Le développement d'un nouveau médicament est un processus long et coûteux. Entre la détermination d'une cible thérapeutique et la mise sur le marché d'un nouveau médicament, plus de dix ans de recherche sont nécessaires pour un coût supérieur à un milliard d'euros.L'accélération de ce processus et la réduction de son coût restent un enjeu majeur. Pour y parvenir, les simulations numériques, peu coûteuses et rapides, sont massivement utilisées. Malgré cela, elles restent limitées, en partie à cause de la quantité très importante de molécules de solvant à considérer. La théorie de la fonctionnelle de la densité moléculaire permet d'étudier la solvatation de composés de n'importe quelle taille et de n'importe quelle forme. Elle prédit en quelques secondes seulement à la fois l'énergie libre de solvatation et une carte détaillée de la densité d'équilibre autour de ce soluté. Ces grandeurs étant à la base de nombreux autres calculs utilisés par l'industrie pharmaceutique, la MDFT ouvre donc une autre voie d'optimisation de ces process. Cette thèse consiste à effectuer le premier pas vers l'ensemble de ces applications. Pour cela, nous avons adapté la théorie ainsi que le code associé avant de l'appliquer à des systèmes biologiques. / Drug development is time and cost-consuming: It takes in average 10 years and 1 billion euros to move from a therapeutic target to a new drug. To speed up this process and reduce its cost, numerical simulation are massively used. Nevertheless, they remain limited, one reason of which is the huge amount of solvent molecules to consider. The molecular density functional theory is a liquid state theory that allows the study of the solvation thermodynamics of solutes of arbitrary shape. MDFT predicts, in few seconds only, the free energy of solvation and the solvent profils. These parameters are at the heart of many others calculation used by the pharmaceutical industry. This thesis is the first step towards these applications. For that purpose, we adapted the theory as well as the associated code to this new target, then applied them to system of biological interest.

La poursuite de nouveaux angles de recherche est depuis toujours l'un des facteurs clés du progrès scientifique. Au travers de ce travail, nous amenons de nouveaux éléments permettant d'ouvrir une discussion sur la dynamique moléculaire et la structure des biomolécules, étudiées par diffusion neutronique sous haute pression. Le projet d'étude s'axe sur différents sujets ayant pour dénominateur commun la haute pression en biologie, fil conducteur de ces recherches. L'intérêt de la haute pression en biologie n'est pas a priori évident ; pourtant, un grand nombre de points stimulent ce champ d'investigation. Une partie conséquente de la biosphère subit un environnement sous haute pression : les organismes barophiles des grands fonds marins subissent des conditions de stress uniques, qui soulèvent des questions sur l'adaptation biologique. D'autre part, la haute pression trouve un intérêt concret dans l'agro-alimentaire pour la conservation alimentaire ou, nouvellement, la fabrication de vaccins. Cependant, ces recherches se situent en aval des travaux qui nous intéressent dans cet ouvrage. La thèse présentée donne une vision plus théorique, ou phénoménologique, de processus tels que des états métastables protéiques, leur dénaturation, ou encore l'étude de la transition dynamique, aux travers d'expériences adaptées au besoin du sujet entrepris. Un tel travail ne permet pas de couvrir toutes les informations nécessaires pour aborder une vision globale du sujet. L'ouvrage se concentre donc sur l'étude par diffusion neutronique des effets de la pression en biophysique pour élaborer de nouvelles possibilités de recherches, qui seront discutées ici. / Seeking new research options have always been the heart of scientific progress. Through this work, new elements are brought to start a discussion about molecular dynamics and biomolecule structure studied through high pressure experiments with neutron scattering. The project explores different subjects all gathered around the high pressure guideline. High pressure interest in biology might seem quite opaque: however, a large amount of points justifies this investigation field. A large part of the biosphere undergoes high pressure stress due to the fact of its presence in the deep sea, raising question about biological adaptation to high pressure environment, for example. High pressure in the last decades has raised interest on other purposes like food conservation or vaccine fabrication. These research fields are on the final stage of the steps studied in this work, that starts its origin through more theoretical and phenomenological events. The manuscript covers different areas such as dynamical transition or metastable state and denaturation of proteins through experiments designed to the need of the research. Such a field requires a gigantic amount of investigation while restraining the possibilities of generalization. Thus, the work is focused on neutron scattering as a probe for high pressure studies in biophysics in order to elaborate new research clues in the field dealt with.

