Les brins d'ADN riches en guanine, comme ceux présents à l'extrémité des chromosomes humains, sont capables de s'associer entre eux pour former des structures G-quadruplexes, résultant de l'association de quatre guanines (G-tétrade). Ces structures sont actuellement l'objet d'un intérêt particulier pour le développement de nouvelles thérapies anti-cancéreuses et des applications potentielles pour l'électronique moléculaire. Il n'existe cependant que très peu d'études des propriétés photophysiques des G-quadruplexes. L'objectif de ce travail de thèse est d'étudier l'influence de la structrure des G-quadruplexes sur leurs propriétés photophysiques au moyen de la spectroscopie de fluorescence résolue en temps sur une gamme temporelle allant de la centaine de femtosecondes à la centaine de nanosecondes. Nous avons examiné l'effet de la taille de structures G-quadruplexes tétramoléculaires sur leurs propriétés photophysiques. Nous avons pu montrer que le caractère collectif des états ππ* des guanines est renforcé lorsque le nombre de tétrades augmente et qu'un transfert d'énergie ultra-rapide, en moins de 100 fs a lieu entre ces états. Nous avons ensuite mis en évidence le rôle des cations métalliques situés dans la cavité centrale des quadruplexes dans le processus de désactivation des états excités. En présence de K+, l'émission provient principalement des états délocalisée ππ* des guanines, alors qu'en présence de Na+, l'émission dominée par la contribution d'états excités à caractère de transfert de charge. Enfin, nous avons abordé l'effet de la topologie, en comparant les propriétés photophysiques des G-quadruplexes tétramoléculaires avec celles de structures formées par le repliement d'un simple brin d'ADN. Les différences observées peuvent s'expliquer par la rigidité accrue des structures simple-brins et l'orientation relative différente des tétrades qui détermine la force du couplage électronique entre les bases.

Des molécules ou assemblages moléculaires organiques (dérivés d’hémicyanine ou du BODIPY) ont été étudiés en solution par des méthodes optiques complémentaires : absorption stationnaire et fluorescence, absorption transitoire et fluorescence résolue en temps (échelle femtoseconde et picoseconde). Ces méthodes ont permis de caractériser différents processus tels que le transfert de charge intramoléculaire, le transfert d'énergie et le transfert d'électron photoinduit. Elles ont ainsi permis de démontrer l’intérêt de certains chromophores de type AzaBODIPY émettant dans le proche IR, dans des applications d’imagerie et de thérapie photodynamique. La photostabilité et l’absorption à deux photons ont également été étudiées dans le cas d’autres dérivés du BODIPY pouvant être appliqués à la détection d’espèces ioniques. Dans le cas des hémicyanines, des dérivés amphiphiles dotés d’une couronne reconnaissant spécifiquement certains cations ont également été étudiés sous forme de films de Langmuir-Blodgett et en présence de différents cations, le but étant de former des membranes artificielles iono- et photosensibles. / Ultrafast femtosecond transient absorption measurements (30 fs FWHM pulses) and complementary picosecond spectroscopies (20 ps FWHM pulses, streak camera detection), as well as steady state absorption and fluorescence measurements, were used to study a range of molecules and molecular assemblies. Processes such as intramolecular charge transfer, electronic energy transfer and photoinduced electron transfer were characterized. Amphiphilic azacrown-containing hemicyanine dyes and resulting iono- and photosensitive artificial membranes were studied using Langmuir-Blodgett techniques in the presence of various cations. Among a range of other molecules studied, NIR emitting aza-BODIPY dyes were studied by time-resolved methods in order to investigate their suitability for Photodynamic Therapy applications and imaging. Differently functionalized BODIPY dyes were investigated with respect to photostability, two photon absorption and ion sensing.

