Orientador: Samuel Conceição de Oliveira / Resumo: A determinação da estratégia de controle adequada para bioprocessos batelada e batelada alimentada é uma questão prática importante devido ao alto valor agregado de alguns bioprodutos. Desde que é altamente desejável otimizar a produção de bioprodutos, vários métodos têm sido propostos para esse objetivo. Uma vez dispondo de um modelo matemático adequado para o bioprocesso, o problema de otimização pode ser formulado no âmbito do princípio do máximo de Pontryagin e da teoria de controle ótimo para determinar a melhor trajetória de controle para certas variáveis manipuladas, como temperatura, pH e taxa de alimentação do substrato. Neste estudo, duas aplicações dessas técnicas baseadas em modelos matemáticos para otimizar e controlar bioprocessos de produção de antibióticos são revisadas e novos aspectos são enfatizados. Os casos analisados incluem a otimização da taxa de alimentação de substrato em um reator batelada alimentada e da temperatura em um reator batelada durante fermentações penicilínicas. Os principais resultados obtidos neste estudo foram: (i) a constatação de que métodos numéricos simples (Runge-Kutta, Newton-Raphson) podem ser aplicados para resolver satisfatoriamente os problemas de valor no contorno propostos; (ii) a demonstração de que a operação não isotérmica é mais produtiva em antibiótico do que a operação sob temperatura constante; (iii) a necessidade de adoção de um modelo matemático apropriado para o bioprocesso visando à resolução do problema de cont... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

.Le transport de soluté en présence de biofilms en milieux poreux est un problème rencontré dans de nombreuses applications industrielles (biofiltration des eaux usées et traitement de polluants atmosphériques notamment). En termes de modélisation, l'interaction entre biologie, hydrodynamique et chimie reste difficile à comprendre aux échelles les plus fines: cela a conduit à une large utilisation de modèles macroscopiques, plus simple à manipuler. Cependant, la question consiste à écrire des modèles macroscopiques suffisamment complexes pour prendre en compte les processus pertinents représentant le couplage entre développement de la biomasse et fonctionnement du système, mais suffisamment simple pour une utilisation opérationnelle. Cette thèse s’est focalisée sur certains processus qui régissent le comportement macroscopique de tels systèmes. Nous avons étudié la modélisation de la réduction de la perméabilité induite par le développement du biofilm. Un modèle incorporant deux processus caractéristiques du colmatage (réduction de la taille pores et formation de « plugs ») a été développé. Ce modèle a été évalué pour une large gamme de données expérimentales. Une autre partie porte sur les processus d’adhésion initiale de la biomasse, processus important pour caractériser l’état initial du système. Sous l’hypothèse que les cellules bactériennes peuvent être traitées comme des colloïdes non rigides, une nouvelle corrélation a été développée pour estimer l’efficacité d’attachement des bactéries. Cette corrélation est basée sur l'analyse d'un large éventail de données expérimentales pour des conditions variées en termes d'électrolyte, débit et géométrie des milieux poreux, et introduit de nouveaux paramètres adimensionnels pour représenter les effets couplés des forces de Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), des forces hydrodynamiques et prendre en compte la géométrie des milieux poreux. Ces processus ont été introduits dans un modèle 1D développé pour la simulation numérique du transport de soluté en présence de biofilm dans un milieu poreux. Une autre question importante dans ce modèle était de représenter correctement le processus détachement de biofilm. Un autre trait distinctif de notre modèle est une tentative de rendre compte du processus de «sloughing» dans la modélisation du détachement de biofilm. Le « sloughing » est un processus différent de l'érosion, phénomène continu, et qui correspond à une élimination discrète d'une grande fraction de biofilm.Dans cette étude, le phénomène de « sloughing » a été incorporé séparément etodélisé comme un processus stochastique. Des simulations numériques ont été effectuées en utilisant OpenFoam pour implémenter le modèle. Des simulations avec et sans le terme de « sloughing » ont été effectuées et discutées dans le cadre des données de la littérature disponibles. / Solute transport coupled with biofilm growth in porous media is encountered in many engineered applications, for instance biofiltration of wastewater and air pollutant treatment. In terms of modelling, the interaction between biology, hydrodynamic and chemistry are still difficult to understand at the fine scale: that led to a wide dissemination of macroscopic model, simpler to handle. However, one issue consists in providing a macroscopic model complex enough to take into account the relevant processes accounting for the coupling between the biomass development and system functioning, but simple enough for operational use. This thesis focused on few selected processes that influence the macroscopic behavior of such system. First, we investigated the permeability reduction modeling accounting