Dans cette thèse, nous avons développé et caractérisé un nouveau type de source de mise en phase gazeuse de biomolécules qui repose sur une désorption laser non résonnante sur des microgouttelettes directement sous vide. Ce dispositif nous permettra à terme d’ouvrir une voie d’étude originale pour appréhender les effets des rayonnements ionisants sur des molécules organiques d'un point de vue physique.Nous présenterons en détail ce dispositif avec lequel nous avons réussi à transférer sous vide, de façon non destructive, des biomolécules et des complexes non-covalents dans une gamme de masse de l’ordre du kDa et à les identifier par spectrométrie de masse par temps de vol. Nous montrerons notamment les défis techniques qu’il a fallu relever pour permettre le transfert des microgouttelettes sous vide et comment par simulation du spectromètre, nous sommes parvenus à optimiser fortement les paramètres de collection des espèces moléculaires désorbées et la résolution en masse de notre système, en remplaçant, dans la zone de désorption, l’extraction électrostatique à potentiels retardés par un piège électrostatique quadripolaire. Nous exposerons enfin la façon dont ce dispositif, couplé à une plateforme d'irradiation d'ions simplement chargés possédant une énergie de l'ordre du keV, nous permettra de caractériser à une échelle moléculaire l’endommagement lié à des mécanismes de chimie radicalaire radio-induits. / In this thesis, we have developed and characterized a new type of gas phase source of biomolecules which based on non-resonant laser desorption on microdroplets directly under vacuum. This device will eventually allow us to open an original way to study the effects of ionizing radiation on organic molecules from a physical point of view. We will present in detail this device with which we transfered with sucess under vacuum,in a non-destructively way, biomolecules and non-covalent complexes in a mass range of the order of kDa and we assigned them with time-of-ight mass spectrometry. We will show in particular the technical challenges that we had to overcome in order to allow the transfer of microdroplets under vacuum and how by simulation of the spectrometer, we have been able to highly optimize the collection parameters of the desorbed molecular species and the mass resolution of our system, by replacing, in the desorption zone,delayed extraction by a quadrupole electrostatic trap. Finally, we will describe the way in which this device, coupled to a simply charged ion irradiation platform with an energy of the order of the keV, will enable us to characterizeon a molecular scale the damage due to radio-induced radical chemistry mechanisms.

L'objectif de cette thèse est de développer un nouvel instrument de chromatographie de partage centrifuge (CPC) dédié à la purification de molécules très polaires. La CPC est une technique préparative permettant la séparation des molécules grâce à l'utilisation d'un système solvant constitué de deux liquides non miscibles. Ce manuscrit expose dans un premier temps les différentes techniques de purification de protéines utilisées dans le cas d'un procédé industriel de production. Un focus est réalisé sur l'utilisation de systèmes biphasiques aqueux pour la purification des biomolécules, qui représente un réel avenir dans l'industrie du fait de son faible coût, de sa facilité de montée en échelle et surtout de l'environnement favorable qu'il fournit aux biomolécules. Ainsi en se basant sur les avantages de ces systèmes solvants dits Aqueous Two Phase Systems (ATPS), la CPC pourrait apporter une efficacité supplémentaire permettant de purifier les protéines à moindre coût. Pour pouvoir répondre à cet enjeu industriel, il est nécessaire de développer à la fois des méthodes chromatographiques innovantes et de nouveaux instruments dédiés. En effet, les instruments de CPC actuels ne sont pas compatibles avec les Bonne Pratique de Fabrication du fait de la présence de joints téflons qui empêche la possibilité de stériliser les instruments. La fabrication d'un nouvel instrument monobloc entièrement en titane a été réalisée grâce à la technologie de l'impression 3D pour répondre à cette problématique. L'objet de cette thèse est l'évaluation poussée des performances de cette nouvelle colonne afin de déterminer son applicabilité à la purification des biomolécules. Un focus sera également apporté à l'injection de volumes très faibles d'échantillon afin de faciliter le développement de méthodes / The aim of this thesis is to develop a new centrifugal partition chromatography (CPC) instrument in order to purify highly polar molecules. CPC is a preparative technique