer les méthodes de préparation actuelles, la diffusion de neutron nous a permis de confirmer la présence de lipides au centre de la structure. Nous avons assuré la fiabilité de cette stratégie pour étudier des complexes bien définis, formés par plusieurs composants. Nous proposons des méthodes alternatives, basées sur la fluorescence ou la génération de lipodisques, pour l'étude de ce système complexe.Nous avons également étudié la protéine tétramérique SecB, une chaperonne moléculaire qui est impliquée dans l'adressage des substrats de translocation aux translocons membranaires. Puisque SecB interagit avec des partenaires cytosoliques et ses propres substrats, nous avons utilisé la diffusion de neutrons ainsi que le marquage au deutérium pour analyser des complexes pertinents dans le processus de translocation et impliquant jusqu'à trois partenaires : SecB, un substrat déplié et l'ATPase SecA. Nous avons utilisé les valeurs de "contrast match point" mesurées pour obtenir des informations sur la stœchiométrie et l'affinité des différents assemblages. L'analyse des rayons de girations a permis de localiser les différents composants au sein de ces complexes. De plus, nous avons montré que SecB s'étend lorsqu'elle reconnait son substrat et nous proposons un modèle fonctionnel, basé sur nos données, pour l'adressage des protéines textit{via} le chemin post-traductionnel.Dans l'optique de diversifier les applications du SANS pour les systèmes biologiques, nous avons étendus les protocoles utilisés pour la production de protéines partiellement deutérées textit{in vivo} aux lipides et acides nucléiques bactériens. Les niveaux de deutération ont été analysés grâce à la diffusion de neutrons, spectrométrie de masse ou résonance magnétique nucléaire. Sur la base de ces données, nous avons extrapolé les niveaux de deutération et "contrast match point" pour chaque type de biomolécule afin de pouvoir prédire les conditions de cultures optimales requises pour atteindre un marquage spécifique. Nous avons, de plus, développé une nouvelle stratégie permettant de marquer sélectivement les protéines tout en conservant un marquage minimal des autres types de molécules. / Small Angle Neutron Scattering (SANS) is a method that is used for the study of a wide range of particles in solution. Combined with isotope labelling and contrast variation approaches, it allows the extraction of unique structural information on biological complexes involving multiple partner molecules, making it a method of interest for the study of protein translocation mechanisms. In all three kingdoms of life, up to 30% of all proteins need to be secreted out of the cell or integrated into its membrane. These complex mechanisms involve two pathways of translocation that rely on multiple cytoplasmic and membrane proteins.The Holotranslocon (HTL) is a large membrane protein complex composed of seven subunits: the core trimeric translocon SecYEG and the accessory subunits SecD-SecF-YidC-YajC. This assembly can secrete proteins out of the cell or integrate them into the lipid bilayer. In this project, a range of biophysical methods and sample preparation strategies have been used to analyse the structural features of this complex by SANS. The efficiency of the current protocols to produce a concentrated and homogeneous sample have been investigated, as well as the use of an amhpipol molecules as a substitute to classical detergents for the purification of this complex. The deuteration of HTL was attempted to expand the capabilities of SANS in this context. While the biophysical characterization methods we used did not allow us to further improve the current preparation protocols, a key result was the fact that SANS confirmed the presence of lipids at the centre of the structure and the reliability of this analysis method for the study well-defined multi-component complexes was tested. Alternative methods for the analyses of this complicated system are proposed, including fluorescence-based assays or lipodisc formation.The tetrameric protein SecB was also studied; SecB is a molecular chaperone that is involved in the delivery of translocation substrates to the translocon. Since SecB interacts with cytosolic partners and its own substrate, SANS and deuterium labelling was used to analyse translocation-relevant complexes involving up to three partners: SecB, an unfolded substrate and the SecA ATPase. The measured contrast match point was used to obtain information on the stoichiometry and affinity of the various assemblies, and the radii of gyration was used to localize the different components within the complexes. It has also been shown that SecB expands upon substrate binding; a new working model for the post-translational targeting pathway has been proposed, based on these data.As a corollary to the work described above, protocols for textit{in vivo} protein deuterium labelling to the deuteration of textit{E. coli} lipids and nucleic acids have been developed and it is hoped that these may be of general value in widening the scope of SANS applications for the study of biological systems. the These approaches were characterized and evaluated by SANS, nuclear magnetic resonance and mass spectrometry. Based on these data, the relevant deuteration levels and contrast match points were extracted for each class of biomolecule so that the optimal culture conditions can be used to achieve a specific level of deuteration. In addition, a new strategy has been developed that allows the selective labeling of proteins while keeping the labelling of other classes of molecules to a minimum within a single culture.

