GARANTIZADO, F. E. A. Caracterização da família multigênica da proteína desacopladora de plantas (pUCP) e regulação da expressão gênica sob diferentes condições de estresses abióticos em Vigna unguiculata (L.) Walp. 2012. 152 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-22T20:36:03Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_feagarantizado.pdf: 1868479 bytes, checksum: bd2f77d349cdf7e3f758d725ec4fc1fa (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-12T15:58:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_feagarantizado.pdf: 1868479 bytes, checksum: bd2f77d349cdf7e3f758d725ec4fc1fa (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-12T15:58:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_feagarantizado.pdf: 1868479 bytes, checksum: bd2f77d349cdf7e3f758d725ec4fc1fa (MD5) Previous issue date: 2012 / The plant uncoupling proteins (pUCP) are located in the inner mitochondrial membrane and facilitate the proton translocation across the intermembrane space into the mitochondrial matrix, deflecting the passage of H + by F1-ATPase activity, thus affecting the efficiency of oxidative phosphorylation, i.e decreasing the synthesis of ATP coupled to the operation of the electron transport chain. Therefore, these proteins are responsible for dissipating the electrochemical gradient of H+, generated by respiration, releasing heat to the environment. These proteins belong to family of carriers Mitochondrial Anion (FCAM) and are encoded by multigene families. Their function is not yet fully elucidated, but the literature suggests involvement in adapting to biotic and abiotic stresses and cell protection by avoiding the production of reactive oxygen species (ROS). Their participation in adaptive thermogenesis is unclear. The aim of this work was to characterize the multigene family of pUCP in Vigna unguiculata (L.) Walp and your regulation through gene expression in response to different abiotic stresses. Vigna unguiculata seeds were germinated on paper imbibed water in the dark. Three days after germination the seedlings were transferred to Hoagland solution for 3 days before application of stress. Roots and leaves were collected at 0, 6, 12 and 24 hours after addition of the respective 100 mM NaCl, 200.67 g / L PEG, 10 mM H2O2 and 5 mM salicylic acid to characterize the profile of multigene family expression of genes for pUCP by semiquantitative RT-PCR and real-time PCR (qPCR). Specific primers were designed based on the sequences of cDNA / gene identified in pUCPs Vigna unguiculata using the PerlPrimer tool. Amplification of cDNA of actin was used to normalize the data for RT-PCR semi-quantitative and three constitutive genes were used to normalize the data of qPCR: 2 to actin gene (actin 4 and 5) and a gene for factor alogament 1-α (EF1α). In silico analysis revealed that in Fabales order pUCP is encoded by at least six pUCPs genes presenting a duplication of the gene type 1 (1a, 1b) and a pUCP6 gene deletion. The multigene family of pUCP, consisting of six genes was then identified in Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 and VuUCP5). The alignment of amino acid and nucleotide sequences of the species of Fabales order including Vigna unguiculata, revealed three xv. conserved sequences called signal Energy Transfer Protein (SPTE), and four domains (or regions or sites) existence of specific true pUCPs in Vigna unguiculata. VuUCP1a gene was constitutively expressed in leaves and roots, contrasting with VuUCP1b, whose expression was modulated in a stress and tissue-dependent manner. The VuUCP1b expression increased in response to all treatments (PEG, NaCl, H2O2 and salicylic acid) in roots, whereas the expression in leaves did not increase in response to NaCl. VuUCP2 expression was inhibited in response to PEG in leaves. VuUCP4 showed constitutive expression in response to stresses in both tissues, while VuUCP3 and VuUCP5 showed induction of expression by various stresses depending on the tissue type. The identification of the multigene family of pUCPs in Vigna unguiculata and its gene expression profile in different tissues and stress conditions highlights a possible role of this protein in the adjustment of plants to environmental stresses. / As proteínas desacopladoras de planta (pUCP) estão localizadas na membrana mitocondrial interna e facilitam o transporte de prótons do espaço intermembranar para a matriz mitocondrial, desviando a passagem de H+ através da F1-ATPase, afetando assim a eficiência da fosforilação oxidativa, isto é, diminuindo a síntese de ATP acoplada ao funcionamento da cadeia transportadora de elétrons. Portanto, essas proteínas são responsáveis pela dissipação do gradiente eletroquímico de H+, gerado pela respiração, liberando calor para o ambiente. Tais proteínas pertencem a Família de Carreadores de Ânions Mitocondriais (FCAM) e são codificadas por famílias multigênicas. Sua função ainda não está completamente elucidada, mas a literatura sugere participação na adaptação a situações de estresses bióticos e abióticos e na proteção da célula evitando a produção de espécies reativas do oxigênio (EROs). Sua participação na termogênese adaptativa é questionável. