A enzima acetilcolinesterase (AChE) tem sido amplamente aplicada no desenvolvimento de biossensores para detecção de pesticidas. No entanto, a aplicação de tais dispositivos é limitada devido à falta de robustez, que está associada com a baixa estabilidade enzimática, além de seu alto custo. Uma alternativa às enzimas é a utilização de moléculas sintéticas que mimetizem o comportamento enzimático, com menor custo e maior estabilidade; tais moléculas são denominadas moléculas biomiméticas. Neste trabalho são apresentados três potenciais catalisadores: o ácido [4-(1E)etanohidrazonoil]benzóico, o iodeto de pralidoxima (2-PAM) e o polímero polihidroxamicalcanoato (PHA); com grupos funcionais alfa nucleófilos hidrazona, oxima e ácido hidroxâmico, respectivamente. Tais moléculas foram avaliadas baseando-se em dois critérios para classificação de biomiméticos da AChE: 1) catálise da hidrólise do substrato acetiltiocolina (ATCh) e 2) interação com pesticida organofosforado. O método espectrofotométrico de Ellman revelou que o polímero PHA foi a molécula mais eficiente, uma vez que a constante de velocidade de segunda ordem obtida foi de 13867 mol-1 L s-1, 5 vezes superior a da 2-PAM e 232 vezes a da hidrazona. Posteriormente, todas as moléculas foram avaliadas por método espectrofotométrico em relação à interação com o organofosforado paraoxon. Apenas o PHA apresentou interação nas condições estudadas. Cálculos teóricos mostraram como ocorre a aproximação entre o PHA e ATCh, e com o paraoxon. Diante dos resultados obtidos, o PHA foi a molécula biomimética escolhida para aplicação no sensor eletroquímico para detecção de organofosforados. Primeiramente, o PHA foi imobilizado na superfície de um eletrodo impresso descartável a partir da formação de uma blenda com o polímero polietileno glicol metil éter, evitando sua solubilização. A oxidação da tiocolina formada a partir da catálise do ATCh realizada pelo PHA imobilizado foi verificada em 0,46 V vs Ag/AgCl, por voltametria de pulso diferencial. A equação obtida a partir da curva de calibração referente ao intervalo de concentração de paraoxon de 1,0 a 10,0 µmol L-1 foi I(%) = [4,8x106 C (mol L-1) + 0,8169]×100 (R2 = 0,99969), com limite de detecção de 3,63x10-7 mol L-1. Amostras de água de abastecimento foram analisadas, com concentrações adicionadas de paraoxon de 3,0; 6,0 e 8,0 µmol L-1, com recuperação de 115%; 106% e 94,5%, respectivamente. Os resultados apresentados mostraram que foi possível desenvolver um sensor eletroquímico biomimético para detecção de pesticida paraoxon. / Acetylcholinesterase enzyme (AChE) has been widely applied in biosensor development for pesticide detection. However, the application of those biosensors is limited due to their lack of robustness associated with low enzymatic stability and AChE high cost. An alternative to enzymes, it is the use of synthetic molecules which mimic enzymatic behavior, besides its low cost and superior stability, those are classified as biomimetic molecules. In this work is presented three potential catalysts: [4-(1E)ethanehydrazonoyl]benzoic acid, pralidoxime iodide (2-PAM), and polyhydroxamicalkalnoate polymer (PHA) with alpha nucleophile functional groups, such as hydrazone, oxime, and hydroxamic acid, respectively. The aforementioned molecules were evaluated based on two criteria for classification as AChE biomimetic: 1) catalysis of acetylthiocholine substrate (ATCh) hydrolysis and 2) interaction with organophosphorus pesticide. Spectrophotometrical Ellman´s method revealed that PHA polymer was the most efficient one, since its second order rate constant was 13867 mol-1 L s-1, which was 5 times superior than 2-PAM one and 232 times higher than hydrazone. Then, each molecule was analyzed through spectrophotometric method to verify the interaction with paraoxon organophosphorus pesticide. Only the PHA exhibited such interaction in the studied conditions. Theoretical calculations showed how the approach between PHA and ATCh, and also with paraoxon occurred. Regarding the obtained results, PHA was the chosen biomimetic molecule to be applied in the electrochemical sensor for organophosphorus detection. First of all, PHA was immobilized on the surface of disposable screen printed electrode through blend formation with polyethylene glycol methyl ether (mpEG), avoiding PHA dissolution. The oxidation of thiocholine generated towards ATCh catalysis performed by immobilized PHA was verified at 0.46 V vs Ag/AgCl by differential pulse voltammetry. The linear equation obtained through calibration curve for paraoxon concentration range of 1.0 to 10.0 µmol L-1 was I(%) = [4.8x106 C (mol L-1) + 0.8169]×100 (R2 = 0.99969), with limit of detection of 3.63x10-7 mol L-1. Water supply samples were analyzed considering the added paraoxon concentrations of 3.0; 6.0 e 8.0 µmol L-1, recovering 115%; 106% and 94.5%, respectively. The presented results showed that a biomimetic electrochemical sensor was successfully developed for detection of paraoxon organophosphorus pesticide.