Les brins d’ADN riches en guanine, comme ceux présents à l'extrémité des chromosomes humains, sont capables de s’associer entre eux pour former des structures G-quadruplexes, résultant de l’association de quatre guanines (G-tétrade). Ces structures sont actuellement l’objet d’un intérêt particulier pour le développement de nouvelles thérapies anti-cancéreuses et des applications potentielles pour l’électronique moléculaire. Il n’existe cependant que très peu d’études des propriétés photophysiques des G-quadruplexes. L'objectif de ce travail de thèse est d'étudier l’influence de la structrure des G-quadruplexes sur leurs propriétés photophysiques au moyen de la spectroscopie de fluorescence résolue en temps sur une gamme temporelle allant de la centaine de femtosecondes à la centaine de nanosecondes. Nous avons examiné l’effet de la taille de structures G-quadruplexes tétramoléculaires sur leurs propriétés photophysiques. Nous avons pu montrer que le caractère collectif des états ππ* des guanines est renforcé lorsque le nombre de tétrades augmente et qu’un transfert d'énergie ultra-rapide, en moins de 100 fs a lieu entre ces états. Nous avons ensuite mis en évidence le rôle des cations métalliques situés dans la cavité centrale des quadruplexes dans le processus de désactivation des états excités. En présence de K+, l'émission provient principalement des états délocalisée ππ* des guanines, alors qu’en présence de Na+, l’émission dominée par la contribution d’états excités à caractère de transfert de charge. Enfin, nous avons abordé l'effet de la topologie, en comparant les propriétés photophysiques des G-quadruplexes tétramoléculaires avec celles de structures formées par le repliement d’un simple brin d’ADN. Les différences observées peuvent s’expliquer par la rigidité accrue des structures simple-brins et l'orientation relative différente des tétrades qui détermine la force du couplage électronique entre les bases. / Guanine rich DNA strands have the ability to form four-stranded structures (G-quadruplexes). Their repetitive unit is the G-quartet (tetrad) where each base is connected with two others via four hydrogen bonds. These structures have a crucial role in biological aspect, as targets for anti-cancer therapies, and have great potential for applications in nanotechnology. We studied the electronic excited states of G-quadruplexes using two different techniques, fluorescence up-conversion (FU) and time-correlated single photon counting (TCSPC) , which allow probing the emissive states over six decades of time (from hundred femtoseconds to hundreds of nanoseconds). At first, we examined the effect of the size of tetramolecular G-quadruplexes on their photophysical properties. We have found that the collective behavior of Franck-Condon excited states is enhanced when the number of tetrads increases. For all systems studied, the anisotropy of the G-quadruplex, on the time scale of hundreds of femtoseconds, is lower than that of non-interacting mono-nucleotides in solution. This decrease in anisotropy is associated with an ultrafast energy transfer process between the bases. Then we demonstrated that the metal cations located in the central cavity of quadruplexes also affect their photophysical properties. In the presence of K+, emission arises mainly from delocalized ππ* states (excitons), whereas in the presence of Na+, it is dominated by the contribution of charge transfer excited states. Finally, we studied the effect of conformation, comparing the properties of tetramolecular G-quadruplexes with those formed by folding a single strand (intramolecular G-quadruplexes). We have shown that the conformation of the nano-structures influences the properties of the excited Franck-Condon states as emissive states as well. These effects are attributed to different geometric arrangement of G-tetrads in tetramolecular and intramolecular quadruplexes.

La mesure <i>in vitro</i> de la sérotonine (5-HT) est effectuée par un capteur chimique à fibre optique (FOCS) par fluorescence induite par laser et résolue en temps. Les propriétés photophysiques de la 5-HT sont analysées: un état émissif de la 5-HT non décrit par la littérature a été mis en évidence. L'ordre de grandeur de la limite de détection de 5-HT est de 5 µm, bien loin des concentrations extracellulaires cérébrales <i>in vivo</i>. Les mesures <i>in vivo</i> au niveau du cortex (Cx) et du noyau du raphé dorsalis (nRD) chez le rat non anesthésie et libre de ses mouvements sont réalisées par ce même FOCS. Deux pics de fluorescence sont détermines au niveau du Cx et du nRD : un situé à 390 nm et l'autre centre sur 460 nm. Le premier pic n'a pas l'attribution moléculaire fiable. Les données spectroscopiques et la littérature de l'autofluorescence des tissus cérébraux permettent une attribution moléculaire fiable du pic mesuré à 460 nm: il provient du NADH endogène. Quelques résultats préliminaires ont été obtenus avec le FOCS dans les deux structures cérébrales pendant les divers états de vigilance. Au niveau du nRD dans la partie antérieure et ventrale, une augmentation de la fluorescence (460nm) a été observée lors du sommeil à onde lente (SWS) et du sommeil paradoxal (PS). En outre une augmentation importante et très rapide de la fluorescence (460nm) a été mesurée lors de la mort de l'animal.