for biofilm development. A model including two features that result in permeability reduction (pore radius reduction and pore plugging) was developed. This model was assessed in a wide range of experimental data. Another part of the thesis focused on the initial biomass attachment that is an important feature to characterize the system initial state. Following the concept that bacterial cell can be treated as soft colloids, a new correlation equation was developed to estimate the bacteria attachment efficiency. This correlation is based on the regression analysis of a wide range of experimental data of colloid deposition in various electrolyte conditions, flowrates and geometries of porous media. New dimensionless parameters have been introduced to represent the coupled effects of Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO) forces, hydrodynamic forces and to account for geometry of porous media. These features were introduced in a 1D dimensional model that have been developed for the numerical simulation of solute transport coupled with biofilm growth. An important issue in this model was to properly represent biofilm detachment. Another distinctive feature of our model is an attempt to account for the “sloughing” process in modeling biofilm detachment. Sloughing is a different process than erosion which corresponds to a discrete removal of large fraction of biofilm. In this study, biofilm sloughing has been separately accounted in the numerical modeling porous media bioclogging. Biofilm sloughing was considered as a stochastic process and quantified by random generator. So this discrete events could be incorporated into other continuous processes to determine the biomass transfer from biofilm to the liquid phase. Numerical simulations have been performed using OpenFoam to implement the model. Simulation with and without the sloughing term were performed and discussed in the frame of available literature data

Cette thèse a pour cadre le contrôle auto-adaptatif de procédés biologiques et son objectif est de permettre l'application de ce contrôle à une grande variété de problèmes distincts en évitant la phase usuelle de leur modélisation. Les bioprocédés sont des systèmes complexes, hautement dynamiques et parvenir à les contrôler en vue d'obtenir une production définie se révèle une tâche difficile. De plus, les incertitudes liées aux mesures et le manque de connaissances des réactions biologiques précises se déroulant à l'intérieur même du bioprocédé, font que les méthodes usuelles mises en œuvre pour contrôler un bioprocédé particulier doivent être largement re-calibrées dès qu'il s'agit d'adapter ce contrôle à un bioprocédé différent. L'apport de cette thèse est de proposer une approche informatique de cette problématique, centrée sur l'utilisation de Systèmes Multi-Agents Adaptatifs (AMAS). Les propriétés auto-organisatrices de tels systèmes, ainsi que leur conception centrée sur les comportements locaux, permettent d'appréhender la complexité des procédés biologiques et de fournir un système apte à leur contrôle sans nécessiter d'informations détaillées sur ceux-ci, tout en étant capable de s'adapter à leurs dynamiques. Deux systèmes multi-agents adaptatifs distincts, répondant chacun à un ensemble de contraintes différentes, ont permis d'étudier la faisabilité et l'apport de cette approche au domaine du contrôle de procédés. L'aboutissement est un modèle AMAS générique qui est associé à chaque variable contrôlable du procédé afin d'apprendre et de déterminer les actions de contrôle pour atteindre les objectifs définis par l'utilisateur. Les agents observent en temps réel l'évolution des variables du procédé pour en extraire les informations nécessaires à son contrôle. Le système de contrôle établit alors une contextualisation des contrôles à appliquer qui devient indépendante de la connaissance du bioprocédé. Ce contrôle auto-adaptatif a été évalué sur un ensemble de problèmes de contrôle de systèmes dynamiques, notamment celui d'un bioprocédé simulé, et les résultats obtenus sont analysés dans ce mémoire / This work aims at creating a self-adaptive approach to control bioprocesses while still being generic enough to be applied on a wide range of problems without relying on their modeling. Bioprocesses are complex and highly dynamic systems, and controlling them to reach a user-defined objective is a difficult task. Furthermore, the limited amount of available measures and the lack of a precise biological knowledge of what is happening inside the bioprocess lead usual control approaches to be recalibrated before being applied on a different bioprocess. The benefit of this work is a computer-based approach relying on the Adaptive Multi-Agent Systems (AMAS) theory. The objectives of adaptability and genericity are reached thanks to the self-organization of such systems and their design focusing on the local behavior of the agents, dealing with the complexity of such a problem without needing an extensive amount of information on the system to control.Two distinct multi-agent systems, defined by a specific set of constraints, were created to study the feasibility and benefits of such an approach. The outcome is a generic AMAS model, associated with each controllable variable, which learns the actions to apply in order to fulfill user-defined objectives. Agents observe in real-time the evolution of the variables and extract the information needed to control the target system. The AMAS is then able to contextualize the control without modeling the behavior of the system to control itself.This self-adaptive control was evaluated on a set of problems involving the control of dynamic systems, such as bioprocesses, and the associated results are analyzed