A enzima acetilcolinesterase (AChE) tem sido amplamente aplicada no desenvolvimento de biossensores para detecção de pesticidas. No entanto, a aplicação de tais dispositivos é limitada devido à falta de robustez, que está associada com a baixa estabilidade enzimática, além de seu alto custo. Uma alternativa às enzimas é a utilização de moléculas sintéticas que mimetizem o comportamento enzimático, com menor custo e maior estabilidade; tais moléculas são denominadas moléculas biomiméticas. Neste trabalho são apresentados três potenciais catalisadores: o ácido [4-(1E)etanohidrazonoil]benzóico, o iodeto de pralidoxima (2-PAM) e o polímero polihidroxamicalcanoato (PHA); com grupos funcionais alfa nucleófilos hidrazona, oxima e ácido hidroxâmico, respectivamente. Tais moléculas foram avaliadas baseando-se em dois critérios para classificação de biomiméticos da AChE: 1) catálise da hidrólise do substrato acetiltiocolina (ATCh) e 2) interação com pesticida organofosforado. O método espectrofotométrico de Ellman revelou que o polímero PHA foi a molécula mais eficiente, uma vez que a constante de velocidade de segunda ordem obtida foi de 13867 mol-1 L s-1, 5 vezes superior a da 2-PAM e 232 vezes a da hidrazona. Posteriormente, todas as moléculas foram avaliadas por método espectrofotométrico em relação à interação com o organofosforado paraoxon. Apenas o PHA apresentou interação nas condições estudadas. Cálculos teóricos mostraram como ocorre a aproximação entre o PHA e ATCh, e com o paraoxon. Diante dos resultados obtidos, o PHA foi a molécula biomimética escolhida para aplicação no sensor eletroquímico para detecção de organofosforados. Primeiramente, o PHA foi imobilizado na superfície de um eletrodo impresso descartável a partir da formação de uma blenda com o polímero polietileno glicol metil éter, evitando sua solubilização. A oxidação da tiocolina formada a partir da catálise do ATCh realizada pelo PHA imobilizado foi verificada em 0,46 V vs Ag/AgCl, por voltametria de pulso diferencial. A equação obtida a partir da curva de calibração referente ao intervalo de concentração de paraoxon de 1,0 a 10,0 µmol L-1 foi I(%) = [4,8x106 C (mol L-1) + 0,8169]×100 (R2 = 0,99969), com limite de detecção de 3,63x10-7 mol L-1. Amostras de água de abastecimento foram analisadas, com concentrações adicionadas de paraoxon de 3,0; 6,0 e 8,0 µmol L-1, com recuperação de 115%; 106% e 94,5%, respectivamente. Os resultados apresentados mostraram que foi possível desenvolver um sensor eletroquímico biomimético para detecção de pesticida paraoxon. / Acetylcholinesterase enzyme (AChE) has been widely applied in biosensor development for pesticide detection. However, the application of those biosensors is limited due to their lack of robustness associated with low enzymatic stability and AChE high cost. An alternative to enzymes, it is the use of synthetic molecules which mimic enzymatic behavior, besides its low cost and superior stability, those are classified as biomimetic molecules. In this work is presented three potential catalysts: [4-(1E)ethanehydrazonoyl]benzoic acid, pralidoxime iodide (2-PAM), and polyhydroxamicalkalnoate polymer (PHA) with alpha nucleophile functional groups, such as hydrazone, oxime, and hydroxamic acid, respectively. The aforementioned molecules were evaluated based on two criteria for classification as AChE biomimetic: 1) catalysis of acetylthiocholine substrate (ATCh) hydrolysis and 2) interaction with organophosphorus pesticide. Spectrophotometrical Ellman´s method revealed that PHA polymer was the most efficient one, since its second order rate constant was 13867 mol-1 L s-1, which was 5 times superior than 2-PAM one and 232 times higher than hydrazone. Then, each molecule was analyzed through spectrophotometric method to verify the interaction with paraoxon organophosphorus pesticide. Only the PHA exhibited such interaction in the studied conditions. Theoretical calculations showed how the approach between PHA and ATCh, and also with paraoxon occurred. Regarding the obtained results, PHA was the chosen biomimetic molecule to be applied in the electrochemical sensor for organophosphorus detection. First of all, PHA was immobilized on the surface of disposable screen printed electrode through blend formation with polyethylene glycol methyl ether (mpEG), avoiding PHA dissolution. The oxidation of thiocholine generated towards ATCh catalysis performed by immobilized PHA was verified at 0.46 V vs Ag/AgCl by differential pulse voltammetry. The linear equation obtained through calibration curve for paraoxon concentration range of 1.0 to 10.0 µmol L-1 was I(%) = [4.8x106 C (mol L-1) + 0.8169]×100 (R2 = 0.99969), with limit of detection of 3.63x10-7 mol L-1. Water supply samples were analyzed considering the added paraoxon concentrations of 3.0; 6.0 e 8.0 µmol L-1, recovering 115%; 106% and 94.5%, respectively. The presented results showed that a biomimetic electrochemical sensor was successfully developed for detection of paraoxon organophosphorus pesticide.

