Le système immunitaire des mammifères possède deux composantes, l'immunité innée, première ligne de défense de l'hôte, et l'immunité adaptative, phase plus tardive et spécifique à de multiples antigènes. Dans le contexte infectieux, toute réponse immunitaire commence par la détection du pathogène par des récepteurs de l'immunité innée comme les "Toll-Like Receptors" ou TLR qui reconnaissent des motifs moléculaires conservés chez de nombreux microorganismes. Au cours de ce travail, j'ai étudié un motif microbien en particulier, la flagelline de Salmonella typhimurium, molécule structurale du flagelle et agoniste de TLR5. Les muqueuses respiratoires, digestives ou urogénitales sont donc des sites majeurs d'immunité anti-microbienne car la plupart des pathogènes les ciblent et les colonisent. Mon travail a consisté à disséquer les réponses immunitaires muqueuses induites par la signalisation TLR5 dans deux modèles expérimentaux : (1) une administration locale de la flagelline mimant la colonisation microbienne épithéliale et (2) une administration systémique simulant l'invasion d'un pathogène dans les tissus muqueux. L'instillation de flagelline par voie respiratoire active l'épithélium broncho-alvéolaire. Nos travaux ont montré que la signalisation épithéliale peut avoir un effet thérapeutique par le recrutement de neutrophiles. La contribution de l'épithélium dans l'immunité adaptative muqueuse a été analysée. Lors d'une instillation nasale de flagelline, les animaux développent une réponse en anticorps et une réponse Th1-Th2 à la fois locale et systémique. Nos résultats indiquent que la signalisation TLR dans les cellules épithéliales du poumon est nécessaire et suffisante pour promouvoir cette immunité. Ces observations ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement d'adjuvant muqueux à activité épithéliale et la caractérisation des interactions hôte-pathogène. L'administration systémique de flagelline induit dans l'intestin et les poumons la transcription immédiate mais transitoire des gènes codant les interleukines IL-17A, IL-17F et IL-22, cytokines essentielles à l'élaboration d'une défense anti-microbienne muqueuse. Nous avons identifié comme source de ces cytokines, une nouvelle population de cellules lymphoïdes innées CD3negCD127+. Leur activation est associée à la protection contre une infection orale à Yersinia pseudotuberculosis. Nos données suggèrent donc que les cellules CD3negCD127+ sont cruciales pour les défenses précoces contre l'invasion des tissus muqueux par les pathogènes et leur manipulation pourrait être envisagées à des fins thérapeutiques.

Il apparait de nos jours évident que les cancers ne peuvent se réduire uniquement à des aberrations génétiques, et qu'un nouveau paramètre est à prendre en considération, l'épigénétique. Au cours de ma thèse je me suis efforcé de caractériser la protéine fusion BRD4-NUT. Cette protéine résulte d'une translocation t(15;19) observée dans les carcinomes de la ligne médiane (NMC), extrêmement agressifs et létaux. La protéine BRD4 possède un double bromodomaine capable de s'associer à la chromatine acétylée, et recrute divers facteurs sur la chromatine. NUT est une protéine de fonction inconnue exprimée exclusivement au cours de la spermatogenèse. J'ai pu démontrer que la protéine fusion BRD4-NUT était suffisante pour induire la tumorigenèse, par un mécanisme de séquestration de la proteine histone acétyltransférase (HAT) CBP/p300. NUT interagit avec CBP/p300 et suractive son activité d'acétylation, créant des foci hyperacétylés de chromatine. BRD4-NUT empêche ainsi CBP/p300 d'aller co-activer la transcription de nombreux gènes, et bloque notamment la réponse apoptotique p53-dépendante. Une inhibition de BRD4-NUT – par siRNA, mutation des bromodomaines ou dérégulation de l'acétylation des foci par des inhibiteurs des histones déacétylases (HDAC) – réenclenche la voie d'apoptose et la mort de ces cellules tumorales. Cette étude est un exemple précis de l'impact qu'une dérégulation épigénétique peut avoir sur l'homéostasie cellulaire et son mécanisme d'induction de la tumorigenèse. Je me suis également interessé à caracteriser la protéine NUT lors de son contexte physiologique, la spermatogenèse, ou lors de son expression illégitime dans des lignées tumorales sans fusion avec BRD4. La protéine NUT est exprimée au niveau des stades de maturation des cellules germinales spermatides, et pourrait participer au remodelage du génome et à l'établissement de l'épigénome final du spermatozoïde. Nut semble également conférer un avantage prolifératif lors de son expression anormale dans au moins trois lignées cellulaires, U2OS, A549 et A7R5. Ainsi, la protéine NUT, seule ou fusionnée avec BRD4, est un facteur Cancer/Testiculaire capable d'influer négativement sur l'homéostasie des cellules somatiques dans lesquelles ses fonctions, normalement restreintes à la spermatogenèse, participent à la tumorigenèse.

