En aquest estudi hem trobat que FLRT3 (Fibronectin Leucine-Rich Transmembrane protein) interacciona amb el receptor de Slit, Robo1, de forma independent lligand. En cèl•lules HEK293T hem vist que FLRT3 i Robo1 interaccionen mitjançant els seus dominis intracel•lulars, que la co-expressió de FLRT3 amb Robo1 indueix el processament del receptor i que FLRT3 interacciona amb el fragment intracel•lular generat amb major afinitat i el segresta a la membrana. En presència de Slit, es produeix un increment en el processament de Robo1 i el fragment intracel•lular generat és captat per FLRT3. La interacció entre FLRT3-Robo1 i entre FLRT3-Robo1ICD es dóna en neurones talàmiques rostrals a E13.5. Slit indueix el processament de Robo1 per metaloproteases en aquestes neurones i FLRT3 captura el fragment generat. La interacció FLRT3-Robo1 i l'activació de ROCK són necessàries per la correcta guia axonal dels axons talamocorticals rostrals. FLRT3 regula directament i de forma negativa la senyalització repulsiva Slit/Robo i indirectament promou la senyalització atractiva Netrin/DCC / En este estudio hemos encontrado que FLRT3 (Fibronectin Leucine-Rich Transmembrane protein) interacciona con el receptor de Slit, Robo1, de forma independiente de ligando. En células HEK293T hemos visto que FLRT3 y Robo1 interaccionan mediante sus dominios intracelulares, que la co-expresión de FLRT3 con Robo1 induce el procesamiento del receptor y que FLRT3 interacciona con el fragmento intracelular generado con mayor afinidad y lo secuestra en la membrana. En presencia de Slit, se produce un incremento en el procesamiento de Robo1 y el fragmento intracelular generado es captado por FLRT3. La interacción entre FLRT3-Robo1 y entre FLRT3-Robo1ICD tiene lugar en neuronas talámicas rostrales a E13.5. Slit induce el procesamiento de Robo1 por metaloproteasas en estas neuronas y FLRT3 captura el fragmento generado. La interacción FLRT3-Robo1 i la activación de ROCK son necesarias para la correcta guía axonal de los axones talamocorticales rostrales. FLRT3 regula directamente y de forma negativa la señalización repulsiva Slit/Robo y indirectamente promueve la señalización atractiva Netrin/DCC. / In this study we have found that FLRT3 (Fibronectin Leucine-Rich Transmembrane protein) interacts with the Slit receptor Robo1 ligand- independently. In HEK293T cells we have found that FLRT3 and Robo1 interact throught their intracellular domains, that the co-expression of FLRT3 with Robo1 triggers the shedding of the receptor and that FLRT3 interacts with the intracellular fragment generated with higher affinity and keeps it in the plasma membrane. The presence of Slit produces an increase in the shedding of Robo1 and the intracellular fragment that is generated is catched by FLRT3. The interaction between FLRT3-Robo1 and between FLRT3-Robo1ICD takes place in rostral thalamic neurons at E13.5. Slit triggers Robo1 shedding by metalloproteases in these neurons and FLRT3 catches the intracellular fragment generated. The interaction FLRT3-Robo1 and the activation of ROCK are necessary for the proper guidance of the rostral talamocortical axons. FLRT3 regulates directly and negatively the Slit/Robo repulsive signaling and indirectly promotes the Netrin/DCC attractive signaling

El eje central de esta tesis ha sido el estudio de los efectos que ejercen el género, la localización anatómica del depósito y la situación fisiológica u hormonal sobre la capacidad lipolítica del TAB. En ratas control, la capacidad lipolítica es superior en el depósito gonadal (visceral) que en el inguinal (subcutáneo). La gestación provoca en el TAB una disminución de los niveles de los distintos elementos de la cascada lipolítica, aunque con diferencias entre depósitos, que podrían determinar su papel durante la gestación. En su conjunto, los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis permiten establecer la existencia de claras diferencias en las capacidades lipolíticas del tejido adiposo entre depósitos con distinta localización anatómica, así como entre géneros, tanto en una situación control, como en respuesta a la sobrealimentación, y en la gestación, pudiendo jugar el entorno hormonal un papel clave en estas diferencias. / The general aim of this thesis was to study the effects of gender, anatomical tissue location and the physiological or hormonal status on WAT lipolytic capacity. In control rats, the lipolytic capacity is higher in gonadal (visceral) than in inguinal WAT (subcutaneous). Pregnancy leads to a decrease in the levels of the different elements of the lipolytic pathway in WAT, although with some differences between the depots, which could determine their role during pregnancy. In conclusion, the results reported in this thesis establish the existence of clear differences in WAT lipolytic capacity between fat depots from different anatomical locations, as well as between genders, both in a control situation and in response to overfeeding, and in pregnancy; differences in which the hormonal milieu could play a key role.

La melanogénesis es la ruta responsable de la biosíntesis de melaninas. Tirosinasa, la enzima limitante, presenta una alta homología con otras metaloenzimas implicadas, pero capacidades catalíticas diferentes (entre ellas y entre especies). Se han estudiado las relaciones estructura-función de estas proteínas. Las conclusiones más importantes han sido:-En humanos, tirosinasa es la enzima responsable de la actividad DHICA oxidasa de la ruta, en oposición a la enzima de ratón.-Se ha caracterizado el papel de dos importantes aminoácidos del centro activo de tirosinasa de ratón: His390 como tercer ligando del cobre en una región de unión a metal e His389 como responsable de la interacción enantioespecífica enzima-difenoles, pero no con monofenoles, introduciendo relevantes aportaciones al mecanismo del ciclo catalítico de tirosinasa.-La unión del cobre es un evento posterior en la maduración post-traduccional de la enzima, que además presenta dos sitios de glicosilación cuya ocupación es dependientes de conformación. / Melanogenesis is the biochemical pathway responsible for melanin synthesis. Tyrosinase, the rate-limiting enzyme, shows high homology with other metalloenzymes involved. However, they differ in their enzymatic capabilities (also among species). In our attempt to characterize the structure-function relationships in mammalian melanogenic enzymes, we showed that:-In human, tyrosinase accounts for the DHICA oxidase activity prior to melanin formation, while the murine enzyme is unable to catalyze DHICA consumption.-Two important residues in the active site of the protein have been characterized: His390 as the third copper ligand in the metal-binding region and His389 as the amino acid responsible for the stereospecific interaction enzyme-diphenolic substrates, but not monophenols. This conclusion allowed for the modification of several aspects of the classical catalytic mechanism of the enzyme.-Neither glycosylation of all the potential sequons nor copper binding are sine qua non requirements for maturation of tyrosinase and processing beyond the endoplasmic reticulum.