Submitted by RAPHAEL MAZZINE BARBOSA DE OLIVEIRA (mazzine.r@gmail.com) on 2018-08-31T12:54:04Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_RMAZZINE.pdf: 2481284 bytes, checksum: e17b453dc770c4f6b899c9c0a5de342a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-09-05T12:38:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_rmb_me_araiq_int.pdf: 2195098 bytes, checksum: 013fbe713d5edbed6ff4d629e660b906 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-05T12:38:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_rmb_me_araiq_int.pdf: 2195098 bytes, checksum: 013fbe713d5edbed6ff4d629e660b906 (MD5) Previous issue date: 2018-08-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Desde a primeira descrição de biossensor reportada por Clark e Lyons em 1962, houve um extenso trabalho no desenvolvimento e aprimoramento de novas técnicas de biossensoriamento para detecção de biomarcadores com relevância médica. Destaca-se nesse processo o estudo de superfície de eletrodos, pois esse influencia diretamente em aspectos como; sensibilidade, estabilidade e qualidade do sinal. Portanto, este projeto consiste em avaliar comparativamente três superfícies de eletrodos baseadas em nanoestruturas contendo nanopartículas de azul da Prússia, funcionando com sonda redox do sistema, e materiais carbonáceos (como óxido de grafeno e nanotubos de carbono) para aplicação em biossensores. Foram avaliados aspectos como composição, características capacitivas redox e estabilidade de sinal. A técnica de análise utilizada é a espectroscopia de capacitância eletroquímica (ECE) que apresenta vantagens como não usar amplificadores de sinal (sondas redox) em solução, configuração esta, importante para métodos de diagnóstico point-of-care. Das superfícies analisadas, a composta por nanopartículas de azul da Prússia e óxido de grafeno (PBNP+GO) apresentou os melhores parâmetros de estabilidade e compatibilidade com os aspectos teóricos da técnica de ECE, sendo então selecionada para realização de testes de biossensoriamento que, através da funcionalização da superfície com anticorpos Anti-IL-6, detectaram seletivamente a presença do biomarcador IL-6. / Since the first description of biosensor reported by Clark and Lyons in 1962, numerous works related to the development and enhancement of novel medical biosensing techniques have been published. In that context, it must be highlighted the study of electrode surfaces as it has direct influence in aspects like; sensitivity, stability and signal quality. Therefore, this project aims to evaluate three electrode surfaces based on nanostructures with Prussian blue nanoparticles, as redox probe, and carbonaceous materials (like graphene oxide and carbon nanotubes) and their application in biosensors. It was evaluated aspects like composition, redox capacitive characteristics and signal stability. The electrochemical capacitance spectroscopy technique (ECE) was used as it offers several advantages like no need of signal amplifiers (redox probes) in solution and, then, making this technique more adequate for point-of-care diagnosis. Among the analysed surfaces, the one composed by Prussian blue nanoparticles and graphene oxide (PBNP+GO) was identified as the best surface in terms of stability and compatibility to the theoretical aspects of ECE. Therefore, that structure was selected to further biosensing essays, by functionalizing the surface with Anti-IL-6 antibodies, that indicated the selective detection of the IL-6 biomarker. / 1583843

Orientador: Prof. Dr. Pablo Alejandro Fiorito / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2015. / Nos últimos anos, houve uma grande expansão na busca e desenvolvimento de novos dispositivos voltados para a área de biossensores. Tendo em vista esta grande demanda relacionada ao desenvolvimento de novos dispositivos para detecção de determinadas biomoléculas, como ácidos desoxirribonucleicos (DNA), este trabalho descreve o desenvolvimento de um método para modificação química reversível de superfícies de microcantilevers que são aplicados em estudos de biossensores nanomecânicos. Dessa maneira, para a elaboração desta metodologia foi utilizado o conceito de Click Chemistry aliado à atividade redox de compostos de telúrio junto a grupos tióis, grupo este, que está presente em muitas biomoléculas aplicadas em processos de detecção em biossensores. A parte inicial deste trabalho consistiu na síntese de teluretos bis-arílicos não simétricos, no qual foi possível obter um rendimento isolado para o telureto de 3-nitrofenil 4-metoxifenila de 90%. Após a obtenção deste composto, foram realizadas mais duas etapas de síntese para obtenção do ácido 4-((3-((4-metoxifenil)teluro)fenil)amino)-4-oxobutanóico sendo obtido um rendimento isolado de 60%. Este derivado de telúrio foi imobilizado sobre a superfície de microcantilevers sendo possível verificar a sua atividade redox junto à biomoléculas tioladas de DNA. Paralelamente foi realizado um estudo de viabilidade para troca de biomoléculas que atuam como "receptores" no processo de detecção da fita complementária de DNA. Este resultado se torna relevante, pois possibilita realizar a troca do sistema de detecção a partir da regeneração da superfície além de demonstrar a eficácia da proposta deste trabalho. / In recent years, it has been a great expansion in the search and development of new devices focused on biosensors area. In view of this high demand related to the development of new devices for the detection of certain biomolecules, like deoxyribonucleic acid (DNA) ones, this work describes the development of method for reversible chemical modification of surfaces of microcantilevers are used in biosensors nanomechanical studies. Thus, for the preparation of this methodology it was used the concept of Click Chemistry together with the redox activity of tellurium compounds with thiol groups, which is present in many biomolecules applied to detection processes in biosensors. The initial part of this work involved the synthesis of unsymmetrical diaryl tellurides, in which it was possible to obtain an isolated yield for the telluride of 3-nitrophenyl 4- (4-methoxyphenyl)(3-nitrophenyl)tellane of 90%. After obtaining this compound two more synthesis steps for obtaining acid 4 - ((3 - ((4-methoxyphenyl) teluro) phenyl) amino) -4-oxobutanoic acid were performed being obtained an isolated yield of 60%. The tellurium derivative was immobilized on the surface of microcantilevers being possible to verify its redox activity by biomolecules (DNA) with thiol groups. At the same time it carried out a feasibility study to exchange of biomolecules that act as "receptors" in the detection process of complementary DNA. This result is significant because it enables performing the exchange of the detection system from the surface of regeneration besides demonstrating the effectiveness of this proposal work.