Les cytochromes P450 (P450) et la NADPH-cytochrome P450 réductase (CPR) sont les principaux acteurs du métabolisme des xénobiotiques chez les mammifères. La CPR est une protéine multidomaine formée de deux domaines catalytiques comprenant les cofacteurs FAD et FMN et reliés par un domaine de connexion. Grâce aux propriétés rédox de ses deux flavines, la CPR est capable de scinder le flux diélectronique du NADPH en deux transferts monoélectroniques vers les P450. Jusqu'alors, la CPR avait toujours cristallisé dans une conformation dite fermée, compatible avec un transfert interne du FAD au FMN, mais dans laquelle le FMN était tellement enfouie au cœur de la protéine qu'un transfert externe vers les P450 était inenvisageable. Le projet de cette thèse consistait à construire et analyser les caractéristiques structurales et biochimiques de CPR chimères constituées de domaines issues des CPR humaine et de levure. Ces chimères sont toujours fonctionnelles vis-à-vis d'accepteurs artificiels et naturels. Leurss constantes catalytiques, la vitesse des différents transferts d'électrons internes et externes, les potentiels standards de leurs cofacteurs ou encore leur stabilité vis-à-vis d'agents dénturants ou de la température ont été mesurés et comparés aux caractéristiques des CPR parentales. De plus, la structure cristallographique de l'une d'elle a pu être déterminée à 2,5 Å de résolution et dans une nouvelle conformation dite ouverte. Celle-ci prouve le caractère dynamique de cette protéine multidomaine, et pourrait correspondre à la conformation de la CPR au sein du complexe bimoléculaire CPR-P450 lors du transfert externe entre le FMN et le cytochrome. Les facteurs pouvant influencer ou dicter ces changements conformationnels ont été appréhendés grâce à des analyses d'enzymologie, de cinétiques rapides, de potentiométrie ou encore de dénaturation.

Helicobacter pylori est une bactérie qui infecte l'estomac de la moitié de la population mondiale et est impliquée dans la plupart des maladies gastriques, dont les ulcères et le cancer de l'estomac. La bactérie produit deux toxines, CagA et Tipα, qui sont associées avec le développement du cancer. CagA est injectée dans les cellules et interagit avec de nombreuses protéines des voies de signalisation cellulaire. Tipα est secrétée et internalisée dans les cellules gastriques où elle induit la production de cytokines pro-inflammatoires. Dans ce travail de thèse, nous avons tout d'abord étudié les interactions entre un domaine central de CagA et des protéines de H. pylori. Nous avons ensuite identifié de nouveaux fragments solubles de CagA par une méthodologie à ‘'haut-débit''. L'un d'eux, correspondant à l'extrémité C-terminale de la protéine de 33kDa, CagAC33, a été caractérisé par différentes techniques de biochimie et de biophysique. CagAC33 forme des dimères de dimères en solution et des particules en microscopie électronique. De plus, CagAC33 peut être phosphorylé in vitro par les kinases c-Src et c-Abl mais l'efficacité de la phosphorylation dépend de la kinase utilisée. L'étude de l'interaction entre la phosphatase SHP-2 et CagAC33 montre que CagA est dephosphorylée in vitro. Par ailleurs, les structures de deux formes cristallines de Tipα ont été déterminées par cristallographie aux rayons X. La structure du monomère de Tipα adopte un nouveau repliement, et la protéine forme des dimères différents dans les deux formes cristallines. L'étude de la protéine en solution indique qu'un des dimères est sans doute favorisé et suggère que les ponts disulfures identifiés en N-terminal ont un rôle durant la sécrétion de la protéine.