La vitamina D ha estat durant molt de temps coneguda pel seu important paper en laregulacio dels nivells de calci i fosfor, i en la mineralitzacio de l'os. Els efectes biologics de laforma hormonalment activa de vitamina D (1,25(OH)2D3, o calcitriol) estan mediats per launio al receptor de vitamina D (VDR), que alhora actua sobre els elements de respostaespecifics (VDRE) en el promotor dels gens diana de vitamina D, modificant-ne l'expressio.En les ultimes decades, s'ha demostrat que el VDR no solament es present en les dianesclassiques de la vitamina D com els ossos, els ronyons i l'intesti, sino tambe en molts altresteixits, com els musculs esqueletics, llisos, i cardiacs, i tambe en el cervell, la pell i el fetge.A mes del control de l'homeostasi mineral, la vitamina D exerceix accions pleiotropiques endiferents tipus cel.lulars, influint en processos fisiologics importants com la proliferacio, ladiferenciacio cel.lular, la resposta immune, aixi com tambe en les diferents condicionspatologiques: el cancer, les malalties cardiovasculars, metaboliques i autoimmunes. A mes,juntament amb els seus efectes endocrins, la vitamina D te funcions importantsautocrines/paracrines. En les cel.lules de muscul llis vascular (CMLV), la vitamina D regula laproliferacio i la calcificacio, aquests dos processos, juntament amb la senescencia de lesCMLV es produeixen durant el proces aterosclerotic. Per poder-se dividir, les CMLVnecessiten l'energia de l'ATP produida per les mitocondries. Les alteracions de la funciomitocondrial estan relacionades amb una major produccio de radicals lliures. A la paretarterial, l'angiotensina II (Ang II) actua com un potent mediador d'estres oxidatiu, provocantsenescencia prematura induida per l'estres (SIPS). Els nivells d'Ang II son controlats per larenina, l'expressio de la qual es regulada per la vitamina D. Per tant, un defecte en lasenyalitzacio de la vitamina D pot conduir a un augment en els nivells d'Ang II i produir elsseus efectes adversos en la paret de l'arteria.Quan es van cultivar les CMLV, obtingudes de ratolins knockout per VDR (VDRKO) esva trobar un augment en la produccio d'Ang II en el medi de cultiu d'aquestes cel.lules encomparacio amb el tipus salvatge (WT), que estava d'acord amb la major activacio delsistema renina-angiotensina a nivell sistemic, que es va trobar en els ratolins mutants deVDR. D'una banda, una disminucio en les taxes de proliferacio de les CMLV VDRKO es vatrobar in vitro i in vivo. Aquest descens va ser en paral.lel a un augment en el volumcel.lular. En estat de repos, les cel.lules VDRKO presentaven un augment significatiu del'expressio de p57Kip2 juntament amb els nivells elevats de p19Arf, p21Cip1 i p27Kip1, i nivellsinferiors de PRB fosforilada, ciclines D i E, i axi es preve la seva proliferacio. A mes, lescel.lules VDRKO van mostrar un augment en l'expressio de la catepsina D, un enzim ambactivitat com renina, i del receptor d'Ang II tipus 1. A mes, la produccio d'anio superoxid vaser major en les cel.lules mutants, i va ser inhibida tant amb losartan com amb DPI. D'altrabanda, les cel.lules VDRKO presenten una disminucio significativa en l'expressio de l'enzimmitocondrial antioxidant, la superoxid dismutasa de manganes (SOD2) i l'oxid nitric sintetasainduible que produeix la molecula vasodilatadora NO,. Per respirometria d'alta resolucio es vadeterminar que les mitocondries de VDRKO CMLV van ser menys eficients que podria explicarel menor contingut d'ATP en aquestes cel.lules. Tots aquests factors es van relacionar amb elfenotip senescent, que presentaven al voltant del 20% de les CMLV sense VDR en cultiu.En conclusio, l'absencia de senyalitzacio per VDR en CMLV porta a SIPS causada perl'augment en la produccio local d'Ang II, amb el conseguent augment dels radicals lliures,produits per l'activacio de la NADPH oxidasa, el que suggereix un possible paper del sistemade la vitamina D en malalties vasculars, que mostren una hiperproliferacio de les CMLV. / La vitamina D ha sido durante mucho tiempo conocida por su importante papel en laregulacion de los niveles de calcio y fosforo, y en la mineralizacion del hueso. Los efectosbiologicos de la forma hormonalmente activa de la vitamina D (1,25(OH)2D3, o calcitriol)estan mediados por la union al receptor de la vitamina D (VDR), que a su vez actua sobre loselementos de respuesta a la vitamina D (VDRE) en el promotor de los genes diana,modificando su expresion. En las ultimas decadas, se ha demostrado que el VDR estapresente no solo en las dianas clasicas de la vitamina D, como los huesos, los rinones y elintestino, sino tambien en muchos otros tejidos, como los musculos esqueleticos, lisos, ycardiacos, y en el cerebro, la piel y el higado. Ademas del control de la homeostasis mineral,la vitamina D ejerce acciones pleiotropicos en diferentes tipos celulares, influyendo enprocesos fisiologicos importantes tales como la proliferacion y diferenciacion celular, larespuesta inmune, asi como diferentes condiciones patologicas como el cancer, lasenfermedades cardiovasculares, metabolicas y autoinmunes. Ademas, junto con sus efectosendocrinos, la vitamina D tiene papeles autocrinas/paracrinas importantes. En las celulas demusculo liso vascular (CMLV), la vitamina D regula la proliferacion y la calcificacion. Ambosprocesos, junto con la senescencia de las CMLV surgen durante el proceso aterosclerotico.Para poder dividirse, las CMLV necesitan la energia del ATP producido por las mitocondrias.Las alteraciones en la funcion mitocondrial estan relacionadas con una mayor produccion deradicales libres. En la pared arterial, la angiotensina II (Ang II) actua como un potentemediador de estres oxidativo, provocando senescencia prematura inducida por estres (SIPS).Los niveles de Ang II son controlados por la renina, cuya expresion