O transistor de efeito de campo de porta estendida e separada (SEGFET) é um dispositivo alternativo ao tradicional transistor de efeito de campo seletivo a íons (ISFET). A grande vantagem desse dispositivo se refere ao seu fácil processamento, ou seja, se restringe somente a manipulação do eletrodo de porta, evitando processos convencionais de microeletrônica. Neste sentido, sensores iônicos e biossensores podem ser facilmente implementados combinando materiais de reconhecimento químico e/ou biológico. Por sua vez, a técnica de fabricação de filmes finos camada por camada (layer-by-layer, LbL) se mostra versátil para manipulação de diversos tipos de materiais em nível molecular. Materiais orgânicos e inorgânicos podem ser automontados em substratos sólidos por meio da simples adsorção eletrostática formando compósitos com propriedades únicas com o objetivo de serem aplicados em sensores ou biossensores. Neste trabalho, o conceito de dispositivo SEGFET foi combinado com a técnica LbL por meio da manipulação de materiais orgânicos (polieletrólitos, dendrímeros e polianilina) e inorgânicos (TiO2 e V2O5) nanoparticulados a fim de se obter novos sensores de pH e biossensores para a detecção de glicose e uréia, dois importantes analitos de interesse clínico. Numa primeira etapa, diferentes filmes LbL foram produzidos, caracterizados e testados como camada sensível (porta estendida) em dispositivos SEGFETs. Todos os sistemas estudados se mostraram promissores como sensores de pH, ou seja, com uma sensibilidade próxima do valor teórico sugerido pela equação de Nernst (59,15 mV.pH-1). Esses resultados podem ser atribuídos à natureza anfotérica do material da última camada no filme LbL. Numa segunda etapa, as enzima glicose oxidase (GOx) e urease foram convenientemente imobilizadas nos filmes LbL. Pelo fato dessas enzimas gerarem ou consumirem prótons durante a catálise da reação, os filmes LbL modificados enzimaticamente foram utilizados em biossensores de glicose e uréia, apresentando eficiente detecção. Assim, a união de dispositivos SEGFET com a técnica de automontagem se mostrou promissora para construção de sensores e biossensores eficientes e de baixo custo. / Separative extended gate field-effect transistor (SEGFET) device is an alternative to the conventional ion-sensitive field-effect transistor (ISFET). The great advantage of SEGFET refers to its easy processing, i.e., it is limited under only manipulation of the gate electrode, avoiding the conventional microelectronic processes. In this way, ion sensors and biosensors can be easily implemented combining chemical and/or biological recognition materials. In turn, the layer-by-layer (LbL) technique shows be versatile for handling various types of materials at molecular level. In this thesis, the concept of SEGFET device was combined with the LbL technique through the manipulation of organic (polyelectrolytes, dendrimers and poly (aniline)) and inorganic materials (TiO2 and V2O5 nanoparticles) in order to get new pH sensors and biosensors for the detection of glucose and urea, two important analytes of clinical interest. In a first step, different LbL films were produced, characterized and tested as the sensitive layer (extended gate) in SEGFETs devices. All studied systems were promissing as pH sensors, i.e., with a sensitivity close to the theoretical value suggested by Nernst equation (59.15 mV.pH-1). These results can be attributed to the amphoteric nature of the material in the last layer of the LbL films. In a second step, glucose oxidase (GOx) and urease enzymes were conveniently immobilized onto LbL films. Because these enzymes generate or consume protons during catalysis of the reaction, the enzymatically modified LbL films were used in biosensors for glucose and urea, with efficient detection. Thus, the union of SEGFET devices with the LbL technique is promising to building up efficient and low-cost sensors and biosensors.