Les membranes cellulaires sont constamment remodelées par le bourgeonnement et la fusion de vésicules assurant le transport entre les différentes organelles. De nombreuses protéines périmembranaires orchestrent ce trafic vésiculaire. Les hélices amphipathiques jouent un rôle important dans le mécanisme d'interaction de certaines de ces protéines avec les membranes. A la différence de domaines protéiques reconnaissant spécifiquement un lipide, les hélices amphipathiques reconnaissent plus globalement la physicochimie d'une membrane (forme, charge...). GMAP-210 est une très longue protéine golgienne qui agit comme corde moléculaire grâce à sa structure en coiled-coil. Le laboratoire avait montré que l'extrémité N-terminale de GMAP-210 possède un motif ALPS, une hélice amphipathique singulière sensible à la courbure membranaire. Les motifs ALPS sont caractérisés par l'absence de résidus basiques, l‘interaction avec les membranes ne repose donc que sur l'hydrophobicité. Pour compenser ce déficit, la liaison des motifs ALPS n'a lieu qu'au contact de membranes fortement courbées. Dans le cas de GMAP-210, le motif ALPS permettrait de capturer des vésicules de transport. J'ai démontré que l'autre extrémité de la corde interagit avec Arf1GTP sur des membranes. Cette interaction est conditionnée par le contact avec la surface membranaire d'une petite hélice amphipathique située en aval du domaine d'interaction avec Arf1. De façon remarquable, l'interaction entre Arf1GTP et le domaine C-terminal de GMAP-210 est régulée indirectement par la courbure membranaire. En effet, ArfGAP1, identifiée comme la première protéine possédant un motif ALPS, est capable de dissocier rapidement le complexe de membranes courbées. Par conséquent, GMAP-210 connecte des membranes courbées, par exemple des vésicules, à des membranes planes recouvertes d'Arf1, par exemple des citernes golgiennes. Le mécanisme vectoriel d'attachement de membranes par GMAP-210 repose donc sur de nombreuses hélices amphipathiques (deux dans GMAP-210, une dans Arf1 et une dans ArfGAP1) et permettrait d'expliquer le confinement des vésicules de transport autour de l'appareil de Golgi. Des mesures de vitesse spontanée de désorption membranaire des extrémités de GMAP-210 suggèrent que l'attachement des membranes est très dynamique et a lieu sur des échelles de temps de la seconde à la minute. Le motif ALPS n'est pas le seul motif amphipathique sensible à la courbure. L'alpha-synucléine, une protéine synaptique célèbre pour son implication dans la maladie de Parkinson, contient également une hélice amphipathique senseur de courbure. Curieusement, la physicochimie du motif ALPS et de l'alpha-synucléine est opposée tant pour la face polaire que pour la face hydrophobe. L'alpha-synucléine a une périodicité atypique (3/11), une face polaire zwittérionique et une face hydrophobe présentant de petits résidus et des thréonines. En utilisant des liposomes de composition et de rayon définis, j'ai montré que la charge négative des membranes est un paramètre discriminant dans la liaison aux membranes des deux protéines. En effet, à la différence de GMAP-210, l'alpha-synucléine est strictement dépendante d'un taux élevé de phospholipides anioniques. Par contre, ces protéines sont toutes les deux très sensibles à la nature des chaînes insaturées des phospholipides. Les premiers résultats montrent néanmoins des subtilités intéressantes : l'alpha-synucléine semble mieux adaptée que GMAP-210 à une membrane polyinsaturée comme l'est celle des vésicules synaptiques. En conclusion, de nombreuses hélices amphipathiques sont impliquées dans le trafic vésiculaire. Elles présentent de nettes différences dans leur physicochimie suggérant une adaptation à des membranes cellulaires (de composition lipidique et de rayon définis) par des mécanismes qui restent largement à explorer.

Le document résume les activités administratives, de recherche, et d'enseignement de l'auteure, de 1998 à 2009. Les activités de recherche concernent l'étude de l'interaction cacao-Moniliophthora perniciosa; activités développées de 2002 à 2009 dans le cadre d'une collaboration Cirad (France) - Universidade Estadual de Santa Cruz (Ilhéus, Brésil).

Le rhum de la distillerie de Savanna est obtenu après fermentation par les levures puis distillation d'un mout constitué de mélasse et d'eau. Nous avons donc étudié la composition de la mélasse. Celle-ci se révèle riche en composés aromatiques qui sont à l'origine des nombreux composés chimiques présents dans les rhums. Nous avons identifié plus de 100 composés chimiques dans la mélasse dont un isomère de la béta-damascenone. Cet isomère pourrait présenter les notes organoleptiques caractéristiques du rhum. Un travail particulier sur des précurseurs d'arômes existant sous forme glycosylée a été entrepris. Puis nous avons étudié le comportement de sept souches de levure et de neuf souches de bactérie en fermentation. Certains paramètres de la fermentation ont été suivis. Nous avons ensuite travaillé sur la composition des distillats. Une étude quantitative et qualitative sur les composés des distillats a été menée. Elle permet de différencier les micro-organismes en fonction des composés chimiques formés pendant la fermentation. Plus de 250 composés ont été identifiés dont 11 n'avaient jamais été mentionnés auparavant dans les rhums. Ce travail permet de se rendre compte de l'importance de la composition de la matière première utilisée et de la nature du micro-organisme employée pendant la fermentation, dans la composition finale du produit.