Os fungos filamentosos são utilizados em larga escala na produção de produtos biotecnológicos na indústria devido a sua versatilidade e um dos exemplos são as peptidases que representam uma das principais classes de enzimas hidrolíticas. As peptidases são hidrolases que catalisam a quebra das ligações peptídicas das proteínas e que nos microrganismos são responsáveis por funções fisiológicas e patológicas, além de ter muitas aplicações em diversos campos industriais. Neste estudo foram analisados diferentes bioprocessos fermentativos para produção de peptidases pelo fungo Aspergillus terreus. Este microrganismo foi capaz de produzir peptidases em ambos os bioprocessos, sólido ou submerso, obtendo melhor performance e o pico de produção no bioprocesso fermentativo sólido de valor 677U/mL, nas condições 5g de farelo de trigo, 72 horas, 30°C e 75% de umidade. Utilizando o bioprocesso fermentativo submerso também obtivemos resultados satisfatórios com pico de atividade de 360U/mL, nas condições de meio padrão suplementado com Caseína 0,5%, 72 horas e 35°C. A caracterização bioquímica parcial dos extratos dos dois bioprocessos mostrou semelhanças entre algumas características das enzimas produzidas como a faixa extensa de pH ótimo abrangendo regiões ácidas, neutra e alcalinas, temperatura ótima pontual de 55°C e perfil de inibição pelo PMSF e EDTA. Contudo, os perfis de estabilidade (pH e temperatura) e comportamento frente a adição de íons apresentaram respostas diferentes entre si, o que sugere a produção de enzimas diferentes produzidas pelo mesmo fungo em meios distintos. A microencapsulação por Spray Drying como processo de estabilização foi satisfatória obtendo rendimentos de 37,5-58,2% e com níveis acima de 50% de atividade enzimática. Em contrapartida, a imobilização enzimática demonstrou ser eficaz na etapa de ligação ao suporte, mas não foi capaz de estabilizar a enzima presente no extrato, o que ficou caracterizado pela perda de atividade proteolítica. / Filamentous fungi are extensively used in the production of biotechnological products in industry because of their versatility and one of the examples are peptidases which constitute a major class of hydrolytic enzymes. The peptidases are hydrolases which catalyze the cleavage of peptide bonds of proteins and microorganisms that are responsible for the physiological and pathological roles, in addition to having many applications in various industrial fields. This study evaluated various bioprocesses for fermentative production of peptidases by the fungus Aspergillus terreus. This microorganism was able to produce peptidase in both bioprocess, solid or submerged, achieving better performance in the solid bioprocess with peak of production of 677U/mL under the conditions 5g wheat bran, 72 hours, 30°C and 75% humidity . Using submerged fermentation bioprocess we also obtained satisfactory results with peak of activity of 360U/mL with conditions of standard medium supplemented with 0.5% casein, 72 hours and 35°C. Biochemical characterization of the two partial purified extracts showed similarities between some characteristics of the enzymes produced, as large optimum pH range spanning regions acidic, neutral and alkaline point temperature optimum of 55 ° C and the inhibition profile of PMSF and EDTA. However, the stability profiles (pH and temperature) and behavior in addition ions showed different responses to each extract, which suggests the production of different enzymes in different ways. Microencapsulation by Spray Drying and stabilization process was obtaining satisfactory yields of 37.5 to 58.2%, with levels above 50% of enzyme activity. In contrast, the enzyme immobilization step was effective in bonding the support, but was not able to stabilize the enzyme present in the extract, which was characterized by the loss of proteolytic activity

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The production of a bioherbicida for the biological control of weeds requires the development of a series of steps ranging from the selection of a suitable microbial strain for the production of product having herbicidal action until final formulation. Thus, this study aimed to select microorganisms from biological resources of the Pampa biome with potential for producing phytotoxins. Systematic samplings were performed with infectious symptoms in rice-growing areas and natural pastures of the Pampa biome. The first stage of the research was to select isolates with pathogenic potential inhibition test plants seedlings (Cucumis sativus L. var wisconsin.). The fungus that showed the best inhibitory effect was the VP51, identified through the use of molecular biology techniques, classified as Diaporthe sp. For optimization studies by means of submerged fermentation, industrial