genica se regula por lavitamina D. Por lo tanto, un defecto en la senalizacion de la vitamina D puede conducir a unaumento en los niveles de Ang II y sus efectos adversos en la pared arterial.Cuando se cultivaron CMLV, obtenidas de ratones knockout para VDR (VDRKO) seencontro un aumento en la produccion de Ang II en el medio de cultivo de estas celulas,comparando con el tipo salvaje (WT), lo que estaba de acuerdo con la mayor activacion de lasistema renina-angiotensina a nivel sistemico, que fue encontrada en los ratones mutantesde VDR. Por otra parte, una disminucion en la tasa de proliferacion de las VDRKO CMLV fueencontrada in vitro e in vivo. Este descenso era en paralelo a un aumento en el volumencelular. En estado de reposo, las celulas VDRKO presentaron un aumento significativo en laexpresion de p57Kip2 junto con niveles elevados de p19Arf, p21Cip1 y p27Kip1, y menoresniveles de pRb fosforilada y ciclinas D y E, asi previniendo su proliferacion. Ademas, lascelulas VDRKO mostraron un aumento en la expresion de la catepsina D, una enzima conactividad parecida a la del renina, y del receptor de Ang II tipo 1. Ademas, la produccion delanion superoxido fue mayor en las celulas mutantes, y fue inhibida tanto con losartan comocon DPI. Por otra parte, las celulas VDRKO presentaron una disminucion significativa en laexpresion de la enzima antioxidante mitocondrial superoxido dismutasa de manganeso(SOD2) y la oxido nitrico sintetasa inducible, que produce la molecula vasodilatadora NO. Porrespirometria de alta resolucion fue determinado que las mitocondrias de las CMLV VDRKOfueron menos eficientes que podria explicar el menor contenido de ATP en estas celulas.Todos estos factores se relacionaron con el fenotipo senescente, presentado por alrededor de20% de las CMLV que carecian VDR en cultivo.En conclusion, la ausencia de senalizacion por VDR en CMLV lleva a SIPS debido alaumento en la produccion local de Ang II, con el consiguiente aumento de los radicaleslibres, producidos por la activacion de la NADPH oxidasa, lo que sugiere un posible papel delsistema de la vitamina D en enfermedades vasculares, que muestran una hiperproliferacionde las CMLV. / Vitamin D has long been known for its important role in regulating the levelsof calcium and phosphorus, and in mineralization of bone. The biological effects ofthe hormonally active form of vitamin D (1,25(OH)2D3, or calcitriol) are mediatedby the binding to the vitamin D receptor (VDR) which in turn acts over specificresponsive elements (VDRE) in the promoter region of the vitamin D - target genes,modifying their expression. In the last decades, it has been shown that VDR ispresent not only in the classical vitamin D targets such as bone, kidney, andintestine, but also in many other tissues, like skeletal, smooth, and heart muscles,and in brain, skin, and liver. In addition to the control of the mineral homeostasis,vitamin D exerts pleiotropic actions in a variety of cell types, influencing importantphysiological processes such as cellular proliferation and differentiation, theimmune response as well as different pathological conditions like cancer,cardiovascular, metabolic and autoimmune diseases. Moreover, together with itsendocrine effects, vitamin D has important autocrine/paracrine roles. In vascularsmooth muscle cells (VSMC), vitamin D regulates proliferation and calcification.Both processes, together with VSMC senescence occur during the atheroscleroticprocess. To be able to divide, VSMC need the energy of ATP produced bymitochondria. Alterations in the mitochondrial function are related to increasedproduction of free radicals. In the artery wall, angiotensin II (Ang II) serves as apotent mediator of oxidative stress, provoking stress-induced prematuresenescence (SIPS). Ang II levels are controlled by renin, which gene expression isregulated by vitamin D. Thus, a defect of vitamin D signalling could lead to anincrease in Ang II levels and its adverse effects in the artery wall.When we cultured VSMC, obtained from VDR knockout (VDRKO) mice wefound an increment in the production of Ang II in the culture medium of these cellsin comparison with the wild type (WT), which was in accordance with the increasedactivation of the renin-angiotensin system at systemic level, found in the VDRmutant mice. Moreover, a decrease in the proliferation rates of VDRKO VSMC wasfound in vitro and in vivo. This decrease was in parallel to an increase in the cellvolume. In quiescent state, VDRKO cells presented significantly increasedexpression of p57Kip2 together with elevated levels of p19Arf, p21Cip1 and p27Kip1, andlower levels of phosphorilated pRb and cyclins D and E, thus preventing theirproliferation. Furthermore, VDRKO cells showed an increase in the expression ofcathepsin D, an enzyme with renin-like activity, and of the Ang II receptor type 1.Also, superoxide anion production was higher in the mutant cells, and was inhibitedwith both, losartan and DPI. Moreover, the VDR ablated cells presented a significantdecrease in the expression of the mitochondrial antioxidant enzyme manganesesuperoxide dismutase (SOD2) and the inducible nitric oxide synthase, whichproduces the vasodilatator molecule NO. By high-resolution respirometry we foundthat the mitochondria of VDRKO VSMC were less efficient which could explain thelower content of ATP in these cells. All of these findings were associated with thesenescent phenotype, presented by around 20% of the VSMC lacking VDR inculture.In conclusion, the absence of VDR signalling in VSMC leads to SIPS due to theincreased local production of Ang II, with a subsequent increase in free radicals,produced by the activation of the NADPH oxidase, which suggests a possible role ofthe vitamin D system in vascular conditions which show hyperproliferation of VSMC.