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a família multigênica da pUCP em Vigna unguiculata (L.) Walp bem como sua regulação através da expressão gênica em resposta a diferentes estresses abióticos. Sementes de Vigna unguiculata foram germinadas em papel umedecido com água, no escuro e após 3 dias as plântulas foram transferidas para solução de Hoagland durante 3 dias antes da aplicação dos estresses. As raizes e as folhas foram coletadas com 0, 6, 12 e 24 horas, após respectivas adições de NaCl 100 mM, PEG 200,67 g/L, H2O2 10 mM e ácido salicílico 5 mM, para caracterizar a família multigênica e o perfil de expressão dos genes da pUCP por RT- PCR semiquantitativa e por PCR em tempo real (qPCR). Primers específicos foram desenhados com base nas sequências de cDNAs/genes de pUCPs identificadas em Vigna unguiculata usando a ferramenta PerlPrimer. A amplificação do cDNA da actina foi usada para a normalização dos dados de RT-PCR semi-quantitativa e três genes constitutivos foram usados na normalização dos dados da qPCR: 2 genes para actina (actinas 4 e 5) e 1 gene para o fator de alogamento 1-α (EF1α). Análise in silico revelou que a pUCP na ordem Fabales é codificada por pelo menos seis genes com duplicação do gene pUCP do tipo 1 (1a e 1b) e deleção do gene pUCP6. A família multigênica da pUCP, constituída de 6 genes, então foi identificada em Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 e VuUCP5 ). O alinhamento de sequências nucleotídicas e de aminoácidos das xiii. espécies da ordem Fabales incluindo as de Vigna unguiculata, revelou 3 sequências conservadas denominadas Sinal Protéico de Transferência de Energia (SPTE), além de 4 domínios específicos que caracterizam existência de pUCPs verdadeiras em Vigna unguiculata. O gene VuUCP1a foi expresso constitutivamente em folhas e raízes, contrastando com VuUCP1b, cuja expressão foi modulada em função dos estresses e de tecidos. Em raízes a expressão do VuUCP1b aumentou em resposta a todos os tratamentos (PEG, NaCl, H2O2 e ácido salicílico) enquanto que em folhas a expressão não aumentou em reposta ao NaCl. VuUCP2 teve a expressão inibida em resposta ao PEG em folhas. VuUCP4 apresentou expressão constitutiva em resposta aos estresses em ambos os tecidos, enquanto que VuUCP3 e VuUCP5 apresentaram indução de expressão por vários estresses dependente do tecido. A identificação da família multigênica das pUCPs em Vigna unguiculata e seu perfil de expressão gênica diferencial, em função do estresse aplicado e do tecido estudado, põe em evidência um possível papel dessa proteína nos mecanismos de ajustamento das plantas aos estresses ambientais.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of this study was to evaluate the effect of clomazone herbicide on metabolism of silver catfish (Rhamdia quelen). It was measured levels of lactate, protein and glucose (plasma), glycogen, protein and lactate (liver and muscle), acetylcholinesterase (AChE) activity (brain and muscle), catalase activity (liver), TBARS formation (liver and brain), hematocrit and hemoglobin values, aminotransferases (AST and ALT) activities (liver and plasma) and histological analysis of hepatic tissue. Fishes were exposed to 0.5 and 1.0 mg/L of clomazone for 12, 24, 48, 96 and 192 h. These concentrations are used in rice fields. Some parameters were also assayed after 96 h and 192 h in water without herbicide (recovery periods) after 96 and 192 h of exposure. Levels of muscle glycogen and liver lactate were reduced as well as hematocrit value after experimental period. Hemoglobin content did not changed significantly. Lactate levels diminished in the muscle tissue. Liver glycogen, glucose and lactate in the plasma were enhanced after exposure to herbicide. Protein levels were enhanced in the liver and white muscle, except at last periods of exposure, while plasma protein increased from 48 to 96 h of exposure to the herbicide. Specific AChE activity decreased in brain and muscle after treatments. Catalase activity was reduced in all periods of exposure. Fishes exposed to clomazone increased TBARS production in the liver, while in the brain the fishes showed different responses with exposure period increasing. Aminotransferases activities were elevated in the plasma, while in the liver, ALT increased in the early periods only. Liver AST activity was enhanced after 12 h of exposure, and after 48 h its activity reduced significantly. Hepatic histological analysis presented hepatocyte vacuolation after 192 h of exposure to herbicide concentration of 1.0 mg/L. However, in recovery period of 192 h, hepatocyte vacuolation was observed in both clomazone concentration tested. Most of the metabolic disorders did not persist after recovery period, except to liver AST and ALT activities. The present work shows that clomazone concentrations used in rice fields can cause changes in metabolic state of the fish, which are of moderate intensity and generally reversible. / O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do herbicida clomazone sobre o metabolismo do jundiá (Rhamdia quelen). Foram medidos os níveis de lactato, proteína e glicose (plasma), glicogênio, proteína e lactato (fígado e músculo), atividade da enzima AChE (cérebro e músculo), atividade da enzima catalase (fígado), formação de TBARS (fígado e cérebro), valores de hematócrito e hemoglobina, atividade das enzimas aminotransferases (AST e ALT) (fígado e plasma) e análise histológica do tecido hepático. Os peixes foram expostos a 0.5 e 1.0 mg/L de clomazone por 12, 24, 48, 96 e 192 horas. Estas concentrações são utilizadas nas lavouras de arroz. Alguns parâmetros foram também medidos