waste corn steep liquor were used (AMM) and sorghum (MAS), compared to synthetic medium. The means of submerged fermentation industry (AMM) showed better growth of fungal biomass and effect on test plant germination. In submerged fermentation bioreactor STR type, the rotation effect is significant, and the best results were obtained in tests with less rotation. In the pre-germination tests plants dormant and hard seeds were recorded, with a satisfactory result as biocontrol potential germination. / A produção de um bioherbicida para o controle biológico de plantas daninhas requer o desenvolvimento de uma série de etapas que vão desde a seleção de uma cepa microbiana apropriada para a produção do produto com ação herbicida até a sua formulação final. Nesse sentido, esse trabalho teve como objetivo selecionar micro-organismos a partir dos recursos biológicos do bioma Pampa com potencial na produção de fitotoxinas. Foram realizadas coletas sistemáticas de plantas com sintomas infecciosos em áreas de cultivo de arroz irrigado e pastagens naturais do bioma Pampa. A primeira etapa da pesquisa foi selecionar isolados fitopatogênicos com potencial de inibição de plântulas de plantas-teste (Cucumis sativus L. var wisconsin.). O fungo que apresentou o melhor efeito inibitório foi o VP51, identificado através do uso de técnicas de biologia molecular, classificado como Diaporthe sp. Para estudos de otimização do meio de fermentação submersa, foram utilizados resíduos industriais de água de maceração de milho (AMM) e de sorgo (MAS), comparando com o meio sintético. O meio de fermentação submersa em meio industrial (AMM) apresentou melhor crescimento de biomassa fúngica e efeito na germinação de plantas-teste. Na fermentação submersa em biorreator do tipo STR, o efeito da agitação foi significativo, sendo que os melhores resultados foram obtidos nos ensaios com menor agitação. Na germinação das plantas testes foram registradas sementes dormentes e duras, sendo um resultado satisfatório como potencial biocontrole da germinação.

Use of tubular anaerobic digesters to treat livestock waste in developing countries has energy, agricultural, health, social and environmental benefits. However, careful use of digester effluent as a soil amendment is required due to the potential presence of protozoan parasites Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia. This research investigated the performance of four tubular digesters in the Monteverde region of Costa Rica. High (>75%) volatile solids and BOD5 removal efficiencies were observed, which was attributed to the formation of a biologically active floccular sludge layer. Computational fluid dynamics (CFD) and bioprocess models were developed to evaluate the transport and transformation mechanisms in the digesters. The CFD model estimated a mean liquid hydraulic residence time (HRT) of 23 days and the bioprocess model estimated an average mean cell residence time (MCRT) of 115 days. Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia inactivation studies were performed in the laboratory under conditions similar to the environmental conditions observed in the field tubular digesters. The environmental conditions included: ambient temperatures (21-24°C), neutral pH and total ammonia nitrogen (TAN) concentrations below 250 mg NH4+-N/L. Inactivation rate constants for Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia were 0.056 and 0.726 day-1, respectively. An (oo)cysts solid-liquid phase distribution study indicated that 70% of both (oo)cysts adhered to biosolids. A tubular digester model was used to estimate the concentration of viable (oo)cysts in the digester effluents. (Oo)cysts adhesion to solids, total solids concentration in the digester and HRT were the main factors contributing to the modeled effluent concentration of viable (oo)cysts. Since the model predicted presence of viable (oo)cysts in the tubular digester effluent, a quantitative microbial risk assessment (QMRA) model was developed to estimate the risk of infection from exposure to raw livestock waste and tubular digester effluents in two rural communities in Costa Rica. The risk of infection from Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia was assessed for occupational and public exposure pathways; fomite and soil contamination and crop contamination from runoff. Results from the QMRA indicated that the concentration of (oo)cysts in the raw livestock waste, inactivation rates at the various exposure pathways and the treatment of livestock waste were the main contributing factors to the risk of infection. This research indicated that treatment of livestock waste in tubular digesters significantly decreased the risk of infection to below WHO’s acceptable individual annual risk of infection (10-4). This is the first study to combine mathematical modeling with field studies to determine the physical and biological processes in tubular digesters. This is also the first study to combine mathematical models with field and laboratory studies to determine the concentration of (oo)cysts in tubular digester effluents and to predict the risk of infection from Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia if tubular digester effluent is used as a soil amendment.