L'objectiu d'aquesta tesi és desenvolupar i implementar un conjunt d'eines de mineria de dades per ajudar en la reconstrucció de circuits biològics a través de l'anàlisi i la integració de grans conjunts de dades biològiques. Aquests circuits són importants perquè regulen tots els processos que controlen la vida i la salut dels organismes. El treball principal de la tesis es centra en l'anàlisi de les dades bibliòmiques desenvolupant-se dues eines, Biblio-MetReS per la reconstrucció de xarxes de PPIs i la identificació dels processos en què intervenen aquestes xarxes, i CheNER per la identificació de noms de compostos químics. L'eina final desenvolupada es centra en la integració de mètodes per a l'anàlisi estructural i modelització de proteïnes amb mètodes d'acoblament per a la predicció de complexos físics de proteïna-proteïna. / El objetivo de esta tesis es desarrollar e implementar un conjunto de herramientas de minería de datos para ayudar en la reconstrucción de circuitos biológicos a través del análisis y la integración de grandes conjuntos de datos biológicos. Estos circuitos son importantes porque regulan todos los procesos que controlan la vida y la salud de los organismos. El trabajo principal de la tesis se centra en el análisis de los datos bibliómicos, desarrollándose con este fin dos herramientas diferentes, Biblio-MetReS para la reconstrucción de redes PPIs y la identificación de los procesos en que intervienen estas redes, y CheNER para la identificación de nombres de compuestos químicos. La herramienta final que he desarrollado se centra en la integración de métodos para el análisis estructural y modelado de proteínas con métodos de acoplamiento para la predicción de complejos físicos de proteína-proteína. / The aim of this thesis is the development and implementation of a set of data mining tools to aid in the reconstruction of biological circuits through analysis and integration of large biological datasets. These circuits are important because they regulate and maintain life and health in organisms. The main part of the thesis is focused on analyzing bibliomic data for which I develop two tools, Biblio-MetReS for the reconstruction of PPIs networks and to identify the processes in which the networks are involved, and CheNER for the identification of chemical compounds names. The final tool developed focuses on the integration of methods for structural analysis and modeling of proteins with docking methods for prediction of native protein-protein physical complexes.

Estación Experimental de Aula Dei. Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Departamento de Pomología. Zaragoza / El presseguer [Prunus persica (L.) Batsch] és l'espècie fruitera d'os més cultivada a Espanya, per darrere de l'ametller, i la primera pel que fa a producció per davant de totes les espècies d'os i les de llavor, pomera i perera. La composició química del fruit relacionada amb factors nutricionals es veu cada vegada més valorada en els programes de millora genètica. Les tècniques d'associació permetran identificar gens associats a aquests paràmetres de qualitat del fruit. L'objectiu d'aquest estudi és la caracterització morfològica, agronòmica, bioquímica i molecular de varietats de presseguer i nectarina de la col.lecció existent a l'Estació Experimental d'Aula Dei, amb la finalitat d'aprofundir en el coneixement dels factors que s'associen amb el control genètic de la qualitat organolèptica del fruit. A més, es pretén determinar la influència de patrons Prunus sobre paràmetres de qualitat del fruit de varietats de presseguer i nectarina. / El melocotonero [Prunus persica (L.) Batsch] es la especie frutal de hueso más cultivada en España, por detrás del almendro, y la primera en cuanto a producción por delante de todas las especies de hueso y las de pepita, manzano y peral. La composición química del fruto relacionada con factores nutricionales se ve cada vez más valorada en los programas de mejora genética. Las técnicas de asociación permitirán identificar genes asociados a estos parámetros de calidad del fruto. El objetivo de este estudio es la caracterización morfológica, agronómica, bioquímica y molecular de variedades de melocotonero y nectarina de la colección existente en la Estación Experimental de Aula Dei, con el fin de profundizar en el conocimiento de los factores que se asocian con el control genético de la calidad organoléptica del fruto. Además, se pretende determinar la influencia de patrones Prunus sobre parámetros de calidad del fruto de variedades de melocotonero y nectarina. / Peach [Prunus persica (L.) Batsch] is the most important temperate fruit tree grown in Spain, after almond. Also in Spain, the peach production contributes to the major production among stone and pome fruits before apples and pears. In recent years, special attention to fruit quality has been reported because it presents multiple health benefits effects to be considered for breeding programs. The techniques of association mapping would be very useful for detecting marker-trait association in fruit quality traits. This study aims to determine agronomical, pomological and fruit quality characteristics of peach and nectarine cultivars growing in the Estación Experimental de Aula Dei, in order to explore the utility of association mapping in fruit quality traits. Another aim is to evaluate the effect of different rootstocks on fruit quality of peaches and nectarines cultivars.