A manipulação de materiais em escala nanométrica representa uma das fronteiras em nanociência e nanotecnologia, devido à possibilidade de controle de propriedades específicas do material. No caso de materiais biológicos, em particular, a manipulação e imobilização na forma de filmes ou camadas ultrafinas é crucial para seu emprego em dispositivos biotecnológicos. Neste trabalho, objetivou-se o estudo de detecção de diferentes hormônios tireoidianos (HTs) e análogos a partir da imobilização da região LBD do receptor de hormônio tireoidiano humano TRTRβ1 em um eletrodo interdigitado, para o desenvolvimento de um biossensor capacitivo. Este sistema consiste em um arranjo estrutural na forma de filme fino capaz de distinguir a interação específica receptor-ligante de outras interações possivelmente interferentes, visando a quantificação dos níveis de HTs. Para isto, a técnica de SAMs (Self-Assembled Monolayers) foi empregada, por permitir um alto controle da espessura e ordenamento molecular dos filmes, assim como a preservação das atividades das biomoléculas. Análises espectroscópicas e morfológicas foram realizadas para o estudo de adsorção das biomoléculas no filme. As interações específicas receptor-ligante foram avaliadas por meio de respostas elétricas (impedância) do biossensor contendo o TRβ1-LBD imobilizado em um filme orgânico ultrafino, e também por SPR (Surface Plasmon Resonance). Os resultados mostraram a capacidade dos eletrodos contendo TRTRβ1-LBD de detectar e diferenciar entre diferentes HTs em concentrações da ordem de nanomolar, compatível com níveis fisiológicos, evidenciando o grande potencial de aplicação para este sistema no diagnóstico e tratamento de disfunções tireoidianas. / Manipulation of materials at the nanoscale represents one of the frontiers in nanoscience and nanotechnology, mainly due to the possibility of specific controlling, improved properties, not observed if conventional bulk processing is applied. For biomolecules, in particular, processing via immobilization in the form of nanostructured films has allowed their use in biotechnological applications and devices. In this master dissertation, we aimed at investigating the immobilization of the LBD domain of human thyroid hormone receptor TRTRβ1 on interdigitated electrodes, to be used as capacitive biosensors for thyroid hormones (THs) and analogues detection. The nuclear receptors were immobilized via SAMs (Self-Assembled Monolayers), since this technique allows a high control of molecular order and thickness of the films, as well as the preservation of biological activities. Spectroscopic and morphological analyses were performed to investigate the adsorption of biomolecules on the nanostructured film. The interactions between receptor - ligand were also evaluated by means of electrical response (impedance) and SPR (Surface Plasmon Resonance). The bioelectrodes containing immobilized TRTRβ1 were capable of detecting and distinguishing among different HTs, including T3, T4, TRIAC and GC-1 at concentrations down to nanomolar, compatible with physiological levels. The latter results point to the possibility of applications of the bioelectrodes in the diagnosis and treatment of thyroid dysfunctions.

Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2016-04-01T16:41:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Priscila.pdf: 3187592 bytes, checksum: a982eac78d937dd89e264fd88f2d7be9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-01T16:41:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Priscila.pdf: 3187592 bytes, checksum: a982eac78d937dd89e264fd88f2d7be9 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / FACEPE / O câncer de próstata (CaP) é um dos tipos de tumor maligno mais incidente na população mundial, sendo também uma das principais causas de mortalidade por câncer. Geralmente ocorre em homens idosos e não é percebido em seus estágios iniciais. Para detectar o câncer de próstata, é de grande importância a avaliação pela dosagem sérica do antígeno específico da próstata (PSA), considerado o marcador tumoral da próstata. Porém, alterações nos níveis séricos do PSA são observadas também em doenças benignas da próstata, reduzindo a sensibilidade e especificidade do teste para se obter o diagnóstico. Uma peculiaridade do câncer que pode ser relevante no diagnóstico é a alteração no padrão de glicosilação de glicoproteínas secretadas e de superfície celular. A identificação de mudanças na expressão de glicanos permite a detecção precoce de vários tipos de câncer, inclusive o câncer de próstata. As lectinas são ferramentas empregadas para detectar tais alterações, graças à propriedade de reconhecer carboidratos com especificidade. Uma grande novidade no campo de estudos com lectinas é o desenvolvimento de pequenos dispositivos conhecidos como biossensores eletroquímicos baseados em lectinas para análise do perfil de glicoproteínas em processos fisiopatológicos. Esses dipositivos são elaborados utilizando eletrodos geralmente modificados com polímeros e nanomateriais, onde a lectina pode ser imobilizada e sua interação com o carboidrato quantificada com elevada sensibilidade e em tempo real. Neste trabalho foi realizado um estudo bioeletroquímico da lectina de Cratylia mollis (CramoLL) para caracterizar o padrão de glicosilação em soros de indivíduos saudáveis, com hiperplasia benigna da próstata (HBP) e CaP, utilizando biossensor eletroquímico