Dans ce travail, nous avons étudié le mécanisme d'émission de la partie optiquement active du complexe luciférine-luciférase. Ce système bioluminescent est largement utilisé dans un très grand nombre d'approches bioanalytiques. Ce phénomène naturel résulte en l'émission de lumière visible (vert-jaune-rouge) à partir du photoproduit : l’oxyluciférine. Une des hypothèses couramment admise pour expliquer le mécanisme d’émission de l’oxyluciféreine fait intervenir un équilibre complexe entre six espèces chimiques, mais le détail exact du mécanisme reste à élucider. Les principales conclusions présentées ici repose sur l'identification des six formes chimiques de l’oxyluciférine impliquées dans le mécanisme d'émission de fluorescence et la caractérisation d’un point de vu dynamique du transfert de proton à l’état excité. Ces résultats ont été obtenus par l'étude des propriétés optiques de différents analogues structuraux de l’oxyluciférine dans un tampon aqueux. Différent techniques de spectroscopie (état stable et résolue en temps) et des approches chimiométriques ont été appliquées pour étudier ce mécanisme d'émission. En outre, les propriétés photophysiques de l’oxyluciférine en complexe avec l'enzyme luciférase (Luciola cruciata) ont été étudiées également en milieu aqueux. En parallèle, les dérivés présentant des propriétés d’émission sensibles à l’environnement ont été utilisés pour visualiser l'interaction entre biomolécules. En particulier, nous avons démontré que l’oxyluciférine peut être utilisée pour cartographier le pH intracellulaire à l'aide de la microscopie de fluorescence dans des cellules vivantes. Avec l'aide d'un autre dérivé de l'oxyluciférine nous avons été en mesure de caractériser l'interaction entre une protéine du VIH-1 et des séquences d'oligonucléotide au moyen de mesures ratiométriques. Enfin, nous avons développé une approche basée sur le marquage de résidus cystéine pour suivre, in vitro, l'interaction protéine-protéine. / In this work, we investigated the emission mechanism of the optically active part of the firefly luciferin-luciferase complex. This bioluminescent system is widely used in bioanalytical assay. This amazing natural phenomenon results in the emission of visible light (yellow-green-red) from the photoproduct Oxyluciferin. This color tuning mechanism involves six chemical species, but their active involvement in the excited state proton transfer (ESPT) mechanism was poorly understood so far. One of the main finding presented here relies on the identification of six chemical forms of Oxyluciferin involved in the color tuning fluorescence emission mechanism. This result was obtained by studying the optical properties of different structural analogues of firefly Oxyluciferin in aqueous buffer. Different spectroscopic (steady state and time-resolved) and chemometric approaches have been applied to reveal the emission mechanism. In addition, the photophysical properties of Oxyluciferin in complex with the Luciferase enzyme Luciola cruciata have been studied in aqueous buffer as well. In parallel, derivatives displaying environment sensitive emission were used to monitor biomolecular interactions. In particular, we demonstrated that Oxyluciferin can be employed to map intracellular pH by using fluorescence microscopy within living cells. With the help of another Oxyluciferin derivative we were able to monitor the interaction between a HIV-1 protein and different oligonucleotide sequences by means of ratiometric measurements. Finally we develop an approach based on cysteine labeling to monitor in vitro protein-protein interaction.

Ce travail de thèse a démontré la possibilité de mesurer la relaxation d'un complexe biomoléculaire ainsi que son hétérogénéité structurale, en associant la microfluidique et la fluorescence résolue en temps (FRT). Je présente de quelle façon la FRT permet d'obtenir une information sur la structure d'une molécule et comment on la mesure, notamment grâce à une caméra à balayage de fente. J'introduis ensuite la microfluidique de gouttes, permettant de mélanger deux réactifs en quelques millisecondes et de suivre la relaxation du complexe au cours de la propagation des micro-réacteurs. Puis, la mesure d'une cinétique avec un couple de molécules modèle démontre la preuve de principe, faisant l'objet d'un article soumis. Enfin la mesure de FRT par comptage de photons uniques dans des gouttes uniques est décrite. Elle ouvre une perspective d'application pour le criblage à haut débit : un brevet a été déposé.