Les systèmes de communication chimique constituent un élément indispensable dans l'établissement des relations intra- ou inter-espèces en milieu marin, tissant un réseau de relations entre individus, au sein d'un écosystème. Les invertébrés dépourvus de système immunitaire à mémoire et au mode de vie sessile produisent des métabolites bioactifs jouant un rôle essentiel dans la réponse aux pressions environnementales telles que la prédation et la défense vis-à-vis d'autres organismes potentiellement pathogènes. L'objectif de ces travaux a été d'identifier la présence de peptides antimicrobiens chez des mollusques bivalves et des gastéropodes d'importance commerciale. Ainsi, la recherche de molécules de défense antimicrobiennes de nature peptidique a été conduite dans des extraits acides des mollusques bivalves, Cerastoderma edule, Ruditapes philippinarum, Ostrea edulis et gastéropodes, Buccinum undatum, Littorina littorea et Crepidula fornicata, ainsi qu'à partir de l'hémolymphe de Crassostrea gigas. Les extraits ont été pré-purifiés par extraction sur phase solide C18 (SPE) et l'élution a été réalisée par 3 paliers successifs de 10%, 40% et 80% d'ACN-0,1% TFA. L'activité antibactérienne a été évaluée via la détermination de la CMI sur un ensemble de bactéries à Gram+ et à Gram- ; et l'activité antivirale a été déterminée in vitro sur le modèle virus Herpes simplex type 1/cellules Vero via la viabilité cellulaire. Les espèces C. edule, L. littorea et C. gigas se sont révélées être les espèces les plus efficaces et non cytotoxiques. Une caractérisation partielle de l'activité détectée chez ces espèces a permis de déterminer la nature peptidique des molécules actives. La purification des peptides antimicrobiens a été conduite sur l'hémolymphe de C. gigas et a permis l'identification d'un peptide dont la structure de type lantibiotique laisse présager une origine bactérienne. L'hypothèse d'une association entre C. gigas et des bactéries nous a conduit, à partir de cultures d'huîtres non axéniques, à rechercher des bactéries antagonistes dans l'hémolymphe et a permis d'isoler 2 Vibrio spp. et 3 Pseudoalteromonas spp. A partir de la bactérie Pseudoalteromonas spp. souche hCg 5, un composé actif a été partiellement caractérisé. L'ensemble de ces résultats suggère que les bactéries associées au système immunitaire pourraient jouer un rôle essentiel dans la défense des bivalves.

Le système de réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) est impliqué dans la cytotoxicité du cisplatine, puissante drogue anticancéreuse qui interagit avec l'ADN. Nous avons étudié in vitro certaines étapes clé des mécanismes moléculaires qui relient le fonctionnement du système de réparation MMR avec la cytotoxicité de cette drogue. Notre étude s'est focalisée sur l'interaction entre l'ADN platiné et la protéine MutS du système MMR impliquée dans les étapes d'initiation de la réparation. Trois points ont été abordés dans cette étude : i) la reconnaissance par MutS des lésions du cisplatin et des composés de lésion du cisplatine (formés lorsqu'une base non complémentaire est incorporée en face de l'une des deux purines pontées par le platine) ii) l'étape d'initiation de la réparation régulée par la fixation d'ATP et d'ADP par la protéine MutS iii) l'étude d'un dérivé du cisplatine (DACH-platine) ne présentant pas de résistance croisée avec le cisplatine. Les principaux résultats ont été obtenus par des techniques électrophorétiques et par résonance plasmonique de surface. Notre étude montre que MutS joue le rôle d'un senseur des lésions du cisplatine et que l'ADN platiné peut jouer le rôle d'un cofacteur dans la régulation biochimique de l'activité de MutS en présence de nucléotides régulateurs. Nos résultats suggèrent que les composés de lésion des adduits majoritaires du cisplatine pourraient être les lésions critiques impliquées dans la cytotoxicité du cisplatine via le système MMR.

Ce travail a exploité les remarquables propriétés électroniques du tétrathiafulvalène (TTF) au sein de deux nouveaux systèmes : les TTF-bis-oxazolines et les TTF-triazines. La fonctionnalisation du TTF par des groupements oxazolines a permis l'introduction de la chiralité sur le donneur. Les structures cristallines des molécules synthétisées ainsi que celles de leurs intermédiaires sont reportées. Nous présentons diverses approches employant ces composés comme précurseurs de matériaux mulifonctionnels. Les TTF-bis-oxazolines ont par ailleurs servi comme ligands chiraux pour des matériaux. Des complexes de cuivre ont permis de réaliser différentes réactions de catalyse homogène énantiosélective. Nous nous sommes intéressés, dans ce dernier cas, à l'influence de l'état rédox du TTF sur l'activité catalytique et l'induction chirale de ces complexes. Dans une seconde partie, nous reportons la synthèse de nouveaux systèmes Donneur-Accepteur associant le TTF (D) à une plateforme triazine (A). Les études théoriques et expérimentales réalisées sur une diade D-A et une triade D-A-D ont permis de caractériser parfaitement le transfert de charge intramoléculaire présent dans ces systèmes. La 2-TTF-4,6-bis-méthoxy-1,3,5-triazine apparaît comme un bon candidat pour l'électronique moléculaire.