Les protéines [Fe-S] sont des enzymes ubiquitaires, assurant des fonctions clés au sein des organismes vivants. La biosynthèse des centres [Fe-S], à savoir les processus permettant un assemblage correct des atomes de fer et de soufre au sein des protéines cibles, requièrent la participation de machineries protéiques complexes. Parmi elles se trouve la machinerie SUF qui intervient dans des conditions de stress oxydant et de carence en fer. Elle est composée de six gènes sufABCDSE. La protéine SufA est proposée comme étant une protéine scaffold ayant pour rôle de préassembler transitoirement des centres [Fe-S] et de les transférer à des protéines cibles. Elle possède trois résidus cystéines conservés proposés comme étant les ligands des centres [Fe-S].<br />SufA est obtenue principalement sous forme apo après purification. Le centre [Fe-S] peut être reconstitué chimiquement in vitro. Dans ces conditions, SufA contient un mélange de centres [2Fe-2S] et [4Fe-4S]. Nous avons alors isolé SufA native métallée après purification à partir de tout l'opéron suf en anaérobiose, et montré qu'elle contient un centre [Fe-S], plutôt de type [2Fe-2S], transférable efficacement à la ferrédoxine. Nous avons également étudié les mécanismes moléculaires de formation du cluster dans SufA. SufA est capable de fixer à la fois du soufre, au niveau de ses trois cystéines conservées, et du fer, majoritairement au niveau d'atomes d'azote et d'oxygène. Ces éléments sont mobilisables pour la formation d'un centre [Fe-S] en milieu réducteur. Enfin, des expériences préliminaires réalisées in vitro avec des mutants dirigés n'ont pas permis d'identifier la nature exacte des ligands du centre [Fe-S] dans SufA.

Les processus de l'évolution des génomes, particulièrement des génomes de primates, font l'objet de cette thèse. Ont été ainsi creusées les questions de la conservation ou non de séquences nucléiques de précurseurs peptidiques dans la lignée des primates, et de la mise en place, de l'évolution et de l'expression de deux familles de gènes spécifiques des primates. <br /><br />Brassages d'exons, rétrotransposition, duplications... sont impliqués dans la création de nouveaux gènes. L'étude de la création et des premiers temps d'un gène nécessite la mise en évidence de gènes récents, ayant conservé les caractéristiques de leur mise en place. <br /> Deux familles de gènes ont retenu mon attention:<br />1. Les gènes PMCHL ont été créés récemment par des processus de rétroposition, remaniements, insertions/délétions et accumulation de mutations. Des analyses de structure et phylogénétique permettent une meilleure compréhension de l'origine de ces gènes spécifiques des Primates. Les gènes PMCHL sont transcrits, de façon tissu-spécifique, et présentent de nombreux épissages alternatifs. Enfin, l'expression des ARN messagers PMCHL est comparée dans le cerveau de l'Homme et du Macaque. <br />2. Les gènes dérivés de GUSB ont été identifies par hybridation in situ fluorescente chez les Primates. Une recherche systématique dans le génome humain a permis la découverte et la caractérisation d'une grande famille de gènes comptant plus de quinze paralogues chez l'Homme. L'analyse structurale et phylogénétique de ces séquences a permis de préciser l'histoire de leur mise en place et de leur évolution. Certains des membres de cette famille de gènes ont en outre acquis une capacité transcriptionnelle.