após 96 e 192 horas em água sem o herbicida (períodos de recuperação) após 96 e 192 horas de exposição. Os níveis de glicogênio muscular e lactato hepático estavam reduzidos, assim como o valor do hematócrito, após o período experimental. O conteúdo de hemoglobina não se alterou significativamente. Os níveis de lactato diminuíram no tecido muscular. O glicogênio hepático, glicose e lactato no plasma estavam aumentados após exposição ao herbicida. Os níveis de proteína estavam aumentados no fígado e músculo, exceto nos últimos tempos de exposição, enquanto a proteína no plasma aumentou a partir de 48 até 96 horas de exposição ao herbicida. A atividade específica da AChE diminuiu no cérebro e músculo após os tratamentos. A atividade da catalase foi reduzida em todos os períodos de exposição. Os peixes expostos ao clomazone aumentaram a produção de TBARS no fígado, enquanto no cérebro os peixes apresentaram diferentes respostas com o aumento do tempo de exposição. A atividade das aminotransferases estava elevada no plasma, enquanto no fígado, a ALT aumentou somente nos períodos iniciais. A atividade da AST no fígado estava aumentada após 12 horas de exposição, e após 48 horas, sua atividade reduziu significativamente. A análise histológica demonstrou vacuolização nos hepatócitos após 192 horas de exposição ao herbicida na concentração de 1,0 mg/L. Entretanto, no período de recuperação de 192 horas, a vacuolização foi observada em ambas concentrações testadas do clomazone. A maioria das desordens metabólicas não persistiu após o período de recuperação, exceto as atividades da AST e ALT hepáticas. O presente trabalho mostra que as concentrações de clomazone utilizadas nas lavouras de arroz podem causar mudanças no estado metabólico do peixe, às quais são de moderada intensidade e geralmente reversíveis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The peptide bradykinin is one of the most potent algogenic substances and its role in nociception has been intensively studied in the peripheral nervous system. However, its action in pain transmission in central nervous system remains unclear. In this work, we studied the action of this peptide into amygdala, a limbic structure highly involved on pain modulation, in the thermal noxious threshold of rats. Administration of bradykinin (0.025-0.5 nmol/site) into right amygdala of rats promoted a thermal hyperalgesia, verified by a reduction in paw withdrawal latency produced by noxious heat, only in the ipsilateral paw. The hyperalgesic effect of bradykinin (0.25 nmol/site) was not due to an unspecific effect on locomotor activity, visualized on open-field test. The hyperalgesia induced by intra-amygdala injection of bradykinin (0.25 nmol/site) was abolished by co-administration of this peptide with the B2 receptor antagonist Hoe 140 (5 pmol/site), but not by its co-administration with the B1 receptor antagonist des- Arg9-[Leu8]-bradykinin (0.05 nmol/site). This hyperalgesic effect was also inhibited by co-administration of bradykinin (0.25 nmol/site) with the glutamatergic NMDA antagonist MK-801 (5 nmol/site), with the cyclooxygenase inhibitor indomethacin (10 nmol/site) or with the glial metabolic inhibitor fluorocitrate (1 nmol/site) into amygdala of the rats. The results showed that intra-amygdalar administration of bradykinin induces pain sensitization through the release of cyclooxygenase products and the activation of NMDA and B2 receptors present in amygdala s neurones and glia. These findings provide evidence that bradykinin participates of the central pain-modulating circuit. / O peptídeo bradicinina está entre as mais potentes substâncias algogênicas, e seu papel na nocicepção tem sido intensamente estudado no sistema periférico. No entanto, sua participação na transmissão da dor no sistema nervoso central permanece obscura. Neste trabalho avaliou-se a ação desse peptídeo na amígdala, uma estrutura límbica que está amplamente envolvida na modulação da dor, através de um modelo de dor por estimulação térmica. A administração de bradicinina (0,025- 0,5 nmol/sítio) na amígdala direita de ratos promoveu hiperalgesia térmica, verificada como uma redução na latência do reflexo de retirada da pata causado por estimulação térmica nociva, apenas na pata ipsilateral á amígdala injetada. O efeito hiperalgésico da bradicinina (0,25 nmol/sítio) não foi mediado por alteração na atividade locomotora dos animais, avaliada no teste do campo aberto. A hiperalgesia produzida pela injeção intra-amígdalar de bradicinina (0,25 nmol/sítio) foi abolida pela sua co-administração com o antagonista do receptor B2, Hoe 140 (5 pmol/sítio), mas não pela sua coadministração com o antagonista do receptor B1 , des-Arg9-[Leu8]-bradicinina (0,05 nmol/sítio). Esse efeito hiperalgésico também foi inibido pela co-administração de bradicinina (0,25 nmol/sítio) com o antagonista do receptor glutamatérgico do tipo NMDA, MK-801 (5 nmol/sítio), com o inibidor da ciclooxigenase, indometacina (10 nmol/sítio), ou com inibidor do metabolismo da glia, fluorocitrato (1 nmol/sítio), na amígdala de ratos. Os resultados demonstraram que a administração intra-amigdalar de bradicinina induz sensibilização à dor através da liberação de produtos da ciclooxigenase e da ativação dos receptores NMDA e B2 presentes em células neuronais e gliais da amígdala. Esses achados fornecem evidências da participação da bradicinina na modulação central da dor.