baseado em CramoLL, imobilizada sobre eletrodo de carbono vítreo modificado com o polímero catiônico poli-Llisina (PLL) e nanotubos de carbono (NTC). Análises eletroquímicas e ópticas mostraram a formação de um filme de PLL e NTC na superfície eletródica, onde os NTC proporcionaram um aumento na área sensora de 71,2%, e nos valores de corrente anódica e catódica, e aumentaram a estabilidade da superfície, graça às propriedades físico-químicas dessas nanoestruturas. Foram investigadas as concentrações ótimas de PLL e NTC. CramoLL foi imobilizada com sucesso, numa concentração ótima de 200 μg mL-1. A interação entre CramoLL e metil-α-D-manopiranose (MeαMan)/ fetuína foi confirmada utilizando a técnica de voltametria de onda quadrada, mostrando que a lectina manteve sua atividade biológica após imobilização. Foram obtidas curvas de calibração para diferentes concentrações dos glicanos, com faixa linear de 0,96 e 38,4 μg mL-1 de MeαMan (r= 0,982, p < 0,001) e limite de detecção (LD) de 0,04 μg mL-1e de 0,5 a 25 μg mL-1 de fetuína (r= 0,994, p< 0,001) e LD = 0,05 μg mL-1. O biossensor baseado em CramoLL foi exposto à amostras de soro de indivíduos sadios (controle), com HBP e CaP com escores de Gleason 6, 7 e 9 para analisar a interação entre CramoLL e glicoproteínas dos soros de cada grupo. Os sinais de correntes obtidos por voltametria de onda quadrada mostraram diferenças significativas entre o grupo controle e os grupos HBP, CaP escore 6 e 7; entre HBP e CaP escore 6; entre CaP escore 6 e os grupos CaP escore 7 e 9 e entre CaP escore 7 e CaP 9. O potencial de reconhecimento da lectina permitiu identificar alterações de glicosilação associadas ao câncer de próstata e distinguir das amostras não cancerosas e entre os diferentes escores de CaP. Esses resultados sugerem a possibilidade de aplicação em estudos futuros envolvendo caracterização de glicosilação em câncer. / Prostate cancer (PCa) is a most frequently type of malignancy in global population and is also a major cause of cancer mortality. It usually occurs in older men and is not perceived in early stages. To detect the prostate cancer, this is of great importance the evaluation of serum prostate specific antigen (PSA), considered the prostate tumor marker. But, changes in serum PSA levels are also observed in benign prostate diseases, reducing the sensitivity and specificity of the test to obtain the diagnosis. A peculiarity of cancer that may be relevant in the diagnosis is the change in the pattern of glycosylation in glycoproteins secreted and cell surface. The identification of changes in the expression of glycans permits detection early of various types of cancer, including prostate cancer. Lectins are tools used to analyze such changes in diseases, through to the property to recognize carbohydrates with specificity. A great innovation in the field of studies with lectins is the development of smalls devices known as electrochemical biosensors based on lectins for analysis of the glycoproteins profile in physiopathological processes. These devices are typically produced using modified electrodes containing polymers, nanomaterials, where in the lectin may be immobilized and the interaction with carbohydrate quantified with high sensitivity in real time. This work presents a bioelectrochemical study of lectin of Cratylia mollis (CramoLL) to characterize the glycosylation pattern in sera from healthy individuals, with benign prostatic hyperplasia (BPH) and PCa, using electrochemical biosensor based on CramoLL immobilized on glassy carbon electrode modified with the polymer cationic poly-L-lysine (PLL) and carbon nanotubes (CNT). Electrochemical and optical analysis showed the formation of a PLL and CNT film on the electrode surface, where the CNT provided an increase in sensor area of 71.2%, and the anodic and cathodic current values, and increased stability of the surface due to the physical and chemical properties of these nanostructures. The optimal concentrations of PLL and NTC were investigated. CramoLL was successfully immobilized at a great concentration of 200 μg mL-1. The interaction between CramoLL and methyl-α-Dmannopyranose (MeαMan)/ fetuin was confirmed using voltammetry square wave technique, showing that the lectin retained its biological activity after immobilization. Calibration curves were plotted for different concentrations of the glycans with a linear range of 0.96 and 38.4 μg mL-1 for MeαMan (r = 0.982, p <0.001) and limit of detection (LOD) of 0.04 μg mL-1, and from 0.5 to 25 μg mL-1 for fetuin (r = 0.994, p <0.001) and LOD = 0.05 μg mL-1. The CramoLL-based biosensor was exposed to serum samples from healthy individuals (control), and patients with BPH and PCa with Gleason scores of 6, 7 and 9 to analyze the interaction between CramoLL and glycoproteins of sera from each group. The signals of current by square wave voltammetry show significants differents between the control group and the groups of BPH, PCa score 6 and 7; between BPH and PCa score 6; between PCa score 6 and groups PCa score 7 and 9 and between PCa score 7 ad PCa score 9. The potential of specific recognition of the lectin allowed to identify changes in glycosylation associated at prostate cancer and to distinguish of non-cancerous samples and between the differents scores of PCa. The results suggest the possibility of using in future studies involved characterization of glycosylation in cancer.