La Tomographie Optique Diffuse Résolue en Temps (TOD-RT) est une technique d'imagerie clinique et préclinique en pleine croissance. Elle fournit les cartes d'absorption et de diffusion optique des organes explorés, et les paramètres physiologiques associés. La Tomographie Optique Diffuse de Fluorescence Résolue en Temps (TODF-RT) est basée sur la détection de photons de fluorescence. Elle permet de déterminer les cartes de la concentration et du temps de vie de sondes fluorescentes et d'accéder à une imagerie métabolique et moléculaire très importante pour le diagnostic et le suivi thérapeutique, en particulier en cancérologie. L'objectif de cette thèse était de réaliser des images 3D de TOD/TODF-RT sur des rongeurs en utilisant une technologie optique résolue en temps, les acquisitions étant réalisées à l'aide de fibres optiques disposées autour de l'animal et sans contact avec sa surface. Le travail a été mené en quatre étapes : 1- mise en place d'un dispositif d'imagerie de la surface de l'animal et reconstruction de son contour 3D, 2- modélisation de l'approche sans contact pour la résolution du problème direct, 3- traitement des mesures prenant en compte la réponse impulsionnelle de l'appareil, 4- établissement d'une méthode de reconstruction des images basée sur une sélection de points judicieusement choisis sur les profils temporels. Ces travaux ont permis d'obtenir des images optiques 3D de bonne qualité en réduisant la diaphonie entre l'absorption et la diffusion. Ces améliorations ont été obtenues tout en diminuant le temps de calcul, par comparaison avec les méthodes utilisant la totalité des profils temporels.

Ce travail de thèse a démontré la possibilité de mesurer la relaxation d’un complexe biomoléculaire ainsi que son hétérogénéité structurale, en associant la microfluidique et la fluorescence résolue en temps (FRT). Je présente de quelle façon la FRT permet d’obtenir une information sur la structure d’une molécule et comment on la mesure, notamment grâce à une caméra à balayage de fente. J’introduis ensuite la microfluidique de gouttes, permettant de mélanger deux réactifs en quelques millisecondes et de suivre la relaxation du complexe au cours de la propagation des micro-réacteurs. Puis, la mesure d’une cinétique avec un couple de molécules modèle démontre la preuve de principe, faisant l’objet d’un article soumis. Enfin la mesure de FRT par comptage de photons uniques dans des gouttes uniques est décrite. Elle ouvre une perspective d’application pour le criblage à haut débit : un brevet a été déposé. / This thesis has proven the feasibility of measuring the relaxation of a biomolecular complex as well as its structural heterogeneity, by associating microfluidics and time resolved fluorescence (TRF). I present in which way TRF allows for probing the structure of a molecule and how it is measured, in particular by using a streak camera. I then introduce droplet microfluidics, which enables to mix two reagents in a few milliseconds and to follow the relaxation of the complex, along propagation of the micro-reactors. Next, the measurement of a kinetics with test molecules validates the proof of concept, reported in a submitted article. Finally, the measurement of TRF by single photon counting in single droplets is described. It opens a perspective for an application in high-throughput screening: a patent has been registered.