Magister en Bioquímica área de especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al título profesional de Bioquímica / En el cáncer ovárico epitelial (COEI), el ovario pierde el control normal de la angiogénesis. El COE exhibe alta expresión del Factor de Crecimiento Nervioso (NGF), un factor proangiogénico. Por otro lado, la calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional con propiedades anti-angiogénicas. Su exposición en la cara extracelular de la membrana plasmática de células tumorales en proceso de muerte celular es necesaria para que éstas sean reconocidas y fagocitadas por células dendríticas. El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de CRT en muestras humanas: ovarios normales inactivos, tumores benignos, tumores borderline y muestras de cáncer ovárico epitelial. Además, evaluar si el NGF regula la expresión de CRT en células epiteliales normales de la superficie ovárica humana (células HOSE) y en una línea celular de cáncer ovárico epitelial (A2780). Los niveles de mRNA y proteicos de CRT fueron evaluados mediante RT-PCR, western-blot e inmunohistoquímica en un total de 67 muestras ováricas humanas. La expresión de CRT inducida por estimulación con NGF en líneas celulares fue evaluada por RT-PCR, western-blot e inmunocitoquímica. Los niveles de mRNA de CRT aumentaron en muestras de cáncer ovárico epitelial comparado con ovarios normales inactivos, tumores benignos y tumores borderline. Los niveles proteicos resultaron mayores en cáncer con respecto a tumores benignos y tumores borderline. Al estimular las líneas celulares HOSE y A2780 con NGF (100 ng/ml) por 30 minutos, no se observaron cambios estadísticamente significativos en los niveles de mRNA. Sin embargo, a través de inmunocitoquímica y western-blot se observó un aumento significativo en los niveles proteicos de CRT al estimular con NGF comparado con la situación control. Este efecto fue revertido por GW441756, un inhibidor específico del receptor de NGF, TRKA. Estos resultados sugieren que NGF regula la expresión de CRT en células epiteliales ováricas mediante la activación de su receptor de alta afinidad TRKA / In epithelial ovarian cancer (EOC), the ovary loses the normal control of angiogenesis. EOC exhibits high expression of Nerve Growth Factor (NGF), a proangiogenic protein. On the other hand, calreticulin (CRT) is a multifunctional protein with anti-angiogenic properties. Its exposure on the cell membrane of dying tumor cells is necessary to promote their recognition and engulfment by dendritic cells. The aim of this work was to evaluate CRT expression in human samples: normal inactive ovaries, benign tumors, borderline tumors and epithelial ovarian cancer samples. Besides, to evaluate whether NGF regulates CRT expression in human ovarian surface epithelium cells (HOSE cells) and in an epithelial ovarian cancer cell line (A2780). Calreticulin mRNA and protein levels were analyzed by RT-PCR, western-blot and immunohistochemistry in 67 human ovarian samples. CRT expression induced by NGF stimulation in cell lines was evaluated by RT-PCR, western-blot and immunocytochemistry. CRT mRNA levels were elevated in epithelial ovarian cancer samples as compared to inactive normal ovaries, benign tumors and borderline tumors. CRT protein levels, evaluated by western-blot, were increased in epithelial ovarian cancer with respect to benign and to borderline tumors. When HOSE and A2780 cell lines where stimulated with NGF (100 ng/ml) for 30 minutes, no significant increase in CRT mRNA levels, evaluated by RT-PCR, was found. However, by immunocytochemistry and western-blot there was a significant increase in CRT protein levels after NGF stimulation, as compared to controls. This effect was reverted by GW441756, a TRKA specific inhibitor, receptor for NGF. These results suggest that Nerve Growth Factor regulates CRT expression in epithelial ovarian cells through TRKA activation, its high affinity receptor

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / 1.- RESUMEN Durante la generación de electricidad en sistemas de Celda de Combustible Microbiológicas (MFC, por su sigla en inglés), se han manipulado distintas vías metabólicas para generar un aumento en la bioelectricidad, debido a que los electrones necesarios para este proceso provienen del poder reductor generado dentro de la célula. Esto no solo se ha estudiado en cepas electrogénicas como lo son Geobacter o Shewanella, sino que también se han realizado estudios en Escherichia coli, la cual puede transferir electrones a un electrodo a través de un mediador. Estos últimos años, la investigación se ha centrado específicamente en la manipulación cofactores, principalmente el NADH. En estos casos, alteran tanto vías de consumo como de generación de este cofactor, pero evalúan principalmente la eficiencia de esta modificación en el voltaje, la corriente o en la potencia producida. Sin embargo, pocas veces consideran observar los factores intrínsecos de la bacteria que están produciendo estas mejoras. Debido a esto, en este trabajo se utilizó una MFC con distintas cepas de E. coli con el mediador rojo neutro para observar no solo los cambios en la generación de corriente, sino que también, el consumo de la fuente de carbono (glucosa en este caso), rendimiento, y flujo de electrones en estos cultivos electrogénicos. Esto ayudó a comprender en parte lo que puede estar pasando en el metabolismo