Rim101p est un facteur de transcription qui est activé par cleavage N-terminale à pH alcalin. Il régule ainsi la réponse au pH et joue aussi un rôle majeur dans la pathogenèse de la levure Candida albicans. Mon projet est d'identifier et d'étudier des gènes de surface régulés par Rim101p qui ont une fonction dans l'interaction hôte-levure.<br />Une analyse du transcriptome suite à l'induction d'une forme tronquée et constitutivement active de Rim101p nous avait permis d'identifier et de classer 133 gènes qui semblent être des cibles de Rim101p. Les données des microarrays ont été confirmées pour 20 gènes par PCR quantitative, en utilisant des conditions plus physiologiques. <br />Plusieurs adhésines de la famille des gènes ALS (Agglutinin-Like-Sequence) qui comporte 8 gènes semblent être régulé par Rim101p. Certaines jouent un rôle important dans la formation des biofilms et ainsi dans la virulence de C.albicans. Malgré la grande ressemblance des gènes au niveau de leur séquence nous avons pu confirmer le rôle de Rim101p dans la régulation d'au moins deux gènes ALS (ALS1 et ALS4) dans une analyse de la famille entière en PCR quantitative avec des oligos gène-spécifiques. <br />Pour analyser la régulation de ces gènes au niveau de leur promoteur, des fusions avec le gène rapporteur « LacZ » ont été intégré dans le génome de C. albicans et l'activité de la Β-Galactosidase a été quantifiée en fonction du pH et de la présence ou absence de Rim101p. Nous avons abandonné ce projet car les résultats n'étaient pas reproductibles et cohérents avec les quantifications directes des transcripts. <br />Finalement nous avons utilisé une souche qui porte une version étiquetée de Rim101 avec l'étiquette V5 pour essayer de mettre en évidence par in vivo chromatine immunoprécipitation (ChIP) que les promoteurs sont des cibles directes de Rim101p. Nos résultats indiquaient un enrichissement <br />Dans un dernier projet, nous avons essayé de mettre en évidence par des approches d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) que les promoteurs étient des cibles directes de Rim101p en utilisant une souche qui exprimait une version de Rim101p étiquetée avec l'épitope V5. Nous avons observé un plus grand nombre des promoteurs cibles dans les échantillons pris à pH alcalin que dans ceux pris à pH acides. Toutefois, ces résultats n'étaient pas très solides, car la reproductibilité était faible et nous avons occasionnellement observé un enrichissement similaire pour des promoteurs non-régulés utilisés comme contrôles dans ces expériences.