In this work we developed an electrochemical sensor modified with multi-walled carbon nanotubes and 5-nitroindole (5-NI) for the simultaneous determination of ascorbic (AA) and uric (UA) acids in urine and serum samples and a biosensor based on dsDNA for determination of 3-nitro-L-tyrosine ethyl ester (3NO2TEE), as a biomarker of biological peroxynitration. The polymer of 5-NI was electrogenerated in situ on the carbon nanotubes deposited on glassy carbon electrode (GCE). Thereafter, the aromatic nitro group, present in the molecule, was reduced, generating a hydroxylamine/nitroso redox couple, then used for detection and quantification of the analytes in the biological samples. The electrochemical behavior of the modified electrodes were studied using cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry and chronoamperometry, which were used for the detection of the analytes and to obtain the kinetic parameters and the analytical characterization of the platforms. The chronoamperometric studies were performed in order to obtain more information about the redox processes between AA and the sensor, since it proved to be an electrocatalytic process. Thus, by means of graphs and Cottrell equations, it was possible to obtain values for the diffusion coefficient (DAA) and the catalytic constant (kcat) for the AA electrocatalytic oxidation. The values for DAA and kcat, determined for AA were 4.2 x10-6 cm-2 s-1 and 1.1 x 106 M-1 s-1, respectively. The platform for the detection of AA e AU showed good sensitivity and stability in urine and serum samples, with LOD of 1.9 mol L-1 for AA and 2.1 mol L-1 for UA. The analytical performance obtained for the nanostructured platform GCE/MWCNT/poly-5-NID justifies its use as a sensor for the simultaneous determination of AA and UA. Studies of 3NO2TEE in protic media (pH 4.5 acetate buffer and pH 7.4 and 10.0, in phosphate buffer) and in aprotic media (DMF/TBAPF6, 0.1 mol L-1), using Pt and glassy carbon electrodes, were necessary before the construction of the CT-DNA biosensor. The spectrolectrochemistry of 3NO2TEE, held in aprotic media was useful for rationalizing the electrochemical behavior of 3NO2TEE and intermediates generated during the reduction. For the biosensor construction, the amount of dsDNA, the conditioning time for reduction of the analyte, the pH value, on GCE, were optimized. The developed biosensor was used to determine the concentration of 3NO2TEE and showed a linear range from 60 to 320 nmol L-1 and LOD and LOQ of 58 nmol L-1 and 200 nmol L-1, respectively. These results indicate that the prepared sensor and biosensor were effective for the detection of substances with biological interest. (P.S.: some expressions out of formatting) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho foram desenvolvidos um sensor eletroquímico modificado com nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT) e 5-nitroindol (5-NI) para determinação simultânea dos ácidos ascórbico (AA) e úrico (AU), em amostras de urina e soro, e um biossensor à base de dsDNA para determinação do éster etílico da 3-nitro-L-tirosina (3NO2TEE), como biomarcador de peroxinitração biológica. O trímero do 5-nitroindol foi eletrogerado in situ sobre os nanotubos de carbono depositados em eletrodo de carbono vítreo (ECV). Após esse processo, o grupo nitro aromático, presente na molécula foi reduzido gerando o par redox hidroxilamina/nitroso, utilizado para detecção e quantificação dos analitos presentes nas amostras biológicas. Os comportamentos eletroquímicos dos eletrodos modificados foram estudados, empregando as técnicas de voltametria cíclica, voltametria de pulso diferencial e cronoamperometria, as quais foram utilizadas para a detecção dos analitos e para obtenção dos parâmetros cinéticos e caracterização analítica da plataforma. Os estudos cronoamperométricos foram realizados com o objetivo de obter maiores informações dos processos redox entre AA e o sensor, uma vez que este demonstrou ser um processo eletrocatalítico. Assim, por meio de gráficos e equações de Cottrell, foi possível obter os valores para o coeficiente de difusão (DAA) e a constante catalítica (kcat) da reação para o AA. Os valores do DAA e de kcat, determinados para AA, foram de 4,2 x10-6 cm-2 s-1 e 1,1 x 106 M-1 s-1, respectivamente. O método desenvolvido de detecção de AA e AU apresentou boa sensibilidade e estabilidade em amostras de urina e soro, com limite de detecção (LD) de 1,9 mol L-1 para AA e 2,1 mol L-1 para AU. A partir do desempenho analítico obtido da plataforma nanoestruturada ECV/MWCNT/poli-5-NID, justifica-se a sua utilização deste como sensor para a determinação simultânea de AA e AU. Antes da construção do biossensor de DNA, para nitroaromáticos de importância biológica, foi necessária a realização dos estudos da 3NO2TEE, em meios prótico: tampão acetato pH 4,5 e tampão fosfato pH 7,4 e 10,0 e, em meio aprótico (DMF/ TBAPF6, 0,1 mol L-1), utilizando eletrodo de Pt e carbono vítreo, como eletrodos de trabalho. A espectroeletroquímica de 3NO2TEE, realizada em meio aprótico, foi útil para racionalizar o comportamento eletroquímico de 3NO2TEE e de seus intermediários gerados durante a redução. Para a construção do biossensor, sobre o eletrodo de carbono vítreo, foram otimizados: concentração de dsDNA, tempo de condicionamento para a redução do nitrocomposto, valor de pH. O biossensor ECV/dsDNA apresentou faixa linear de 60 - 320 nmol L-1 e LD e LQ (limite de quantificação) encontrados foram 58 nmol L-1 e 200 nmol L-1. Estes resultados indicaram que o sensor e o biossensor foram produzidos e aplicados de forma eficaz para detecção de substâncias de interesse biológico. (obs.: algumas expressões fora da formatação)