bacteriano durante el proceso de generación de corriente. Las cepas utilizadas fueron la cepa de E.coli K-12 MG1655, la cepa NAD-G6PDH la cual presenta un cambio en la especificidad de cofactor de la enzima G6PDH (en la cepa silvestre utiliza NADP+ , en este caso utiliza NAD+), la cepa Δpgi (con la deleción del gen que codifica la enzima fosfogluco isomerasa) y la cepa Δpgi-NAD-G6PDH que posee las dos mutaciones mencionadas. Finalmente, el trabajo demostró que las cepas MG1655 y NAD-G6PDH, que presentan más NADH, generan mayor electricidad en el tiempo que las cepas que tienen la mutación Δpgi. No obstante, el flujo de los electrones de todas las cepas fue similar, ya que no se observaron diferencias significativas. Además, se observó que la cepa Δpgi podría poseer un mejor rendimiento de mmoles de electrones por mmoles de glucosa consumida que las otras cepas, ya que produce una corriente relativamente alta para la poca biomasa y el bajo consumo de glucosa. / During the electricity generation in Microbiological Fuel Cell (MFC) systems, different metabolic pathways have been manipulated to generate an increase in the bioelectricity since the electrons needed for this process come from the reducing power generated inside the cell. This has not only been studied in electrogenic strains such as Geobacter or Shewanella, but also studies have been carried out in Escherichia coli, which can transfer electrons to an electrode through a mediator. Over the last few years, the research has focused specifically on the manipulation of cofactors, mainly in NADH. In these cases, they alter both consumption and generation pathways of this cofactor, but they mainly evaluate the efficiency of this modification in the voltage, the current or the power produced. However, they rarely consider observing the intrinsic factors of the bacteria that are producing these improvements. Due to this, in this work we used an MFC with different strains of E. coli with the Neutral Red mediator to observe not only the changes in the current generation, but also the consumption of carbon source (glucose in this case), yields, and electron flux in these electrogenic cultures. This helped to partially understand what may be happening in the bacterial metabolism during the current generation process. The strains used in this work were E. coli strain K-12 MG1655, strain NAD-G6PDH, which shows a change in the specificity cofactor of the G6PDH enzyme (in the wild type strain uses NADP+, in this case uses NAD+), strain Δpgi (with a deletion of the gene encoding the phosphoglucose isomerase enzyme) and strain Δpgi-NAD-G6PDH that possesses the two mentioned mutations. Finally, the work demonstrated that the strains MG1655 and NAD-G6PDH that present more NADH generate higher current per time than the strains that have the Δpgi mutation. Nevertheless, the electrons flux of all the strains was similar, since no significant differences were observed. In addition, it was observed that the strain Δpgi could have a better yield of mmol of electrons per mmol of consumed glucose than the other strains, since it produces a relatively high current for the low biomass and the low glucose consumption / PAIFAC 2016. Fac Cs. (RC) y Proyecto ENL012/16.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica / Cyclovirus (CyCV) es un agente infeccioso, recientemente descubierto, con un pequeño material genético de DNA circular de hebra simple que codifica para una proteína asociada a la replicación (Rep) y otra a la capside viral (Cap). Infecta diversos organismos eucariontes, incluyendo humanos, donde se han descrito variantes genéticas con prevalencia de hasta 15,7% en niños con parálisis flácida aguda. El genoma del CyCV se ha detectado en distintas muestras biológicas de población enferma y asintomática, desconociéndose su rol patogénico. En Chile, sólo se ha estudiado en aspirado nasofaríngeo de niños con enfermedad respiratoria aguda baja (ERA), detectándose en el 3,3% y describiéndose una nueva cepa viral denominada CyCV-ChileNPA. El objetivo de esta tesis fue detectar y genotipificar variantes de la cepa chilena de cyclovirus en niños y adultos, con y sin enfermedad respiratoria. En 101 menores de un año hospitalizados por ERA, 105 mayores de 18 años hospitalizados por neumonía adquirida en la comunidad (NAC), 104 niños y 104 adultos sin sintomatología respiratoria, por al menos un mes previo al enrolamiento, cuyas muestras respiratorias se obtuvieron entre 2012-2016 en Santiago, se amplificó un fragmento del gen Rep de cyclovirus mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real con el reactivo Kapa PROBE® a partir de extractos de ácidos nucleicos totales obtenidos con el kit MasterPure (Epicenter®). Los amplificados se purificaron con el kit GEL/PCR Purification (FAVORGEN®) y se secuenciaron en Macrogen® (Corea). Las muestras secuenciadas se alinearon con BLAST y con el programa BioEdit® generándose una secuencia consenso. Se detectó CyCV en un 54,3% (57/105) de los adultos NAC; 17,3% (18/104) en adultos sin sintomatología respiratoria; 14,9% en niños con ERA (15/101) y en 48,1% (50/104) de niños sin ERA. Los 79 (84%) amplificados de 149pb tuvieron un 99% de identidad con la secuencia nucleotídica correspondiente de la proteína Rep de CyCV-ChileNPA. Por primera vez se detecta CyCV en muestra respiratoria de adultos, con una frecuencia significativamente mayor en pacientes con NAC que en