Résumé synthétique des activités de recherche<br />Mon expérience de recherche débuta avec mon DEA puis ma thèse et se continua pendant un séjour post-doctoral à Heidelberg. Depuis Décembre 2000, j'ai rejoint le Laboratoire de Transgenèse et Génétique des Amphibiens à Orsay en qualité de chargé de recherche au CNRS.<br />Au Kremlin-Bicêtre, à l'unité 347 de l'INSERM “ Génétique et mécanismes des maladies du foie de l'enfant ” dirigée par Michelle Hadchouel, et sous la direction de Michèle Meunier Rotival, mon travail de thèse se centrait sur l'identification par clonage positionnel du gène dont les dysfonctions sont responsables du syndrome d'Alagille.<br />A Heidelberg, au centre allemand de recherche sur le cancer (le DKFZ) au sein du département "Molecular Embryology" dirigée par Christof Niehrs, la recherche porte sur l'embryogenèse précoce chez les vertébrés en utilisant l'amphibien anoure Xenopus laevis comme modèle expérimental. J'ai travaillé plus particulièrement sur l'analyse systématique des profils d'expression génique, l'étude de l'anatomie moléculaire de l'embryon de vertébré et l'isolement de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle du développement embryonnaire. <br />A Orsay, au sein du Laboratoire de Transgenèse et Génétique des Amphibiens de l'UPRESA808 dirigée par le Pr Maurice Wegnez, je mène une approche de génomique fonctionnelle pour appréhender les mécanismes de régulation transcriptionnelle au cours de la métamorphose chez Xenopus tropicalis.<br /><br />Travail de thèse<br />Le syndrome d'Alagille (AGS, MIM 118450) est défini par l'association d'anomalies cardiaque, hépatique, oculaire, squelettique et un faciès particulier. La région p12 du chromosome 20 humain a été associée à l'AGS par l'observation de patients porteurs de délétions. Mon travail de thèse a consisté à rechercher le gène responsable de ce syndrome par clonage positionnel. Dans un premier temps, une carte physique contenant le locus AGS et couvrant 3,7 Mb a été construite (Pollet et coll., 1995). Dans un deuxième temps, un contig de 67 YACs couvrant 10 Mb a été caractérisé et a permis d'ordonner 72 marqueurs, et de localiser 20 gènes. Le gène Jagged1 a été identifié comme étant le seul localisé dans la région critique, et a été proposé comme gène candidat responsable de l'AGS (Pollet et coll., 1997). Une recherche de mutations a été effectuée sur 109 patients AGS après une première mise en évidence de mutations de ce gène chez des patients AGS par deux équipes américaines. Il en ressort que sur les 59 mutations différentes recensées se situent dans le domaine extracellulaire, la plupart sont de nature à donner naissance à une protéine JAGGED1 tronquée. L'analyse de la transmission des mutations a révélé que 70% des cas de patients AGS sont sporadiques (Crosnier et coll., 1999).<br /><br />Mes travaux de stage post-doctoral ont consisté à caractériser systématiquement l'expression de gènes exprimés au cours de l'embryogenèse par hybridation in situ sur embryons de xénope, à séquencer partiellement les ADNc correspondants et à maintenir une base de données accessible via l'Internet. 10000 clones d'ADNc ont été caractérisés, 1300 ont été séquencés partiellement. Une base de données d'accès public (Axeldb, Pollet et coll., 2000) de type Acedb compile les premiers résultats publiés concernant l'identification de 273 gènes exprimés différentiellement, dont 204 sont nouveaux chez le xénope (Pollet et coll., 1998). 26 % des ADNc caractérisés correspondent à des gènes d'expression régionalisée au cours du développement, 51 % à des gènes d'expression ubiquitaire et 23 % ne donnent aucun résultat. L'analyse globale des profils d'expression révèle l'existence de groupes de gènes différents qui ont une expression régionalisée comparable. De tels groupes de « synexpression » permettent de prédire la fonction de certains gènes pour lesquels l'analyse de séquence reste non-informative (Niehrs et Pollet, 1999).<br /><br />Recherches en cours<br /> Aujourd'hui, le génome complet de plusieurs organismes procaryotes et eucaryotes, unicellulaires et pluricellulaires a été séquencé. Ces avancées ont mis en évidence un important nombre de gènes de fonction inconnue (gènes orphelins). Pour tirer pleinement profit de la connaissance intime des génomes, humain en particulier, une analyse fonctionnelle détaillée et systématique par l'expérimentation et l'étude des génomes d'organismes modèles est nécessaire. L'étude des patrons d'expression des transcrits est une approche qui se prête bien à une analyse systématique et à grande échelle visant à proposer un rôle biologique à chaque gène et peut fournir des informations inédites sur ceux qui sont déjà connus.<br />La grande majorité du programme génétique s'exprime pendant le développement embryonnaire. Le modèle murin reste coûteux et lourd à établir pour étudier les mécanismes moléculaires du développement précoce. En ce sens, le xénope, et en particulier Xenopus tropicalis qui présente tous les avantages de Xenopus laevis plus celui d'être un vrai diploïde, s'annonce comme un modèle vertébré prometteur. Ces caractéristiques vont permettre d'appliquer des systèmes perfectionnés d'études génétiques.<br />Je réalise une étude systématique et à grande échelle d'identification et de caractérisation de l'expression des gènes pendant le développement et la métamorphose chez Xenopus tropicalis. <br />Les différents aspects traités dans ce projet font appel à la réalisation d'un catalogue de gènes (séquençage d'aDNc), à la caractérisation par analyse systématique de profils d'expression génique (puces à ADN) et l'analyse in silico des résultats obtenus (approche bioinformatique). <br />Les connaissances issues de ce projet permettront de constituer un atlas de l'expression des gènes au cours de l'embryogenèse des vertébrés. Cette ressource sera une aide précieuse dans l'étude des réseaux de régulation génétique et des mécanismes par lesquels l'expression différentielle des gènes se met en place au cours du développement embryonnaire. Enfin, les méthodes que je propose d'utiliser vont certainement permettre de définir de nouveaux groupes de synexpression caractéristiques de certaines voies du métabolisme ou de certaines cascades de signalisation.

Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est un γ -herpesvirus humain. Il est responsable de maladies telles que la mononucléose-infectieuse et il est associé à de nombreux<br />carcinomes et syndromes immunoprolifératifs. A la différence d'autres herpesvirus tel que herpes-simplex, il n'existe actuellement aucun médicament efficace contre EBV. Le génome d'EBV contient 86 cadres de lecture soit autant de cibles potentielles pour une approche de génomique structurale, permettant le développement rationnel de nouvelles thérapies. La première série de cibles sur laquelle nous avons travaillé code pour 23 protéines. De façon inattendue, le principal problème rencontré lors de ce projet fut la faible expression ainsi que l'insolubilité d'une grande partie des cibles.<br />Parmi les 8 protéines solubles, 5 furent cristallisées à l'issue de quoi, 4 structures furent résolues. La clef de la réussite de ce projet fut un traitement individuel de chaque cible plutôt que l'utilisation de protocoles standards. La partie centrale de ce travail porte sur l'Uracile-ADN Glycosylase (UNG). C'est une enzyme de réparation de l'ADN. Il nous fut impossible d'obtenir des cristaux de la protéine seule, mais, grâce à la formation d'un complexe avec une protéine inhibitrice produite par le phage PBS-2, nous obtînmes des cristaux diffractant à 2.3 Å. La structure de ce complexe nous permis l'expliquer l'organisation de la « boucle leucine », un domaine du site actif, qui comporte une insertion de 7 résidus chez tous les γ-herpesvirus. Malgré cette différence, les constantes catalytiques de l'UNG d'EBV sont proches de celles des autres UNGs ce qui suggère un mécanisme similaire d'interaction avec l'ADN. Le travail sur d'autres cibles et les difficultés qui leur sont <br />inhérentes est également abordé (notamment l'Alkaline Exonucléase).

Le nucléole est le lieu où débute la synthèse des ribosomes. Sa structure est fortement corrélée à la transcription des gènes ribosomiques. La régulation de l'expression des gènes ribosomiques est une étape importante de la biogenèse des ribosomes. L'objectif de ce travail a été de définir et d'ouvrir des voies méthodologiques pour mettre en évidence le rôle de macroH2A et de la nucléoline dans la régulation de l'expression des gènes ribosomiques. MacroH2A est pour l'instant le seul variant d'histone présent dans le nucléole. La nucléoline est une des protéines majoritaires du nucléole. La première partie de notre étude a porté sur un système cellulaire original celui de la carpe dont l'adaptation aux conditions climatiques (hiver et été) requiert des changements importants dans l'expression génique. Ainsi la répression de l'expression des ARN ribosomiques, associée à une baisse d'activité cellulaire, est concomitante avec (i) une déstructuration du nucléole, (ii) une augmentation de la concentration de macroH2A et de la nucléoline et (iii) une augmentation de la méthylation d'îlots CpG. Il existe donc une corrélation entre l'expression des gènes ribosomiques et le niveau d'expression de macroH2A. Pour analyser la distribution de macroH2A sur une fibre de chromatine, nous avons utilisé la technique d'étirement de la chromatine. Nous avons montré que macroH2A co-localise avec la tri-méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 qui est un marqueur de l'hétérochromatine. De plus, la distribution de macroH2A est périodique suggérant un rôle de cette histone dans une organisation particulière de la chromatine. Enfin, nous avons développé au laboratoire un système cellulaire reposant sur l'inhibition de la nucléoline par RNAi dans des cellules HeLa. Les conséquences de l'inhibition de la nucléoline sont multiples : une diminution de la synthèse de l'ARN pré-ribosomique accompagnée d'une perturbation de la structure du nucléole et d'un arrêt du cycle cellulaire en mitose pouvant conduire à l'apoptose. La nucléoline est donc largement impliquée dans la régulation de l'expression des gènes ribosomiques.

La myopathie de Duchenne se caractérise principalement par une forte dégénérescence musculaire, due à l'absence de la dystrophine. La fonction de la dystrophine et les causes de la dégénérescence musculaire qui survient en son absence ne sont pas connues. <br />J'ai combiné des études chez les modèles animaux Cænorhabditis elegans et souris de cette maladie, afin d'essayer d'élucider les mécanismes de la dégénérescence musculaire.<br />Nous avons montré que le canal potassium SLO-1 et l'homologue de la syntrophine, STN-1, sont fonctionnellement reliés à l‘homologue de la dystrophine de C. elegans, DYS-1. Nous avons entrepris le crible du génome entier de C. elegans à la recherche de gènes supprimant la dégénérescence musculaire. Au cours de ce crible, nous avons montré que la voie de la dégradation protéique ainsi que plusieurs protéines kinases sont impliqués dans la dégénérescence musculaire. En parallèle, j'ai participé à la recherche de molécules actives sur la dégénérescence musculaire de C. elegans, puis chez la souris mdx. Nous avons notamment confirmé chez la souris mdx l'effet bénéfique de l'activation de la voie sérotoninergique.