Els anells de cohesina, formats per les proteïnes Smc1, Smc3, Scc1 i Scc3, s’uneixen topològicament al DNA, mantenint les parelles de cromàtides germanes unides des de la duplicació del DNA fins al començament de l’anafase. Aquesta funció, coneguda com a Cohesió entre Cromàtides Germanes, permet la biorientació dels cromosomes en el fus mitòtic i, posteriorment, la seva correcta segregació. Es tracta per tant d’una funció fonamental per a la vida. La cohesió entre cromàtides germanes també té altres funcions, com ara afavorir la reparació del dany en el DNA a través de recombinació homòloga. És per aquests motius que la cohesina està sotmesa a diferents nivells de regulació al llarg del cicle cel·lular, a través de diversos factors reguladors i modificacions post-traduccionals. Per exemple, l’acetilació de la subunitat Smc3 és necessària per a que els anells es mantinguin establement units a cromatina. Alteracions en la molècula de cohesina o en la seva regulació poden provocar el desenvolupament de patologies i contribuir en la progressió tumoral. En aquest estudi, descrivim la sumoilació de la cohesina com una nova modificació post-traduccional necessària per la cohesió en Saccharomyces cerevisiae. La sumoilació de la cohesina depèn, en part, de la SUMO lligasa Nse2 i d’un complex Smc5/6 plenament funcional. Totes les subunitats del complex cohesina es sumoilen in vivo durant la replicació del DNA, després de la formació dels anells de cohesina i del seu reclutament a cromatina, en un procés depenent de la unió d’ATP a les subunitats SMC, i independent de l’acetilació de Smc3. Per tal d’alterar l’estat de sumoilació dels anells de cohesina i identificar la rellevància funcional d’aquesta modificació, hem dissenyat un nou sistema experimental que permet eliminar SUMO de totes les proteïnes del complex, basat en la fusió del domini SUMO peptidasa de Ulp1 (UD) a la proteïna Scc1. Les fusions Scc1-UD s’incorporen als anells de cohesina, es carreguen en la cromatina i es localitzen adequadament sobre els cromosomes de llevat. Tanmateix, la desumoilació dels anells de cohesina bloqueja la cohesió entre les cromàtides germanes, aturant el cicle cel·lular en G2/M i provocant la pèrdua de viabilitat de les cèl·lules. Aquests efectes són deguts a l’activitat del domini SUMO peptidasa, i no a problemes estructurals en la proteïna de fusió Scc1-UD, ja que la mutació puntual del centre catalític de UD restaura la cohesió i la viabilitat cel·lular. Experiments en paral·lel suggereixen que la sumoilació de la cohesina podria tenir funcions similars en cèl·lules humanes. Sorprenentment, els anells de cohesina continuen acetilats en absència de sumoilació. Donat que els models actuals proposen que els anells es tanquen de forma estable en ser acetilats, és probable que en absència de sumoilació la cohesina encercli una sola cromàtida. Per tant, proposem que la sumoilació de la cohesina seria necessària durant la replicació del DNA per atrapar les dues cromàtides germanes de forma estable en l’interior de l’anell. / Los anillos de cohesina, formados por las proteínas Smc1, SMC3, Scc1 y Scc3, se unen topológicamente al DNA, manteniendo las parejas de cromátidas hermanas unidas desde la duplicación del DNA hasta el comienzo de la anafase. Esta función, conocida como Cohesión entre Cromátidas Hermanas, permite la biorientación de los cromosomas en el huso mitótico y, posteriormente, su correcta segregación. Se trata por lo tanto de una función fundamental para la vida. La cohesión entre cromátidas hermanas también tiene otras funciones, como favorecer la reparación del daño en el DNA a través de recombinación homóloga. Es por estos motivos que la cohesina está sometida a varios niveles de regulación a lo largo del ciclo celular, a través de diferentes factores reguladores y modificaciones post-traduccionales. Por ejemplo, la acetilación de la subunidad Smc3 es necesaria para que los anillos se mantengan establemente unidos a cromatina. Alteraciones en la molécula de cohesina y/o en su regulación pueden provocar el desarrollo de patologías y contribuir a la progresión tumoral. En este estudio, describimos la sumoilación de la cohesina como una nueva modificación post-traduccional necesaria para la cohesión en Saccharomyces cerevisiae. La sumoilación de la cohesina depende, en parte, de la SUMO ligasa Nse2 y de un complejo Smc5/6 plenamente funcional. Todas las subunidades del complejo cohesina se sumoilan in vivo durante la replicación del ADN, después de la formación de los anillos de cohesina y de su reclutamiento en cromatina, en un proceso dependiente de la unión de ATP a las subunidades SMC, e independiente de la acetilación de Smc3. Con el fin de alterar el estado de sumoilación de los anillos de cohesina e identificar la relevancia funcional de esta modificación, hemos diseñado una nueva aproximación experimental que permite eliminar SUMO de todas las proteínas del complejo, basado en la fusión del dominio SUMO peptidasa de Ulp1 (UD) a la proteína Scc1. Las fusiones Scc1-UD se incorporan a los anillos de cohesina, se cargan en la cromatina y se localizan adecuadamente sobre los cromosomas de levadura. Sin embargo, la desumoilación de los anillos de cohesina impide la cohesión entre las cromátidas hermanas, deteniendo el ciclo celular en G2/M y provocando la pérdida de viabilidad de las células. Estos efectos son debidos a la actividad del dominio SUMO peptidasa, y no a problemas estructurales en la proteína de fusión Scc1-UD, ya que la mutación puntual del centro catalítico de UD restaura la cohesión y la viabilidad celular. Experimentos en paralelo sugieren que la sumoilació de la cohesina podría tener funciones similares en células humanas. Sorprendentemente, los anillos de cohesina continúan acetilados en ausencia de sumoilación. Dado que los modelos actuales proponen que los anillos se cierran establemente al ser acetilados, es probable que en ausencia de sumoilación la cohesina se cierre en torno a una sola cromátida. En consecuencia, proponemos que la sumoilación de la cohesina sería necesaria durante la replicación del ADN para atrapar las dos cromátidas hermanas de forma estable en el interior del anillo. / Cohesin rings composed of the Smc1, Smc3, Scc1 and Scc3 proteins topologically bind to DNA, keeping pairs of sister chromatids together from the time of DNA replication until the onset of anaphase. This feature, known as Sister Chromatid Cohesion (SCC), allows the biorientation of chromosomes on the mitotic spindle, and their subsequent segregation. Sister Chromatid Cohesion also has other roles, such as enabling repair of DNA damage through homologous recombination. Thus, it is not surprising that cohesin is subjected to multiple levels of control during the cell cycle by different regulatory factors and post-translational modifications. For example, acetylation of the Smc3 subunit is required to prevent the opening of cohesin rings, keeping them stably bound to chromatin. Alterations in the cohesin molecule itself and/or its regulation may lead to the development of serious pathologies and can contribute to tumor progression. In this study, we describe the sumoylation of cohesin as a new post-translational modification required for Sister Chromatid Cohesion in Saccharomyces cerevisiae. Sumoylation of cohesin is partially dependent on the Nse2 SUMO ligase and the Smc5/6 complex. All subunits of the cohesin complex are sumoylated in vivo during DNA replication, after the formation of cohesin rings and their recruitment onto chromatin, in a process dependent on the binding of ATP to the SMC subunits, and independent of Smc3 acetylation. In order to alter the sumoylation status of cohesin rings and to identify its functional relevance, we designed a new approach to remove SUMO from all cohesin subunits, based on the fusion of the SUMO peptidase domain of Ulp1 (UD) to the Scc1 protein. Scc1-UD fusions are properly incorporated into cohesin rings, loaded onto chromatin and located along yeast chromosomes. However, desumoylation of cohesin rings prevents Sister Chromatid Cohesion, arresting cells in G2/M and causing the loss of cell viability. These effects are due to the activity of the SUMO peptidase domain rather than structural problems in the Scc1-UD fusion, since mutation of the catalytic site in the UD restores cohesion and cell viability. Parallel experiments suggest that sumoylation of cohesin might have similar functions in human cells. Surprisingly, cohesin rings remain acetylated in the absence of sumoylation. Current models propose that cohesin rings are stably locked once they are acetylated. Therefore, it is likely that in the absence of sumoylation cohesin encircles a single chromatid. Consequently, we propose that sumoylation of cohesin is required during DNA replication to entrap the two sister chromatids inside its ring structure.