adultos sin enfermedad respiratoria, lo que sugeriría la presencia de este virus en adultos con enfermedad respiratoria. Por otra parte, la detección en niños fue mayor a la publicada y similar entre casos con y sin ERA / Cyclovirus (CyCV) is a recently discovered infectious agent, with little DNA simple strand genetic material that codifies for a protein associated to the replication (Rep) and to the viral capside (Cap). It infects different eukaryotic organisms, including humans, where it has been described genetic variants with up to 15,7% prevalence in children with acute flaccid paralysis. CyCV genome has been detected in different biological samples in illness and asymptomatic population, with an unknown pathogenic role. In Chile, it has been studied in nasopharyngeal aspirate only in children with lower respiratory tract infections, detected in 3,3% and being described a new viral strain named CyCV-ChileNPA. The objective of this thesis was to detect and genotype the Chilean cyclovirus strain variants in children and adults, with and without respiratory infections. In 101 children under 1 year hospitalized by acute respiratory infection (ARI), 105 adults over 18 years hospitalized by community-acquired pneumonia (CAP), 104 children and 104 adults without respiratory symptomatology, for at least 1 month prior to enrollment, whose samples were obtained between 2012 and 2016 in Santiago, a fragment of the Rep gene of cyclovirus was amplified through a chain reaction of the polymerase in real time using Kapa PROBE® reagent from total nucleic acid extracts obtained with MasterPure kit (Epicenter®). The amplifiers were purified with the GEL/PCR Purification kit (FAVORGEN®) and sequenced in Macrogen® (Corea). The sequenced samples were aligned with BLAST and using BioEdit® program, generating a consensus sequence. CyCV was detected in 54,3% of adults with CAP; 17,3% (18/104) in adults without respiratory symptomatology; 14,9% in children with ARI (15/101) and 48,1% (50/104) children without ARI. All of the 79 amplified (84%) of 149pb had 99% of identity with nucleotide sequence corresponding to CyCV-ChileNPA Rep protein. It is the first time that CyCV is detected in respiratory samples in adults, with a significantly higher frequency in patients with CAP than in adults without respiratory disease, and it would suggest the presence of this virus in adults with respiratory disease. On the other hand, the detection in children was higher than the previously published and similar to cases with and without ARI

Fatty acid-binding protein 4 (FABP4) és una adipoquina secretada pel teixit adipós implicada en la regulació del metabolisme energètic i la inflamació. S'han detectat nivells elevats de FABP4 circulant en persones amb factors de risc cardiovascular i aterosclerosi, encara que no hi ha moltes dades sobre FABP4 i l'aterosclerosi en humans. Alguns estudis han demostrat que FABP4 té un efecte directe sobre els teixits perifèrics, concretament promovent la disfunció endotelial. La disfunció endotelial juga un paper clau en el desenvolupament de lesions ateroscleròtiques, així com la migració i proliferació de cèl·lules de múscul llis vascular. No obstant això, el mecanisme d'acció i funcions de FABP4 circulant són poc conegudes. La hipòtesi d'aquest treball és que FABP4 interacciona amb teixits perifèrics contribuint a la disfunció endotelial i remodelació vascular a partir de la interacció amb proteïnes de membrana plasmàtica, que actuarien com a elements d'ancoratge i/o receptors mitjançant rutes de senyalització intracel·lular, i/o internalització. Els nostres resultats indiquen que FABP4 exògena interactua específicament amb citoqueratina 1 (CK1) en les membranes cel·lulars endotelials i la seva inhibició farmacològica per BMS309403 disminueix lleugerament la formació d'aquests complexos. A més, FABP4 exògena travessa la membrana plasmàtica per entrar al citoplasma i nucli de cèl·lules endotelials (HUVECs). També hem demostrat que FABP4 exògena forma un complex amb CK1 en les cèl·lules del múscul llis vascular (HCASMCs) i que té un efecte directe induint la migració i proliferació de les HCASMCs a través de l'activació de la via de senyalització MAPK per la fosforilació de ERK1/2 i activació dels factors de transcripció nuclears c-myc i c-jun. Aquests resultats suggereixen que FABP4 circulant podria tenir un paper en el remodelat vascular i progressió de l'aterosclerosi. Aquestes dades contribueixen al nostre coneixement actual sobre el mecanisme d'acció de FABP4 circulant. / Fatty acid-binding protein 4 (FABP4) es una adipoquina secretada por el tejido adiposo implicada en la regulación del metabolismo energético y la inflamación. Se han detectado niveles elevados de FABP4 circulante en personas con factores de riesgo cardiovascular y aterosclerosis, aunque no hay muchos datos sobre FABP4 y aterosclerosis en humanos. Algunos estudios han demostrado que FABP4 tiene un efecto directo sobre los tejidos periféricos, concretamente promoviendo la disfunción endotelial. La disfunción endotelial juega un papel crucial en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas, así como la migración y proliferación de células de músculo liso vascular. Sin embargo, el mecanismo de acción y las funciones de FABP4 circulante son desconocidos. La hipótesis de este trabajo es que FABP4 interacciona con tejidos periféricos contribuyendo a la disfunción