Accurate translation of genetic information necessitates the tuned expression of a large group of genes. Amongst them, controlled expression of the enzymes catalyzing the aminoacylation of tRNAs, the aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS), is essential to insure translational fidelity. Here, it is shown that expression of AspRS is regulated in Saccharomyces cerevisiae by a feedback mechanism, that necessitates the binding of AspRS to its messenger RNA. The correlation between AspRS expression and mRNAAspRS and tRNAAsp concentrations, as well as the presence of AspRS in the nucleus, suggest an original regulation mechanism. It is proposed that the surplus of AspRS, not sequestered by tRNAAsp, is imported in the nucleus where it binds to mRNAAspRS and thus inhibits its accumulation. <br />We have established the folding of the 300-nucleotides long 5' end of mRNAApRS and identified the structural signals involved in the regulation process. We propose that the mRNAAspRS fragment folds in two independent and symmetrically structured domains spaced by two single-stranded connectors. Domain I displays a tRNAAsp anticodon-like stem-loop structure that is restricted in domain II to a short double-stranded helix. The overall mRNA structure, based on enzymatic and chemical probing, support a model where each monomer of yeast AspRS binds one individual domain and recognizes the mRNA structure like it recognizes its cognate tRNAAsp.<br />Finally, the consequences of an increased concentration of AspRS in the cell have been tested. In vitro, high AspRS concentrations lead to mis-aspartylation of tRNAAsn and tRNAGlu. In vivo, the design of a reporter gene conferring an antibiotic resistance, dependent on mischarged tRNAs, did not allow to detect any cross aminoacylation. However, the proteomic analysis of yeasts overexpressing AspRS pointed out the conditions of AspRS accumulation in the cell by detecting the presence of an additional control mechanism at the post-translational level.

L'ADN ou l'ARN, détenteurs de l'information génétique, peuvent subir des dommages dus aux acteurs du stress oxydant ou de l'inflammation. La cellule a développé des mécanismes de réparation de ces dommages, mais certaines lésions peuvent persister et devenir mutagènes. Dans ce but, nous nous sommes intéressés au dosage simultané de plusieurs de ces lésions à l'aide d'une technique de chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en mode tandem, outil analytique rapide et fiable ayant une très grande sensibilité. Le but de ce travail était de trouver des biomarqueurs du stress oxydant ou de l'inflammation parmi les lésions connues de l'ADN et de les quantifier dans les milieux biologiques humains afin de compléter le panel existant de biomarqueurs protéiques ou lipidiques. Ainsi, trois groupes de lésions ont pu être quantifiés : les lésions oxydatives issues de l'action des espèces oxygénées activées, les lésions chlorées issues des phénomènes inflammatoires et les adduits de la peroxydation lipidique. Les étapes de mise au point analytique ayant été optimisées, elles ont été suivies d'une validation biologique parmi différentes pathologies étudiées et représentées par le diabète, certains cancers traités par radiothérapie et les hommes atteints d'infertilité masculine. Les différents résultats montrent une variation des taux des certaines lésions dans les leucocytes circulants ou des l'urine des patients par rapport aux sujets sains. Néanmoins, ces essais nécessitent d'être confirmés quant à l'utilisation des ces lésions en tant que biomarqueurs. D'autres types de pathologies devront également être testés.

Les nématodes à kyste du genre Globodera sont des vers microscopiques, hétérotrophes qui parasitent les racines des plantes essentiellement de la famille des Solanacées. Ces organismes sont des endoparasites obligatoires qui établissent une relation très étroite avec leur plante hôte. Ils peuvent ainsi se nourrir par le biais d'un site nourricier très élaboré. Celui-ci est mis en place grâce à des protéines sécrétées par le nématode, directement injectées dans les cellules végétales grâce à leur stylet (organe de la partie antérieure assimilable à une aiguille creuse). La fonction des protéines du pouvoir pathogènes identifiées est très souvent inconnue. Nous avons étudié la variabilité des gènes codant ces protéines au sein de la famille des nématodes à kyste ainsi que leur mode évolutif. Les gènes du pouvoir pathogène semblent avoir des tempos d'évolution nettement plus rapide que les gènes de ménage et semblent être soumis à des pressions de sélection diversificatrices.