El receptor del factor de creixement nerviós TrkA contribueix a la supervivència i a ladiferenciació de diferents poblacions neuronals. Tot i que les principals vies de senyalització imolècules adaptadores activades després de la unió del lligant al receptor estan benestudiades, recentment un creixent nombre de proteïnes que interaccionen amb TrkA hanestat descrites com a nous mecanismes de regulació del receptor. La trans-autofosforilaciódel receptor, a més d'activar les cascades de senyalització rellevants per la diferenciació isupervivència cel·lular, com són les vies de les MAPKs i PI3K-Akt, també indueix un augmenttransitori de la concentració de calci citoplasmàtic. En conseqüència la proteïna sensora deCa2+ calmodulina (CaM) també participa en la senyalització per TrkA. El nostre grup estavainteressat en discernir la relació entre CaM i TrkA, i vàrem descobrir que CaM interaccionadirectament i de manera Ca2+-dependent amb l'extrem carboxi-terminal de TrkA. A partird'aquests resultats ens vàrem plantejar de buscar la posició exacta del domini d'unió acalmodulina en la seqüencia de TrkA. Donat que els programes de predicció no van trobar unaseqüència candidata d'unió a CaM en el domini intracel·lular del TrkA, vàrem centrar-nos en elextrem COOH-terminal del receptor, un domini ric en aminoàcids hidrofòbics en posicionsconservades. Vàrem introduir mutacions en dos aminoàcids del domini candidat, Leu784 iVal790 substituint-los per Ala. Els assajos d'unió van mostrar que els mutants TrkA-L784A iTrkA-L784A-V790A no perdien la unió a CaM, per tant no formaven part del domini d'unió aCaM de TrkA. Tanmateix, vàrem demostrar que aquests aminoàcids hidrofòbics són importantsper a la unió i la regulació de la lligasa d'ubiquitina Nedd4-2. Vàrem observar una fortainteracció dels dos receptors mutants amb Nedd4-2, que es corroborava amb una augmentadaco-localització de les dues proteïnes detectada per immunofluorescència. Com a conseqüèncias'observà una intensa multimonoubiquitinització basal dels receptors mutants mitjançada perNedd4-2. Aquests resultats correlacionen amb un important descens en la quantitat dereceptor a causa d'un direccionament d'aquest cap als endosomes tardans/lisosomes. Totplegat resultava en un increment en la degradació dels receptors mutats. Malgrat la reduccióen la quantitat de receptors de membrana, els receptors TrkA mutats van ser capaçosd'activar vies de senyalització, i fins i tot eren més eficients en promoure l'extensió deneurites que els receptors TrkA normals. Els nostres resultats demostren que la composició del'extrem COOH-terminal de TrkA participa en la regulació de la unió i activitat de Nedd4-2.Així mateix, s'evidencia que la ubiquitinització de TrkA per Nedd4-2 promou el tràficendosomal de TrkA cap als endosomes tardans/lisosomes augmentant d'aquesta manera ladegradació del receptor. Per altra banda, s'observa que la multimonoubiquitinització de TrkAno interfereix en l'activació de les vies de senyalització, tanmateix potencia la senyalització delreceptor conduent a la diferenciació cel·lular. / El receptor del factor de crecimiento nervioso TrkA contribuye a la supervivencia ydiferenciación de varias poblaciones neuronales. A pesar del buen conocimiento de lasprincipales vías de señalización y las proteínas adaptadoras activadas después de la unión delligando al receptor, últimamente se ha descrito un número creciente de proteínas queinteraccionan con el receptor participando en su regulación. La trans-autofosforilación delreceptor, adicionalmente a la activación de vías de señalización relevantes para ladiferenciación y la supervivencia celular, como son las vías de las MAPKs y PI3K-Akt, tambiénconlleva un aumento transitorio del calcio citoplasmático. En consecuencia la proteína sensorade calcio calmodulina (CaM) también participa en la señalización por TrkA. Nuestro grupo teníainterés en estudiar la relación entre CaM y TrkA y descubrió que la CaM interacciona de formadirecta y calcio dependiente con el extremo COOH-terminal del receptor TrkA. A partir deestos resultados nos plantemaos buscar la posición exacta del sitio de unión a calmodulinadentro de la secuencia de TrkA. Puesto que los programas de predicción no encontraronninguna secuencia candidata de unión a calmodulina en el dominio intracelular de TrkA, noscentramos en el extremo COOH-terminal, dominio rico en ácidos hidrofóbicos en posicionesconservadas. Introducimos mutaciones puntuales en el sitio candidato de unión a CaMcambiando la L784 y la V790 por Ala. Los ensayos de unión a CaM realizados mostraron quelos mutantes TrkA-L784A y TrkAL784A-V790A no perdían la unión a CaM, por lo tanto noformaban parte del dominio de unión a CaM de TrkA. Sin embargo, hemos demostrado queestos aminoácidos son importantes para la unión y la regulación de la ligasa de ubiquitinaNedd4-2. . Observamos una mayor interacción de los dos mutantes del extremo COOHterminalcon Nedd4-2, resultado que era corroborado por una mayor colocalización de las dosproteínas detectada por immunofluorescencia. Como consecuencia observamos una intensamultimonoubiquitinización basal de los receptores mutados mediada por Nedd4-2. Estosresultados correlacionan con un importante descenso de la cantidad de receptor a causa deun direccionamiento de este hacia los endosomas tardíos/lisosomas. Todo ello resultaba en unincremento en la degradación de los receptors mutados. A pesar de la reducción en la cantidadde receptor en membrana, los mutantes de TrkA mostraron ser capaces de activar las vías deseñalización e incluso ser más eficientes promoviendo el crecimiento de neuritas comparandocon el receptor normal. Estos resultados demuestran que la composición del extremo COOHterminalde TrkA regula la unión y la actividad de la ligasa de ubiquitina Nedd4-2. Además, laubiquitinización de TrkA mediada por Nedd4-2 promueve el direccionamiento de los receptoresmutados hacia los endosomas tardíos/lysosomas dando lugar a una mayor degradación delreceptor. Por otro lado, se observa que la multimonoubiquitinización de TrkA no interfiere conla activación de las vías de señalización, sino más bien potencia la señalización del receptorque conduce a la diferenciación celular. / The nerve growth factor receptor TrkA contributes to the survival anddifferentiation of several neuronal populations. Although main signaling pathwaysand adaptor molecules activated after ligand binding to the receptor are well studied,recently a growing number of TrkA interacting proteins have been described as novelmechanisms of receptor regulation. Receptor trans-autophosphorylation, additionallyto activating signaling