Tesis por compendio / [ES] El aprovechamiento de subproductos para producir biocombustibles, energía y compuestos químicos básicos es cada vez más necesario en la situación actual de escasez de petróleo y preocupación por el medioambiente. Muchos compuestos que tradicionalmente han sido producidos a partir del petróleo pueden sintetizarse hoy día de forma biotecnológica empleando recursos renovables. En este contexto, los microorganismos pueden aprovecharse eficazmente como biocatalizadores para llevar a cabo estas transformaciones. Con este tipo de procesos se pueden aprovechar residuos o materias primas renovables para la obtención de productos de interés como bioplásticos de origen microbiano o productos químicos que pueden servir como monómeros para la síntesis de plásticos biodegradables u otro tipo de aplicaciones. La contaminación ambiental causada por los residuos de polímeros sintéticos no biodegradables es un problema en aumento debido a la estabilidad de los compuestos derivados de los combustibles fósiles. En contraste, los bioplásticos pueden obtenerse de fuentes renovables, lo que posibilita el desarrollo de procesos de producción sostenible. En este trabajo de investigación se han estudiado y desarrollado bioprocesos para la producción de polihidroxialkanoatos, 2,3-butanodiol y ácido D-láctico de forma sostenible empleando materias primas renovables como el suero lácteo de quesería, aceite de camelina, glicerina, fracción orgánica de residuos urbanos y residuos de naranja. La caracterización de las materias primas de partida se realizó mediante técnicas de análisis composicional, análisis en HPLC, cromatografía de gases y técnicas espectrofotométricas. Con estos resultados se hizo una selección de cepas bacterianas capaces de sintetizar los productos de interés a partir de los sustratos seleccionados. Una vez seleccionadas las cepas, el trabajo se centró en el desarrollo de los procesos para conseguir buenos rendimientos de fermentación y su escalado. Por lo tanto, este trabajo de investigación aporta conocimientos sobre la identificación y selección de biocatalizadores industriales para el uso de materias primas renovables y residuos industriales para la producción de productos químicos y polímeros de base biológica. Estos estudios allanan el camino para el futuro desarrollo de procesos biotecnológicos sostenibles en el marco de las biorrefinerías y de la bioeconomía circular. / [CA] L'aprofitament de bioproductes per produir biocombustibles, energia i compostos químics bàsics és cada vegada més necessari en la situació actual d'escassetat de petroli i preocupació pel medi ambient. Molts compostos que tradicionalment s'han produït a partir de petroli es poden sintetitzar hui en dia biotecnològicament utilitzant recursos renovables. En aquest context, els microorganismes es poden utilitzar eficaçment com a biocatalitzadors per dur a terme aquestes transformacions. Amb aquest tipus de processos es poden utilitzar residus o matèries primeres renovables per obtenir productes d'interès com bioplàstics d'origen microbià o químics que puguen servir de monòmers per a la síntesi de plàstics biodegradables o altres aplicacions. La contaminació ambiental causada per residus de polímers sintètics no biodegradables és un problema creixent a causa de l'estabilitat dels compostos de combustibles fòssils. Per contra, els bioplàstics es poden obtenir a partir de fonts renovables, permetent el desenvolupament de processos productius sostenibles. En aquest treball de recerca s'han estudiat i desenvolupat bioprocessos per a la producció de polihidroxialcanoats, 2,3-butanodiol i àcid D-làctic de manera sostenible utilitzant matèries primeres renovables com sèrum de llet, oli de camelina, glicerina, fracció orgànica de residus urbans i residus de taronges. La caracterització de matèries primeres inicials es realitza mitjançant tècniques d'anàlisi composicional, anàlisi HPLC, cromatografia de gasos i tècniques espectrofotomètriques. Amb aquests resultats es crea una selecció de soques bacterianes capaç de sintetitzar els productes d'interès dels substrats seleccionats. Una vegada seleccionades les soques, el treball es va centrar en el desenvolupament dels processos per aconseguir uns bons rendiments de fermentació i el seu escalat. Per tant, aquest treball de recerca aporta coneixements sobre la identificació i selecció de biocatalitzadors industrials per a l'ús de matèries primeres renovables i residus industrials per a la producció de productes químics i polímers de base biològica. Aquests estudis amplien el coneixement per al futur desenvolupament de processos biotecnològics sostenibles en el marc de la biorefineria i la