endotelial y remodelación vascular a partir de la interacción con proteínas de membrana plasmática, que actuarían como elementos de anclaje y/o receptores mediando rutas de señalización intracelular, y/o internalización. Nuestros resultados indican que FABP4 exógena interactúa específicamente con citoqueratina 1 (CK1) en las membranas celulares endoteliales y su inhibición farmacológica por BMS309403 disminuye ligeramente la formación de estos complejos. Además, FABP4 exógena atraviesa la membrana plasmática para entrar en el citoplasma y núcleo de células endoteliales (HUVECs). También hemos demostrado que FABP4 exógena también forma un complejo con CK1 en las células del músculo liso vascular (HCASMCs) y que tiene un efecto directo sobre la migración y proliferación de HCASMCs a través de la activación de la vía de señalización MAPK por la fosforilación de ERK1/2 y activación los factores de transcripción nucleares c-myc y c-jun. Estos resultados sugieren que FABP4 circulante podría tener un papel en el remodelado vascular y en la progresión de la aterosclerosis. Estos datos contribuyen a nuestro conocimiento actual sobre el mecanismo de acción de FABP4 circulante. / Fatty acid-binding protein 4 (FABP4) is an adipose tissue-secreted adipokine that is involved in the regulation of energetic metabolism and inflammation. Increased levels of circulating FABP4 have been detected in individuals with cardiovascular risk factors and atherosclerosis, although there is not much data on FABP4 in human atherosclerosis. Some studies have demonstrated that FABP4 has a direct effect on peripheral tissues, specifically promoting endothelial dysfunction. Endothelial dysfunction plays crucial roles in the development of atherosclerotic lesions as well as migration and proliferation of vascular smooth muscle cells. However, the mechanism of action and functions of circulating FABP4 are unknown. The hypothesis of this study is that circulating FABP4 has a direct effect on peripheral tissues. In particular at vessel wall level, FABP4 contributes to endothelial dysfunction and artery wall remodelling through interaction with endothelial plasma membrane proteins that act as anchoring elements and/or receptors mediating intracellular signalling, and/or FABP4 internalization. FABP4 acts on smooth muscle cells influencing cell migration and proliferation as well. Our results indicate that exogenous FABP4 interacts with specifically CK1 on endothelial cell membranes and the pharmacological FABP4 inhibition by BMS309403 decreases the formation of these complexes slightly. Furthermore, exogenous FABP4 crosses the plasma membrane to enter the cytoplasm and nucleus in HUVECs. In addition, we also demonstrated that exogenous FABP4 forms a complex with CK1 on vascular smooth muscle cells (HCASMCs) and has a direct effect of FABP4 on the migration and proliferation of HCASMCs through the activation of the ERK1/2 MAPK signalling pathway and activating the nuclear transcription factors c-myc and c-jun. Taking all these results together, it suggests that circulating FABP4 could have a role in vascular remodelling and atherosclerosis progression. These data contribute to our current knowledge regarding the mechanism of action of circulating FABP4.

Understanding how receptor-ligand interactions occur is a first step towards designing new drugs. The complete reconstruction of the binding process in a drug-receptor system provides all the physical-chemistry variables for rational design of inhibitors of a chosen target, an important step in drug discovery. Although very powerful, direct experimental observation of full binding processes is very hard to perform. In this thesis, by using high-throughput molecular dynamics in the distributed computing project GPUGRID.net and analysing the resulting data by Markov state models (MSM), we successfully estimated kinetics, thermodynamics and binding modes for different molecular systems. In the initial works, we focused on estimating the potency of inhibitor-protein complexes. In subsequent studies, we described more complex pictures of binding, taking into account the receptor dynamics or other binding molecules. The results are promising and establish the methodology as a very powerful tool in the first stages of the drug discovery pipeline. / Comprender las interacciones entre proteína y ligando es el primer paso para diseñar nuevos medicamentos. Llegar a reconstruir completamente este proceso de unión proporciona todas las variables físico-químicas para una optimización racional, un paso muy importante en el descubrimiento de fármacos. Pese a que esto ofrece muchas ventajas, todavía es complicado observar estos procesos experimentalmente. En esta tesis, utilizando simulaciones moleculares de alto rendimiento (HTMD) mediante el proyecto distribuido GPUGRID.net y análisis por Markov state models (MSM), hemos obtenido datos cinéticos, termodinámicos y modos de unión para varios sistemas. En los primeros trabajos nos centramos en estimar la afinidad entre complejos inhibidor-proteína. En trabajos posteriores, logramos caracterizar completamente rutas de unión del ligando teniendo en cuenta los confórmeros de la proteína u otros ligandos presentes. Los resultados son prometedores y establecen la utilidad de HTMD en las primeras fases de descubrimiento de fármacos