for the separation of molecules using a solvent system composed of two immiscible liquids. This manuscript describes the different protein purification techniques used in industrial production process. A focus is made on the use of aqueous biphasic systems for the purification of biomolecules, which represents a real trend in the industry thanks to its low cost, scaling simplicity and especially the favorable environment that it provides to biomolecules. Thus, based on the advantages of these solvent systems known as Aqueous Two Phase Systems (ATPS), CPC could provide additional performances to purify proteins at lower cost. To respond to this industrial challenge, it is necessary to develop both innovative chromatographic methods and new devoted instruments. Indeed, current CPC instruments are not compatible with Good Manufacturing Practices due to the presence of Teflon seals which prevents the possibility of sterilizing the instruments. The manufacture of a new monobloc instrument entirely made of titanium was achieved thanks to the 3D printing technology. The purpose of this thesis is the evaluation of this new column performance in order to determine its applicability to biomolecules purification. A special attention is also provided to the injection of very small sample volumes in order to facilitate method development

Cette thèse s'inscrit dans le cadre du projet européen BIOCOR ITN. Les matériaux métalliques habituellement utilisés dans les circuits de refroidissement de centrales électriques peuvent être affectés par la biocorrosion. L'objectif de ce travail était d'étudier l'influence de l'adsorption de biomolécules sur le comportement électrochimique et la composition chimique de surface de l'alliage 70Cu-30Ni, l'acier inoxydable 304L et le titane en milieu marin. Les interactions entre l'albumine de sérum bovin (BSA), et la surface de ces matériaux ont été étudiées. Ensuite, l'effet des substances polymériques extracellulaires (EPS) (étroitement liées -TB- et faiblement liées -LB- à la surface cellulaire) sur les couches d'oxydes a été évalué. Des mesures électrochimiques (Ecorr vs temps d'immersion, courbes de polarisation et EIS) ont été combinées à des analyses de surface (XPS et ToF-SIMS). En comparaison de l'alliage 70Cu-30Ni en eau de mer artificielle (ASW) statique sans biomolécules, pour lequel une couche duplex épaisse est montrée, la présence de biomolécules conduit à une couche mixte d'oxydes d'épaisseur plus faible. Un modèle est proposé pour analyser les données d'impédance obtenues à Ecorr. Un ralentissement de la réaction anodique par les biomolécules a été montré avec un effet d'inhibition de la corrosion par les LB EPS, dans une moindre mesure par la BSA et aucun effet néfaste en présence de TB EPS. L'effet des TB EPS et de la BSA sur la passivation du Ti dans ASW et de l'acier inoxydable 304L dans une solution sans chlorure a été étudié. Pour les deux matériaux, les couches d'oxydes sont plus protectrices avec la BSA et moins protectrices avec les TB EPS. / This thesis was carried out in the frame of the BIOCOR ITN European project. Metallic materials commonly used in cooling systems of power plants may be affected by biocorrosion. The objective of this work was to study the influence of biomolecules adsorption on the electrochemical behaviour and the surface chemical composition of 70Cu-30Ni alloy, 304L stainless steel and titanium in seawater environments. The interactions between a model protein, the bovine serum albumin (BSA), and the surface of these materials were investigated. After, the influence of tightly bound (TB) and loosely bound (LB) extracellular polymeric substances (EPS) on the oxide layers was evaluated. For that purpose, electrochemical measurements (Ecorr vs time, polarization curves and EIS) were combined to surface analysis (XPS and ToF-SIMS). Comparing to the 70Cu-30Ni alloy in static artificial seawater (ASW) without biomolecules, for which a thick duplex oxide layer is shown, the presence of BSA, TB EPS and LB EPS leads to a mixed oxide layer with a lower thickness. A model is proposed to analyse impedance data obtained at Ecorr. The results show a slow-down of the anodic reaction in the presence of biomolecules with a corrosion inhibition effect by LB EPS, to a lesser extent by BSA and no detrimental effect with TB EPS. On the other hand, the effect of TB EPS and BSA on the passivation behaviour of Ti in ASW and of 304L stainless steel in chloride-free solution was studied. From EIS data, resistivity profiles within oxide films can be plotted. For both materials, oxide layers are more protective with BSA and less protective with TB EPS.