bioeconomia circular. / [EN] The use of by-products to produce biofuels, energy and basic chemicals is increasingly necessary in the current situation of oil shortages and environmental concern. Many compounds that have traditionally been produced from oil can now be synthesised in a biotechnological way using renewable resources. In this context, microorganisms can be effectively used as biocatalysts to carry out these transformations. With this type of process, waste streams or renewable raw materials can be used to obtain products of interest such as bioplastics of microbial origin or chemical products that can serve as monomers for the synthesis of biodegradable plastics or other types of applications. Environmental pollution caused by non-biodegradable synthetic polymer waste is a growing problem due to the stability of compounds derived from fossil fuels. In contrast, bioplastics can be obtained from renewable sources, which enables the development of sustainable production processes. In this research work, bioprocesses for the production of polyhydroxyalkanoates, 2,3-butanediol and D-lactic acid using renewable raw materials such as cheese whey, camelina oil, glycerine, organic waste and orange waste were studied and developed. The characterisation of the raw materials was carried out using compositional analysis, HPLC analysis, gas chromatography and spectrophotometric techniques, among others. With these results, a selection of bacterial strains capable of synthesising the products of interest from the selected substrates was made. Once the strains were selected, the work was focused on process development in order to optimize fermentation yields and scale-up. Therefore, this research work provides knowledge on the identification and selection of industrial biocatalysts for the use of renewable feedstocks and industrial wastes for the production of bio-based chemicals and polymers. These studies pave the way for further development of sustainable biotechnological processes in the framework of biorefineries and circular bioeconomy. / Bustamante Jaramillo, DA. (2021). Production of Bio-Based Chemicals and Polymers from Renewable Feedstocks: Bioprocesses Development [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/175819 / TESIS / Compendio

Mikroalgen bieten eine hohe Variation unterschiedlichster Wertstoffe. Hochwertige Lipide, wie Omega-3- Fettsäuren, oder Antioxidantien, wie Astaxanthin und Phycocyanin, werden schon heute in großen Mengen aus Mikroalgen gewonnen. Um diese und weitere Stoffe auf dem europäischen Markt anbieten zu können, sind unterschiedliche Normen und Regelungen zu beachten. Die Einhaltung von Normen und Regelungen wird mit Zertifizierungen bestätigt. Dieser Praxisleitfaden bietet einen ersten Einstieg für alle, die in das Feld der zertifizierten Mikroalgenproduktion eintreten wollen. Er gibt einen Überblick über geltende Regelungen verschiedener Ziel-Märkte und damit verbundene Maßnahmen der Qualitätssicherung. Weiterhin werden detaillierte Checklisten sowie Muster für Standardarbeitsanweisungen und Prozessbeschreibungen (via Prozess-Turtle) zur Verfügung gestellt.:Kurzinformationen Einführung Unternehmensorganisation und Qualitätsmanagement Absatzmärkte, Normen und Verordnungen für Herstellung und Vertrieb von Mikroalgen Ausgewählte Vorschriften für zertifizierte Mikroalgenproduktion Handlungsempfehlung für die Erfüllung von GMP-Anforderungen Typische Standardarbeitsanweisungen Planung von Audits Zusammenfassung

Dans le but d'évaluer la possibilité de mise en place une ingénierie écologique des processus microbiens de la digestion anaérobie dans les bioprocédés, différents leviers environnementaux ont été appliqués à des digesteurs de cellulose. Le premier levier étudié, de nature physico-chimique, était la température. Le deuxième faisait appel à une adaptation préalable d'une biomasse complexe par incubation avec des molécules simples avant mise en présence de cellulose. Le dernier consistait en la co-inoculation de diverses biomasses exogènes avec une boue anaérobie. Les conséquences des perturbations apportées par ces leviers sur les dynamiques métaboliques et écologiques de bioréacteurs anaérobies dégradant de la cellulose ont été évaluées. Différents indicateurs physico-chimiques ont été utilisés pour caractériser la dégradation de la cellulose (production de molécules intermédiaires, production de gaz, etc.). Les outils de la biologie moléculaire ont permis de caractériser les dynamiques microbiennes à l'échelle des communautés (par fingerprinting ARISA) ou des individus (par pyroséquençage de l'ADNr 16S). L'utilisation d'isotopes stables (cellulose marquée 13C), a permis de