L’application de la photoluminescence suscite un intérêt croissant de la part des chercheurs et ceci dans de nombreux domaines. Dans notre cas, différents complexes à base de lanthanide seront détectés par une méthode spectrophotométrique avancée, la fluorescence résolue en temps. Ces derniers peuvent être ainsi détectés même à l’état de traces au sein des milieux complexes tel que ceux rencontrés dans l’industrie pétrolière (saumures, traces de pétrole, éléments solides en suspension, etc.). L'utilisation de la détection de fluorescence résolue en temps combinée à des complexes de lanthanides a été démontrée comme une stratégie simple et efficace pour éliminer la fluorescence de fond des matrices présentes dans le milieu étudié et fournir un rapport signal sur bruit élevé. Le sujet de cette thèse consiste à répondre avec les outils précédents à différentes problématique existants au sein de l’industrie pétrolière, de l’extraction du pétrole au processus de marquage de différents produits raffinés à des fins commerciales. Dans la première partie du manuscrit décrira différents protocoles capables d’extraire de l’information de différents additifs chimiques employés sur les champs pétrolifères lors de l’extraction de pétrole et de gaz. Les additifs en questions peuvent être des inhibiteurs de dépôts minéraux, des inhibiteurs de corrosion, des polymères viscoélastiques, dans différentes eaux de synthèse et de production issues de différentes plateformes. Les impacts de certains facteurs ont été analysés afin d’améliorer la sensibilité et les performances. Nous démontrerons la possibilité de quantifier avec succès la teneur résiduelle de différents types d'additifs chimiques. L'effet de matrice de l’échantillon a été limité par le développement de deux stratégies d'addition standard. Nous montrerons par ailleurs qu’il est possible de quantifier la présence non seulement d’un additif mais encore, dans certaines situations optimisées, de deux additifs en mélange. Outre la détermination de la concentration en additifs chimiques, nous présenterons également une méthode permettant de déterminer l’anionicité d’un polymère en milieu complexe. Dans la deuxième partie du document, nous détaillerons le développement de complexes de lanthanides utilisés en tant que marqueurs ainsi que la méthode de détection par fluorescence résolue en temps visant à la lutte contre la contrefaçon de différents pétroles bruts et de carburants raffinés. La synthèse et le processus d’incorporation de trois types de marqueurs de photoluminescence et leur stabilité dans différents carburants seront ensuite discutés. Les résultats obtenus démontrent qu’il est possible, à l’aide de cette technologie de marquage, de détecter efficacement les fraudes à la taxe dans les carburants, même à haute dilution. Ces travaux présente potentiellement un fort impact dans les domaines académiques comme industriels. Toutes les études se concentrent sur la mise au point d’une procédure simple, qui fournit une sensibilité élevée permettant de réduire le coût de production et qui repose sur l’emploi du fluorimètre résolu en temps Inibox™ développé pendant ma thèse pour porter sur le terrain les technologies développé au laboratoire / The application of photoluminescence is receiving an increasing interest from researchers coming from many fields. The previous laboratory works introduced a time-resolved fluorescence (TRF) detection method for the quantification of chemicals in complex medium (petroleum, production brine, and synthetic sea water) tagged with lanthanides, the additives form complexes that exhibit specific TRF signal which overcomes autofluorescence of sample and provide a high signal to noise ratio. The subject of this thesis concerns the development of specific methods based on patented technique to answer problematics arising in the oil industry from the extraction of crude product to the distribution of fuels. In the first part of the document, we focus on the monitoring of residual amount of chemical additives such as scale inhibitors, corrosion inhibitors, viscoelastic polymers in different synthetic and production waters. The impacts of some key factors were analyzed in order to improve the sensitivity and performance, also proves that under optimized conditions it is possible to quantify simultaneously two products in the same matrix. We successfully quantified various types of chemical additives with satisfying precision. Furthermore, the matrix effect was controlled by the development of two standard addition strategies. In addition to the determination of the concentration of chemical additives, we will also introduce a method to determine the anionicity of a polymer in difficult conditions. In the second part of the manuscript we follow the development of lanthanide complex markers and their detection for anti-counterfeiting on different crude oils and refined fuels. The synthesis, incorporation process and stability of three types of photoluminescence markers in different fuels have been discussed. The obtained results will prove that the technology can be used to detect fraud on fuels. This work has a potential great impact for both the academic and industrial domains. All studies focus on the creation of a simple procedure, with high sensitivity and low cost. All method are relying in the end on a specific field apparatus developed during my thesis to support the exportation of the technologies from the laboratory to the industry: The Inibox™