La mise au point de nouvelles stratégies de détection de biomolécules rapides et ultrasensibles est largement présente dans la littérature scientifique. L’émergence des nanotechnologies et la compréhension grandissante des phénomènes nanoscopiques ajoutent de nouveaux outils aux coffres des chercheurs. L’interaction lumière-matière menant à la création de plasmons de surface et leur effet sur la signature spectroscopique des molécules avoisinantes a permis aux scientifiques de révolutionner ce domaine en mettant à profit ces propriétés uniques des nano-objets. L’utilisation et le déploiement de ces technologies sont limités, en partie, par le fait que les instruments analytiques courants ne sont pas adaptés à la mesure de nanoparticules. Il y a donc un besoin criant pour le développement de plateformes flexibles permettant la détection de divers biocapteurs nanométriques. Une approche de mesure en flux permet généralement d’obtenir plus d’informations statistiques sur l’échantillon analysé tout en offrant une cadence analytique élevée, avantages indéniables pour une utilisation sur le terrain. La plateforme développée utilise un écoulement laminaire et l’encodage spatial du signal pour assurer robustesse, simplicité et sensibilité. En effet, le grand volume sondé des techniques d’encodage spatial permet la mesure de beaucoup de photons pour chaque particule tout en permettant la discrimination de particules adjacentes par corrélation croisée. De plus, cela diminue les requis d’alignement et le nombre de pièces optiques nécessaires. L’appareil mis au point utilise un capillaire carré dont l’intérieur est recouvert d’or à l’aide d’une méthodologie de placage sélectif unique qui permet la fabrication d’un code-barres interne robuste et qui rend le dispositif d’encodage et le système fluidique solidaire. Les performances d’encodage et de comptage seront présentées ainsi que l’applicabilité de la plateforme à la mesure d’un biocapteur d’ADN basé sur une nanoparticule d’argent. L’algorithme de traitement de données et les outils d’analyse de signal seront aussi présentés. / Finding new fast and ultra-sensitive ways of detecting biomolecules is the target of numerous researchers and is largely present in the scientific literature. The emergence of nanotechnology and the continously growing comprehension of nanoscopic phenomena add new tools to the scientist’s toolbox. Light-matter interactions that give rise to surface plasmons and their effect on the spectroscopic signature of surrounding molecules are key factors for the current revolution of this domain. The use of these new technologies for real world analysis is limited in part because traditional analytical instruments are not adapted to the detection of nanoparticles. This explains the need for flexible detection platforms that can measure a range of nanometric biosensors. Measuring single particles in a flow usually give more information on the distribution of the sample and a higher analytical throughput than static measurements, which are undeniable advantages for usage in the field. The detection platform described in this thesis uses laminar flow and spatial encoding of the signal to ensure robustness, simplicity and sensitivity. The large probed volume offered by spatial encoding gives particles a long transit time which translates into high photon counts while enabling the differentiation of adjacent particles by cross-correlation. Moreover, the platform requires less stringent optical alignment and less optical components The particle counter uses a square capillary whose interior is coated using a unique selective gold coating methodology. This coating method allows the creation of a barcoded region that will become the probed volume. This inner coating is protected from mechanical damage and marries the fluidic system and the encoding device. The encoding performance as well as counting efficiencies will be discussed. Preliminary results of DNA detection using a silver nanoparticle-based biosensor will be exposed. The data treatment algorithm and the signal analysis tools developed will also be presented