réaliser un traçage précis des flux de matières (intermédiaires de dégradation de la cellulose enrichis en 13C) et des microorganismes impliqués dans la chaîne de dégradation de la cellulose (groupes microbiens fonctionnels identifiés par la technique de « stable isotope probing »). Les expériences de changements de température ont montrél'influence importante de ce paramètre sur les communautés microbiennes, en particulier les archées. Elles ont mis en évidence le caractère asymétrique de l'effet de la température sur les communautés microbiennes et les conséquences irréversibles du passage par les conditions thermophiles. Ces propriétés ouvrent des perspectives intéressantes pour exploiter les chocs de température afin de modifier les propriétés de la biomasse. L'expérience de fonctionnalisation de la biomasse à l'aide de quatre molécules simples (acide propionique, acide butyrique, glucose et cellobiose) montre qu'un modelage des populations microbiennes par préadaptation est possible. Une fois en contact avec la cellulose, les biomasses fonctionnalisées génèrent des schémas de dégradation et des structures de communautés qui se répartissent de manière inattendue en deux catégories seulement. Ce résultat suggère qu'il est possible d'orienter les états d'équilibre d'une communauté microbienne complexe par préadaptation fonctionnelle. Enfin, des expériences de co-inoculation ont mis en avant la difficulté d'exploiter directement les propriétés enzymatiques de flores cellulolytiques performantes mais également les possibilités de modifier les équilibres de diversité au sein de la biomasse du bioprocédé. Ces expériences suggèrent qu'un paramètre tel que la diversité de la communauté d'un bioprocédé pourrait être manipulé par bioaugmentation. Ce travail démontre que nous disposons d'ores et déjà d'un certain nombre d'outils pour élaborer une ingénierie écologique des bioprocédés à travers une nouvelle démarche de gestion qui se place à l'échelle de l'écosystème microbien et des services associés. / In order to evaluate the possibility of establishing an ecological engineering of microbial processes of anaerobic digestion in bioprocesses, different environmental levers were applied to cellulose digesters. The first lever studied was temperature. The second involved preadaptation of a complex biomass by incubation with simple molecules, before addition of cellulose. The third lever consisted in co-inoculating various exogenous biomasses with anaerobic sludge. The consequences of these levers on metabolic and ecological dynamics of cellulose-degrading anaerobic bioreactors were evaluated. Different physicochemical indicators were used to characterize cellulose degradation (intermediate production, gas production, etc.). Molecular biology tools enabled the characterization of microbial dynamics at the community level (ARISA fingerprinting) or individual level (16S rDNA pyrosequencing ). The use of stable isotopes (13C-labeled cellulose) enabled the accurate tracing of both material flows (13C enriched cellulose intermediates) and microorganisms involved in the cellulose degradation chain (functional microbial groups were identified by "stable isotope probing" technique). Temperature changes showed the significant influence of this parameter on microbial communities, especially Archaea. The asymmetric nature of temperature effect on microbial communities, and the irreversible consequences of incubation in thermophilic conditions were highlighted. These properties open interesting perspectives for the use of temperature shocks to modify biomass properties. A biomass functionalization experiment was performed with simple molecules (propionic acid, butyric acid, glucose and cellobiose). It showed that shaping microbial communities through substrate adaptation was possible. Once in contact with the cellulose, functionalized biomasses generated patterns and structures of degradation communities who unexpectedly formed two categories only. This result suggests that it is possible to direct the equilibrium states of a complex microbial community by functional preadaptation. Finally, co-inoculation experiments highlighted the difficulty of directly exploiting the enzymatic properties of efficient cellulolytic flora. But, they also highlighted the possibility of changing biomass diversity balance in bioprocesses. Thus these experiments suggest that a parameter such as community diversity can be manipulated by bioaugmentation in bioprocesses. This work demonstrates that several tools are available to develop an ecological engineering of bioprocesses, through a new management approach at the microbial ecosystem (and related services) level.