Mitochondrial dysfunction arising from aberrant mitochondrial nucleic acid homeostasis has been associated with various pathologies. In this thesis, we aim to characterize a putative mitochondrial exonuclease, EXD2, and the consequences of its loss in cell metabolism. For that purpose we use three approaches: 1) Biochemical assays with bacterially purified EXD2 to study its enzymatic activity, 2) In vitro experiments with cell lines to study the phenotype of cells with altered EXD2-levels, and, 3) In vivo experiments with a mouse xenograft model and D.melanogaster to study the consequences of EXD2-loss in tumors and at the organismal level. Our work shows, that EXD2 is a uniquely versatile mammalian exonuclease able to bind and degrade various DNA and RNA substrates. We demonstrate that loss of EXD2 in cancer cells leads to alterations in mtDNA, various metabolic changes and aberrant hypoxia signaling. We also describe how, in vivo, this leads to inhibition of breast tumor growth and increased lifespan in fruitflies. Taken together, our observations provide a link between mitochondrial nucleic acid maintenance and large-scale metabolic alterations influencing tumor growth and aging. / La disfunción mitocondrial que surge de la homeostasis de ácido nucleico mitocondrial aberrante se ha asociado con varias patologías. En esta tesis, se pretende caracterizar una exonucleasa putativo mitocondrial, EXD2, y las consecuencias de su pérdida en el metabolismo celular. Para ello utilizamos tres enfoques: 1) ensayos bioquímicos con EXD2 purificado de bacterias para estudiar su actividad enzimática, 2) los experimentos in vitro con líneas celulares para estudiar el fenotipo de las células con niveles de EXD2 alterados, y, 3) experimentos in vivo con modelo de xenotrasplante de ratón y D.melanogaster para estudiar las consecuencias de perdida de EXD2 en los tumores y en el nivel del organismo. Nuestro trabajo muestra que EXD2 es una exonucleasa mamíferos excepcionalmente versátil capaz de unirse y degradar diversos sustratos de ADN y ARN. Se demuestra que la pérdida de EXD2 en las células del cáncer conduce a alteraciones en el ADN mitocondrial, diversas alteraciones metabólicas y de señalización hipoxia aberrante. También describimos cómo, in vivo, esto conduce a la inhibición del crecimiento del tumor de mama y aumento de la vida útil en moscas de la fruta. En conjunto, nuestras observaciones proporcionan un enlace entre el mantenimiento de ácidos nucleicos mitocondriales y de gran escala alteraciones metabólicas que influyen en el crecimiento del tumor y el envejecimiento.

In response to fluctuations in the environment, all living organisms have the ability to sense, respond and adapt to the new conditions. In budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) there is a massive and rapid reorganization of the transcriptional program in response to a stressful situation, which is governed by different signaling pathways, transcription factors, chromatin remodelers and histone modifiers. Many examples of histone posttranslational modifications (PTM) have been associated with transcriptional activation or repression under normal growth conditions, however little is known about the role of histones in the cellular adaptive response upon stress. In this study, we systematically analyze by high throughput screens cellular growth and transcription initiation of stress-responsive genes in 569 histone point mutants upon heat and osmostress. These screens provide a novel global map of the histone residues required for cellular survival and transcriptional regulation in response to heat and osmostress. Moreover, we show that the histone residues required in response to stress depend on the type of gene and/or the type of stress. Furthermore we characterized some examples of newly identified histone marks from histones H3 and H4 involved in the transcriptional regulation upon different stress conditions. / Todos los organismos vivos tienen la capacidad de adaptarse a condiciones adversas en el medio en el que viven para sobrevivir. En la levadura Saccharomyces cerevisiae se produce una rápida reorganización en el patrón transcripcional en respuesta a una situación de estrés. Esta reorganización transcripcional está regulada por diferentes vías de señalización, factores de transcripción, complejos remodeladores de cromatina y enzimas modificadoras de histonas. Numerosos ejemplos de modificaciones postraduccionales en histonas han sido asociados con la activación o la represión génica en condiciones normales de crecimiento. Sin embargo, se conoce muy poco sobre el papel de las histonas en la adaptación celular frente a una situación de estrés. En este trabajo, hemos analizado de forma sistemática el crecimiento celular y el inicio de la transcripción de genes que se inducen en respuesta a estrés en 569 mutantes puntuales de histonas en condiciones de estrés térmico y osmótico. Nuestros resultados proporcionan un mapa global de los residuos de las histonas esenciales para la supervivencia celular y la activación transcripcional en respuesta a estrés térmico y osmótico. Asimismo, estos análisis revelan que existe una especificidad respecto a los residuos de las histonas que son necesarios en respuesta a estrés dependiendo del tipo de gen y/o del tipo de estrés. Además, en este trabajo hemos caracterizado algunos ejemplos de residuos en las histonas H3 y H4 que tienen un papel importante en la regulación transcripcional en respuesta a estrés.