L'objectif est la valorisation de biomolécules issues des eaux du procédé thermomécanique de fabrication de pâte à papier. La séparation des familles de biomolécules doit permettre de générer plusieurs fractions ayant un intérêt pour l'industrie cosmétique et phytosanitaire. Les terpènes, hémicelluloses, lignine et lignanes ont été identifiés dans ces eaux. Cependant, le choix s'est porté sur la valorisation de la lignine et des lignanes pour des raisons de sélectivité et de valeur ajoutée. La flottation et la filtration par membrane 150 kDa permettent d'effectuer une clarification par élimination de 100% des terpènes et de 59% des hémicelluloses. Le fractionnement de la lignine et des lignanes est effectué avec des membranes de 1 kDa et 300Da à pH 4 pour obtenir deux rétentats contenant respectivement 96% de lignine et 58% de lignanes par rapport aux polyphénols totaux. Une étude technico-économique de faisabilité de la filière de séparation est réalisée à l'échelle semi-industrielle . / This thesis work is part of a dynamic industrial ecology around the paper industry. The objective is the valorization of biomolecules coming from thermomechanical process waters of manufacture of paper pulp. The separation of biomolecule's families must allow generate several fractions having an interest for cosmetic and phytosanitary industry. Terpenes, hemicelluloses, lignin and lignans have been identified in these waters. However, the choice has worn on the valorization of lignin and lignans for reasons of selectivity and added value. Flotation and 150 kDa membrane filtration allow for clarification by removal of 100% of terpenes and 59% of hemicelluloses. Fractionation of the lignin and lignans is carried out with membranes of 1 kDa and 300 Da at pH 4 to obtain two retentates containing respectively 96% of lignin and 58% of lignans relative to the total polyphenols. A technical-economic study of feasibility of separation process is carried out on semi-industrial scale.

Ce travail de thèse porte sur l'analyse conformationelle de biomolécules en phase gazeuse. L'étude d'objets complexes en phase gazeuse permet de connaître les facteurs intrinsèques stabilisant leur structure. La première étape de mes travaux a été le couplage entre un appareil de mobilité ionique (IMS) et un appareil de spectrométrie de masse (MS). Nous avons simulé (SimIon) et développé différentes optiques ioniques fonctionnant à haute pression (entonnoirs à ions, piège ionique). Ces modifications expérimentales nous ont permis de commencer des études conformationnelles de biomolécules en phase gazeuse.Les premières expériences avaient pour objectif d'observer les facteurs stabilisants une structure secondaire sur des séries de peptides analogues. La première étude a été réalisée sur des séries de polyalalanines et de polyglycines de formules Arg(Ala)4XxxAla4Lys et Arg(Gly)4Xxx(Gly)4Lys, où Xxx est l'un des 20 acides aminés naturels. Nous nous sommes intéressés à l'influence de l'acide aminé central sur la conformation globale. Puis nous avons observés la stabilité de l'hélice de la partie transmembranaire de la protéine M2 du virus de la grippe A et de différents mutants. Ces études ont permit de montrer l'importance de la solvatation des charges en phase gazeuse.Enfin nous avons initié une étude sur le repliement des protéines en utilisant une protéine modèle, le lysozyme. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux mécanismes de repliements en fonction du degré d'oxydation de cette dernière

Le développement des nano et biotechnologies pousse à la recherche de techniques de caractérisation adaptées à l’étude des systèmes nanostructurés. La spectrométrie Raman exaltée de surface (SERS) est une technique d’analyse en plein essor dans ce domaine.Dans ce travail de thèse nous nous sommes attachés à étudier, par cette technique, différents types de systèmes nanostructurés : des biomolécules et des films minces inorganiques. Le but était d’accéder à des informations sur la structure et les liaisons chimiques présentes dans ces systèmes. L’étude a été complétée par des observations par microscopie électronique en transmission notamment.Dans un