Ce travail de thèse est principalement centré sur l’étude des processus photophysiques fondamentaux de nouveaux composés organiques à transfert de charge dérivés de styrylpyridine, réalisée grâce à des mesures de fluorescence résolue en temps à l’échelle picoseconde et d’absorption transitoire à l’échelle femtoseconde. Nous nous sommes tout d’abord intéressés au comportement des états excités de deux nouvelles hémicyanines. Les molécules de diméthoxystyrylpyridine méthylées ont montré l’établissement d’un équilibre entre les conformations syn et anti différent à l’état excité comparé à l’état fondamental, représenté par un temps de décroissance rapide de fluorescence. La deuxième constante de temps correspond à la dépopulation de l’état excité par les voies non radiatives telles que l’isomérisation et le twist du donneur de charge (effet « loose-bolt »). Concernant le dérivé de styrylpyridinium où le groupement phényl a été remplacé par diméthlaminothiophene, nos études ont prouvé l’implication du mouvement de rotation du groupement méthylpyridinium ainsi que l’intervention du croisement inter-système comme voies de relaxation. Dans un second temps, nous nous sommes penchés sur les propriétés de complexation de la molécule de styrylpyridine sur laquelle a été substitué un éther-couronne. Nos études nous ont permis de mettre en évidence la présence de deux centres de complexation (un au centre de la couronne, l’autre sur l’azote de la pyridine) montrant une sélectivité différente vis-à-vis des cations métalliques. Les stoechiométries ont pu être confirmées par une analyse des temps de réorientation des complexes formés. Après avoir étudié les divers composés constituant des « briques » élémentaires en vue de systèmes supramoléculaires plus élaborés, nous nous sommes intéressés à leurs éventuelles applications avec l’étude de systèmes pour la collecte et le transfert d’énergie. Nous avons tout d’abord démontré l’existence d’un transfert d’énergie ultra-rapide (180 fs à 6 ps) et ultra-efficace (>99.7%) dans des systèmes bichromophoriques contenant deux styrylpyridines avec un éther-couronne et asymétrisés par l’introduction d’un cation Mg2+ dans une seule couronne. Celui-ci se fait de la partie complexée vers la partie non complexée par interaction coulombienne. Une autre application envisagée réside dans la construction de complexes à métaux de transition pour le stockage d’énergie ou le stockage d’information. Nous avons tout d’abord étudié la formation d’un système supramoléculaire basé sur le phénanthroline et contenant quatre éther-couronnes libres. Nous avons mis en évidence l’existence d’un équilibre entre états singulets et triplets excités dans ces composés complexés avec Cuivre(I) ou Argent(I). Dans un second temps, nous avons étudié la formation de complexes liant deux bipyridines substitués contenant un éther-couronne à un ion Fe2+. Un tel complexe présente des propriétés de transition de spin BS?HS. Nos études ont ensuite révélé la formation de complexes à métaux de transition de taille nanométrique lors de l’ajout d’ions Ba2+. / This Ph.D. work mainly deals with the study of fundamental photophysical processes of new styrylpyridine-type organic compounds showing charge transfer, realised using picosecond fluorescence and femtosecond transient absorption. We were interested first in the excited-state behaviour of two new hemicyanines. Methylated dimethoxystyrylpyridines molecules showed the establishment of an equilibrium between syn and anti conformations which is different in the excited state compared to the ground state, represented by a fast relaxation time of fluorescence. The second time constant corresponds to depopulation of the the excited state by non-radiative pathways as isomerization and donor twist (« loose-bolt »). Concerning styrylpyridinium derivative where phenyl group was replaced by dimethylaminothiophene, our studies proved involvment of rotation of methylpyridinium group and intersystem crossing as relaxation pathways. Secondly, we were interested in complexation properties of ether-crown susbstituted styrylpyridine molecule. Our studies showed the presence of two complexation centers (one in the center of the crown, the other one on the nitrogen of pyridine) having a different selectivity for metallic cations. Stoichiometries were confirmed by analysis of the reorientation times of formed complexes. After the study of our different compounds as elementary « building–blocks » for more complex supramolecular systems, we were interested in their potential applications with the study of systems for collection and energy transfer. First, we highlighted the existence of an ultra fast (180 fs to 6 ps) and ultra efficient (>99.7%) intramolecular energy transfer in bichromophoric systems containing two ether-crowned styrylpyridines and dissymetrised by binding of a Mg2+ cation in only one crown. It occurs from the complexed part to the non-complexed one by coulombic interaction. Another envisaged application can be the construction of complexes containing transition metals for energy or information storage. We studied first the building of a supramolecular system based on phenanthroline and containing four free ether-crowns We also proved that there exists an equilibrium between singlet and triplet excited states in these compounds complexed with Copper(I) or Silver(I). Secondly, we studied formation of complexes binding two ether-crown substituted bipyridines to a Fe2+ ion. Such a complex has got some spin crossover properties. Then, we showed that the addition of Ba2+ ions induce formation of transition metals complexes with nanometric size.