cascades relevant for cell differentiation and survival, such asMAPKs and PI3K-Akt, also induces a transient increase in intracellular calciumconcentration. Therefore, the Ca2+ sensor calmodulin (CaM) also participates in TrkAsignaling. Our group was interested in elucidating the relationship between CaM andTrkA, and discovered that CaM interacts directly with the C-terminal tail of TrkA in aCa2+ dependent manner. Consequently, we sought to find the exact position of thecalmodulin binding site on TrkA sequence. Since available prediction software wasunable to find a putative CaM binding site in TrkA intracellular domain, we focusedon the C-terminal tail, a domain rich in hydrophobic amino acids in conservedpositions. We introduced point mutations on Leu784 and Val790 by switching themto Ala, located on our predicted CaM binding site. However, TrkA-L784A and TrkAL784A/V790A mutants did not lose CaM binding, therefore they were not involved onCaM binding. Nonetheless, we demonstrated that these hydrophobic aminoacids areimportant for the binding and regulation of Nedd4-2 Ub ligase. We observed astronger interaction of both C-terminal mutant receptors with Nedd4-2, corroboratedwith a higher colocalization of both proteins by immunofluorescence. Consequently,we observed an enhanced basal multimonoubiquitination of mutant receptors byNedd4-2. These results correlated with a decrease in TrkA abundance due to a fasterlate endosome/lysosome targeting, leading to a higher degradation rate of mutantreceptors. Despite the reduction in the amount of membrane receptor caused by theC-terminal changes, TrkA mutants were able to activate signaling cascades and wereeven more efficient in promoting neurite outgrowth than the wild-type receptor. Ourresults demonstrate that the C-terminal tail conformation of TrkA regulates Nedd4-2binding and activity. Moreover, TrkA ubiquitination by Nedd4-2 promotes TrkAendosomal trafficking to late endosome/lysosome leading to receptor degradation. Inaddition, TrkA multimonoubiquitination does not interfere with the activation ofsignaling cascades, but rather potentiates receptor signaling leading todifferentiation.

Esta Tesis Doctoral recoge el trabajo de investigación que se ha realizado en dos líneas desarrolladas de forma paralela sobre Escherichia coli. Por un lado, la optimización de un proceso de biotransformación para mejorar la síntesis de L( )-carnitina mediante técnicas de ingeniería metabólica. Y por otro, la determinación de los principales efectos que provoca la exposición prolongada a altas concentraciones de sal y su respuesta de adaptación, principalmente cuando las fuentes de carbono pueden contener altas concentraciones de sal y tanto el sustrato como el producto son osmoprotectores. Para ello, se han aplicado técnicas utilizadas por la biología de sistemas y la ingeniería metabólica. La importancia de L( )-carnitina viene determinada por el papel que desempeña en el metabolismo energético, de hecho su deficiencia está asociada a diversas patologías. Varios trabajos centrados en la aplicación terapéutica de L( )-carnitina han demostrado que su administración puede ayudar a suplir dicha carencia. A partir de este punto, comienza una creciente actividad investigadora centrada en la producción de L( )-carnitina. Este trabajo presenta un método alternativo basado en la utilización de E. coli para llevar a cabo la biotransformación de compuestos de bajo valor añadido como puede ser D(+)-carnitina y/o crotonobetaína en L( )-carnitina. Por medio de técnicas de biología molecular se ha modificado genéticamente una cepa de E. coli, consiguiendo la sobreexpresión de caiC y mejorando el rendimiento de la cepa silvestre. Además, para optimizar la producción de L( )-carnitina se han estudiado aspectos relacionados con el metabolismo de carnitina como la disponibilidad de coenzima A o la inhibición de una ruta metabólica que favorezca la transformación del sustrato en L( )-carnitina. Posteriormente, se obtuvo una cepa modificada más estable y con una alta capacidad para la producción de L( )-carnitina, para ello se han implementado diversas estrategias de ingeniería metabólica. Las mutaciones implicadas en la mejora de esta cepa fueron: a) la deleción del gen aceK para incrementar el flujo hacia el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, b) la deleción del gen caiA para impedir la síntesis de γ-butyrobetaína (productos del metabolismo de carnitina), y c) la sustitución del promotor natural altamente regulado del operón cai por un promotor artificial constitutivo. Con dichas mutaciones implementadas en una misma cepa, no sólo se consiguió aproximadamente un 100 % de conversión de crotonobetaína en L( )-carnitina en las condiciones de ensayo, sino que también la limitación impuesta por la presencia de oxígeno fue superada por este mutante, lo que indica la importancia de la ingeniería metabólica en la mejora de procesos biotecnológicos. L(-)-carnitina o compuestos similares son utilizados como osmoprotectores, acumulándolos en el interior celular, para evitar la deshidratación cuando la osmolaridad del medio se incrementa. Ante estas situaciones, los microorganismos pueden adaptarse y dar una respuesta pasajera, o realizar un proceso de adaptación para mantener su supervivencia mientras el estrés está presente. En este trabajo, se observó la evolución y la respuesta generada de una cepa de E. coli cultivada en un reactor continuo y sometida a tres concentraciones crecientes de sal (moderada, alta y muy alta). La medida de las actividades enzimáticas de las principales rutas metabólicas, así como la determinación de los metabolitos fermentativos producidos, resaltaron el importante papel ejercido por el metabolismo central en la adaptación y en la supervivencia celular tras una larga exposición a estrés salino, así como la necesidad de disponer de precursores biosintéticos y de energía en forma de ATP. Además, se profundizó en el estudio del comportamiento celular realizando una aproximación desde la biología de sistemas, integrando los niveles metabolómico, flujómico y transcriptómico. Se debe destacar que se observaron dos conjuntos de respuestas consecuencia de la concentración de sal presente en el medio. Uno dirigido a mantener unos niveles energéticos umbrales en la célula, basado tanto en el incremento de los flujos metabólicos hacia rutas que permitían la generación de energía, como en la reducción de procesos no esenciales para la supervivencia. Y otro, una respuesta característica en las células expuestas a alta o a muy alta concentración de sal, que estuvo caracterizada no sólo