premier temps, a été réalisée l’étude de molécules d’intérêt biologique. L’objectif était la compréhension des modes d’interaction nanoparticules métalliques/protéines menée sur des nanoparticules d’argent bio-conjuguées avec des protéines depuis leur synthèse jusqu’à leur caractérisation. Les résultats ont montré la chimisorption des protéines à la surface de nanoparticules d'argent possiblement par leurs terminaisons azotées. La technique SERS a également été expérimentée dans le domaine des basses fréquences pour caractériser la structure de dépôts minces de caféine, molécule d’intérêt pharmaceutique.Dans un second temps, l’étude de couches minces nanostructurées par spectrométrie Raman et SERS a été réalisée. Des couches minces nanocomposites TiO2:Au, ont été étudiées pour décrire les premières étapes de croissance des nanoparticules sous l’effet de la température dans ces matériaux. Des films ultraminces de TiO2 d’épaisseur contrôlée ont été déposés sur substrats fonctionnalisés avec des nanoparticules d’or pour étudier leur exaltation par effet SERS. / This work addressed the study of several kinds of nanostructured systems, biomolecules and inorganic thin films, mainly by Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS). The aim was to investigate the structure and the chemical bonds. Transmission electron microscopy (TEM) was also used to complete the structural characterization of the different samples.Firstly, the study was conducted on molecules of biological interest. The aim was to study the interaction between silver nanoparticles and proteins. With this aim, silver nanoparticles bioconjugated with different proteins (hemoglobin, cytochrome C, BSA and lysozim) were synthesized. SERS results allowed concluding that proteins are chemisorbed on the silver nanoparticules surface. SERS was also used in the low frequency range to characterize the structure of thin deposits of caffeine, a molecule of pharmaceutical interest.Raman spectroscopy and SERS were also used to study nanostructured TiO2:Au thin films. The first stages of the growth of gold nanoparticles in Au doped TiO2 thin films under annealing treatments were studied by low frequency Raman spectroscopy and TEM. Finally, it was shown that SERS effect can be used for the characterization of ultra-thin TiO2 films. With this aim, ultra-thin TiO2 films were deposited by Atomic Layer Deposition on Si substrates functionalized with gold nanoparticles and studied by SERS.

Cette thèse présente l'étude de l'interaction d'ions multichargés de basse énergie (quelques 10 keV) avec des systèmes complexes d'intérêt biologique (acides aminés et base azotée). Dans ce cadre, l'objectif de travail se situe dans la compréhension et la mise en évidence d'effets de l'environnement moléculaire. Afin d'étudier ce phénomène, les spectres en temps de vol des produits cationiques issus de la collision ont été comparés dans le cas de molécules isolées ou au sein d'agrégats purs ou mixtes. Il est apparu que l'environnement moléculaire permettait d'une part de protéger la molécule en autorisant la répartition de l'énergie et de la charge après la collision (se traduisant par une diminution de la fragmentation globale, la fermeture de certaines voies, ...). D'autre part, l'environnement semble susceptible de fragiliser certaines liaisons intramoléculaires comme l'illustre l'apparition de nouvelles voies de fragmentions dans les agrégats d'adénine. Enfin, l'agrégat constitue également un premier environnement chimique avec lequel la molécule va pouvoir interagir. Les spectres obtenus avec des agrégats hydratés d'adénine signent par exemple le transfert d'un proton depuis les molécules d'eau vers la base azotée. Plus surprenant encore, les ions multichargés semblent induire la formation de liaisons peptidiques au sein d'agrégats de beta-alanine. Ce dernier résultat a été étudié plus en détails en fonction de la taille des agrégats ou de l'ion projectile utilisé. Un certains nombre de critères (flexibilité et géométrie de la molécule, testées en utilisant d'autres acides aminés) ont été avancés pour prédire la formation de liaisons peptidiques.