Ce travail de thèse a démontré la possibilité de mesurer la relaxation d’un complexe biomoléculaire ainsi que son hétérogénéité structurale, en associant la microfluidique et la fluorescence résolue en temps (FRT). Je présente de quelle façon la FRT permet d’obtenir une information sur la structure d’une molécule et comment on la mesure, notamment grâce à une caméra à balayage de fente. J’introduis ensuite la microfluidique de gouttes, permettant de mélanger deux réactifs en quelques millisecondes et de suivre la relaxation du complexe au cours de la propagation des micro-réacteurs. Puis, la mesure d’une cinétique avec un couple de molécules modèle démontre la preuve de principe, faisant l’objet d’un article soumis. Enfin la mesure de FRT par comptage de photons uniques dans des gouttes uniques est décrite. Elle ouvre une perspective d’application pour le criblage à haut débit : un brevet a été déposé. / This thesis has proven the feasibility of measuring the relaxation of a biomolecular complex as well as its structural heterogeneity, by associating microfluidics and time resolved fluorescence (TRF). I present in which way TRF allows for probing the structure of a molecule and how it is measured, in particular by using a streak camera. I then introduce droplet microfluidics, which enables to mix two reagents in a few milliseconds and to follow the relaxation of the complex, along propagation of the micro-reactors. Next, the measurement of a kinetics with test molecules validates the proof of concept, reported in a submitted article. Finally, the measurement of TRF by single photon counting in single droplets is described. It opens a perspective for an application in high-throughput screening: a patent has been registered.

Les assemblages supramoléculaires font parties des réactions biochimiques de base dans les fonctions cellulaires (ex: réplication de l'ADN ou réponse immunitaire). Les calix[n]arènes ont été décrit pour interagir avec une large gamme de biomolécules. En conséquence, ils peuvent être trouvés dans de nombreuses applications biologiques tel qu'en diagnostic ou en traitement thérapeutique. Leurs fonctionnalisations sur des nanoparticules d'argent ont produit de nouveaux nano-composés hybrides ayant des propriétés optique, électrique et biologique uniques. Cette thèse a été dédiée à l'étude de ces nano systèmes pour la bio-détection et leurs potentielles applications biomédicales. Le développement de capteur analytique à bas coût, portable et ultra-sensible représente une des attentes majeures dans les applications des calix[n]arènes sur nanoparticules d'argent. Dans cette thèse, ces nano-composés ont été étudiés selon leurs capacités à suivre la micellisation de surfactant mixtes, et pour discriminer un type moléculaire tel qu'une famille d'acide nucléique ou une espèce d'albumine sérique. Dans une deuxième partie, ces nanoparticules hybrides ont été évaluées pour une série d'activités biologiques. Ils ont montré des facultés antibiotiques et anti-oxydantes, de transporter des Ingrédients Pharmaceutiques Actifs, et d'atteindre des cibles antivirales et anticancéreuses / Supramolecular assemblies are among the basic biochemical reactions in the cellular functions (e.g. DNA replication, immune response). Calix[n]arenes are macrocyclic molecules that have been reported for interacting with a wide range of biomolecules. As a consequence, they can be found in many biological applications from diagnosis to therapeutic treatment. Their functionalization on silver nanoparticles have produced new nano hybrid compounds with unique optical, electrical and biochemical properties. This thesis has been dedicated to the study of these nano-systems for bio-sensing and for their potent biomedical applications. Cost effective, portable and ultra-sensitive analytical tools are one of the major expectations of the applications of silver nanoparticles capped with calix[n]arenes. Calix[n]arenes nanoparticles have been reported here for following the micellisation process of mixed surfactants or for discriminating a type of molecule such nucleic acid or a serum albumin specie. In a second part, these hybrid nanoparticles have been evaluated for series of biological activities. They’ve been shown to possess anti-oxidant and antibacterial activities, to transport Active Pharmaceutical Ingredient and to reach antiviral and anti-cancer targets