por cambios en los patrones de fermentación metabólica sino también por una alteración significativa del estado redox celular. Así, con el uso de técnicas apropiadas se han podido detectar un gran número de cambios en la fisiología y el metabolismo de E. coli. Además, la aproximación de la biología de sistemas ofrece una forma de obtener e integrar gran cantidad de información, que de otra forma se perdería por la cantidad de información que se obtiene. Finalmente, la ingeniería metabólica y la biología de sistemas han aportado una excelente manera de mejorar y conocer las características de los microorganismos involucrados en los procesos biotecnológicos relacionados con la producción de L( )-carnitina. / Two parallel research aims addressed on Escherichia coli are shown in this PhD thesis. On one hand, the optimization of a biotransformation process in order to improve L( )-carnitine synthesis by using metabolic engineering techniques is explained within the first chapters. On the other hand, in the following chapters, the main effects provoked by long-term high salt concentrations and the adaptative response to osmotic stress were determined using different techniques related to systems biology. L( )-carnitine is an important trimethylammonium compound because of its role in the energetic metabolism, in humans, several pathologies are related with deficiencies of carnitine level. Several works focused on the therapeutic application of L( )-carnitine, showed that administration of this compound could be a solution as opposed to its absence. Once different carnitine production ways were revised, this work shows an alternative method using Escherichia coli to carry out the biotransformation from D(+)-carnitine and/or crotonobetaine into L( )-carnitine. By using molecular biology techniques a strain of E. coli was engineered, obtaining caiC overexpression and enhancing the production yield respect to the wild type strain. Moreover, several aspects related with carnitine metabolism, such as coenzyme A availability and the inhibition of specific metabolic pathways were studied to optimize the carnitine production. Afterwards, various metabolic engineering strategies were implemented, obtaining a stable engineered strain with high capacity to produce L( )-carnitine. The modifications carried out were: a) deletion of the aceK gene (encoding a bifunctional protein phosphatase/kinase which performs post-translational control of isocitrate dehydrogenase) in order to increase the metabolic flux towards TCA cycle, b) deletion of the caiA gene (encoding the crotonobetainyl-CoA reductase) to avoid synthesis of γ-butyrobetaine (byproduct of the carnitine metabolism), and c) replacement of the highly regulated natural promoter of the cai operon by a constitutive promoter. These mutations implemented in the same strain led to obtaining almost 100% conversion from crotonobetaine to L( )-carnitine in the assay conditions. Moreover, the main restrictions impossed to the aerobic expression of the carnitine metabolism were eliminated producing L( ) carnitine in the presence of oxygen. Therefore, this work emphasizes the important role of metabolic engineering to improve any biotechnological process. On the other hand, L( )-carnitine and similar compounds are used as osmoprotectors, which are accumulated in high concentrations, either through the uptake from the medium or through de novo synthesis inside the cells, to avoid dehydratation when the osmolarity of the culture medium increases. Under these conditions, microorganisms have different response to an environmental stress, short-term or shock and long-term adaptation. In this work, evolution and response to long-term adaptation were analyzed in a E. coli strain growing in continuous reactors supplemented with a gradually increasing concentration of NaCl (moderate, high and very high). Enzyme activities from the main metabolic pathways and fermentative metabolites were analyzed, highlighting important role of central metabolism on adaptation and cellular survival after salt stress exposition. Furthermore, the need of biosynthetic precursors and energy as ATP were shown. In addition, a systems biology approach was conducted to study cellular behavior. In order to estimate the critical modifications undergone to overcome stress and to develop tolerance to salt, the metabolism was examined at several levels using different techniques (metabolomics, fluxomics and transcriptomics). Under salt stress conditions two set of responses were shown. One of them was focused to maintain the energetic threshold in cells, thus, either an increment of the metabolic pathways which could produce energy or a decrease of no-essential processes to survive were shown. On the other hand, cells under high or very high salt concentrations showed another similar response characterized by both changing on pattern of fermentative pathways and redox state. Therefore, using suitable techniques many changes in the physiology and metabolism of the E. coli strain in use were detected. Moreover, the systems biology approach offered a way to obtain and integrate a large amount of information, preventing some of the information being overlooked by the massive amount of data. Both the metabolic engineering and systems biology approaches have provided excellent ways to improve and know features of microorganisms involved in biotechnological processes related with the L( )-carnitine production.

La Ca2+-ATPasa de RS puede hidrolizar ATP a través de una ruta alternativa en la que solo intervienen conformaciones de la proteína que no unen Ca2+. El mecanismo molecular de esta actividad hidrolítica implica un cambio conformacional inducido por ATP que produce aproximaciones de los dominios citosólicos. El uso de indicadores fluorescentes y compuestos que movilizan Ca2+ permite caracterizar flujos y depósitos intracelulares de Ca2+ que están implicados en la generación de señales intracelulares de Ca2+ en células H9c2. La mitocondria es capaz de interpretar señales citosólicas de Ca2+ que se generan en el retículo sarco-endoplásmico (RSE). El efecto apoptótico que se observa en presencia del inhibidor Tapsigargina (TG) es dependiente de la concentración usada. La muerte celular se produce antes cuando TG provoca apertura del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial. El daño producido en el RSE activa la ruta apoptótica mitocondrial con participación de cas pasa 8 en un lazo que amplifica la cascada degradativa de las caspasas. Las células disponen de mecanismos alternativos de muerte celular en los que no participan caspasas.