Les bioprocédés industriels mettant en œuvre la culture de cellules animales sont devenus incontournables pour la production d’anticorps monoclonaux (AcM). Cependant, l'état physiologique des cellules et la qualité des AcM produits, en particulier leur glycosylation, sont tributaires des variations intervenant au cours du procédé. Il en découle des risques d'altération de l'efficacité et de la sûreté des AcM. C'est pourquoi, depuis quelques années, l'initiative Process Analytical Technology (PAT) encourage le développement du suivi en ligne de ces procédés, avec l'objectif de mieux les maîtriser et d'assurer la qualité finale des produits. Dans ce contexte, cette thèse propose des approches innovantes pour le suivi en ligne de procédés de culture de cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) en bioréacteur, basées sur l'utilisation de trois types de spectroscopies in situ (diélectrique, Raman, proche infrarouge(NIR)). Le premier chapitre présente une nouvelle démarche permettant de prédire en temps réel l'état physiologique des cellules, au travers de la vitesse spécifique de croissance cellulaire (μ). A partir de la mesure en ligne de la permittivité grâce à la spectroscopie diélectrique, la µ a été calculée en temps réel, permettant de détecter le moment critique correspondant au moment où μ diminue. Comparée à une démarche hors ligne, l'utilisation de cette méthode pour le pilotage de cultures en mode recharge-récolte, permet d’assurer à la fois la quantité et la qualité de glycosylation des AcM. Le second chapitre aborde l'utilisation des spectroscopies NIR et Raman in situ combinées à des méthodes chimiométriques. Les performances de ces deux spectroscopies ont été comparées en parallèle. Des modèles en ligne ont été développés pour prédire la concentration de différents paramètres (cellules viables, glucose, lactate, glutamine, ions ammonium, anticorps). L'évaluation de ces modèles par facteurs de mérite (FOM), a révélé certains avantages de la spectroscopie Raman. La combinaison de ces deux spectroscopies par diverses stratégies de fusion de données a été également évaluée. Dans le troisième chapitre, l'intérêt de la spectroscopie Raman a été démontré pour le suivi en ligne, non seulement, de la concentration, mais aussi, de la glycosylation des AcM. Des modèles ont été développés pour la prédiction en ligne, à la fois, de la macro-hétérogénéité (sites de glycosylation), et de la micro-hétérogénéité (structures glycanniques) de la glycosylation des AcM dans le cas de cultures en mode discontinu et recharge-récolte. Le dernier chapitre a utilisé les spectroscopies NIR et diélectrique, en les intégrant à un « capteur logiciel » combinant des équations de bilans de matière. Ce « capteur logiciel », mis en œuvre au cours d'une culture en mode semi-continu pour le contrôle automatique du débit d'alimentation, a conduit à une augmentation de la productivité du procédé ainsi qu'à une meilleure glycosylation des AcM produits / Bioprocesses of mammalian cell culture have become essential for the production of therapeutic recombinant proteins, such as monoclonal antibodies (mAb). However, the physiological state of the cells and the quality of the mAb produced, in particular their glycosylation, may vary during the process, and may lead to the alteration of the safety and efficacy of the final product. Consequently, the Process Analytical Technology (PAT) initiative has encouraged the development of online monitoring techniques, with the aim to better control the process and ensure the quality of the final product. In this context, this thesis proposes innovative approaches for online monitoring of CHO (Chinese Hamster Ovary) cells bioreactor cultures, by using three types of in situ spectroscopic measurements (dielectric, Raman, near infrared (NIR)). The first chapter presents a novel approach to predict in real-time one of the major cell physiological state parameters, the specific growth rate (µ). Based on online permittivity measured by in situ dielectric spectroscopy, the cell concentration was estimated and µ was calculated in real-time, making possible to detect the critical moment when µ begins to decrease significantly. Compared to an offline approach, this online approach allowed to maintain the cells in a stable physiological state, ensuring the glycosylation of the mAb produced in feed-harvest cultures. The second chapter shows the use of in situ NIR and Raman spectroscopies combined with chemometric methods. For the first time, the performances of these two spectroscopies were compared in parallel in the same cultures. Online models were developed to predict in real-time the concentration of different parameters (viable cells, glucose, lactate, glutamine, ammonium ions and antibodies). The evaluation of these models by the multivariate Figures of Merit (FOM) revealed some of the advantages of Raman spectroscopy. The combination of the two spectroscopies by various data fusion strategies has also been evaluated. In the third chapter, the interest of Raman spectroscopy for the online monitoring of both the quantity and the glycosylation of the mAb was demonstrated. Models were developed for online prediction of both macroheterogeneity (glycosylation site occupancy) and microheterogeneity (glycan structures) of mAb glycosylation in batch and feed-harvest cultures. The last chapter used models previously developed for NIR and dielectric spectroscopies, to integrate into a “soft sensor” by combining with cell metabolic and mass balance equations. This “soft sensor”, implemented in a fed-batch cell culture for the automatic control of the feed rate, leads to an increased mAb productivity and better mAb glycosylation