Made available in DSpace on 2016-08-19T12:56:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_FernandaGabrielleSoaresSilva.pdf: 1148440 bytes, checksum: 5fda93ea5a22fe5304a59aa6f8b2f3b0 (MD5) Previous issue date: 2016-06-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The quality control of soil and groundwater has become an increasing need because human activities have led to contamination of ecosystems and affected human health. Agriculture, for instance, has left ecosystems waste organophosphate insecticides (OFs), highly toxic. In order to make an analysis of the impacts of these compounds in agricultural areas, it is required to have reference values taken in undisturbed areas, presenting the same type of soil and groundwater. In this regard, the ideal is that these compounds are not present in these ecosystems. In this paper, an electrochemical biosensor based on the acetylcholinesterase enzyme, immobilized by crosslinking with glutaraldehyde in the presence of estuarine macroalgae, was used to analyze levels of OFs pesticides in soil and groundwater samples collected in areas without human interference, throughout the state of Maranhão, Brazil. Biosensors applied presented, after optimization, sensitivity with detection limit between 0,054 and 1,44 μg/L, reproducibility with variation coefficient, CVs, internal measure between 8.3 and 9% and stability, showing minor variation in responses after being stored for 3 months), which made them suitable to be used in the organophosphates monitoring in the environmental matrices. Were also analyzed some physico-chemical parameters of quality of waters and soils, it has been verified that these are within the standards of the Brazilian legislation. The monitoring of the presence of levels, using the biosensor described herein, enabled to discard contamination hypothesis by these pollutants, nevertheless it is known that such compounds can have high mobility in environmental compartments. / O controle da qualidade de solos e águas subterrâneas tem-se tornado uma necessidade cada vez maior, pois as atividades humanas têm levado à contaminação de ecossistemas e afetado a saúde humana. A agricultura, por exemplo, tem deixado nos ecossistemas resíduos de inseticidas organofosforados (OFs), altamente tóxicos. Para se fazer uma análise dos impactos provocados por esses compostos em áreas agrícolas, é necessário que se tenha valores de referência de qualidade tomados em áreas não antropizadas, que apresentem mesma tipologia de solos e águas subterrâneas. Nesse particular, o ideal é que estes compostos não estejam presentes nesses ecossistemas. No presente trabalho, um biossensor eletroquímico à base da enzima acetilcolinesterase, imobilizada por ligação cruzada com glutaraldeído em presença de uma macroalga estuarina, foi utilizado para analisar pesticidas OFs em amostras de solo e de águas subterrâneas coletadas em áreas sem interferência humana, em todo o Estado do Maranhão, Brasil. Os biossensores empregados apresentaram, após otimização, sensibilidade com limite de detecção entre 0,054 e 1,44 μg/L, reprodutibilidade com coeficientes de variação, CVs, intramedidas entre 8,3 e 9% e estabilidade, apresentando mínimas variações nas respostas após armazenados por 3 meses, o que os tornou adequados para serem utilizados no monitoramento de organofosforados nas matrizes ambientais. Também foram analisados alguns parâmetros físico-químicos de qualidade de águas e solos, tendo sido verificado que estes encontram-se dentro dos padrões da legislação brasileira. A monitoração da presença de OFs, empregando o biossensor aqui descrito, possibilitou descartar a hipótese de contaminação por esses poluentes, não obstante se saiba que tais compostos podem ter elevada mobilidade nos compartimentos ambientais.

O desenvolvimento de novos materiais a partir de elementos biodegradáveis com durabilidade considerável, versatilidade apreciável e baixo custo tem grande interesse na aplicação da bio-eletrônica. O presente trabalho objetiva a caracterização das propriedades físicas e químicas das membranas de quitosana obtidas a partir da neutralização da solução policatiônica de quitosana. O trabalho foi dividido em duas etapas: solubilização e neutralização. Na primeira etapa a quitosana foi solubilizada em três concentrações diferentes de ácido acético (1%, 0.8% e 0.5%) para avaliar se a concentração de ácido exerce diferença significativa nas propriedades físico-químicas das membranas de quitosana. Na segunda etapa o policátion de quitosana foi neutralizado com duas bases fortes (NaOH e KOH) em três concentrações molares diferentes (0.5, 1 e 5 molar) pelo método de gotejamento lento da base até atingir o pH de 6.0 no policátion e obter membranas com pH perto da neutralidade. A caracterização das membranas obtidas a partir do policátion de quitosana neutralizado mostrou que as concentrações de ácido acético não mudam de forma significativa as propriedades físico-químicas das membranas. Em contraste, o processo de neutralização afetou as propriedades físico-químicas das membranas, e em particular, diferentes comportamentos foram observados dependendo da base utilizada. Membranas mais dúcteis foram obtidas após neutralização com KOH, exibindo capacidade plastificante pela base usada, enquanto que as membranas neutralizadas com NaOH apresentam um comportamento frágil. Além disso, as membranas neutralizadas com KOH exibem uma maior condução iônica em relação às propriedades elétricas das membranas, o qual pode ser interessante no desenvolvimento de biossensores ou célula combustível. / The development of new materials from biodegradable elements with considerable durability, versatility and low cost is of great interest for applications in bioelectronics. The present work aims the characterization of the chemical and physical properties of chitosan membranes after neutralization of the polycation solution of chitosan. This work was divided into two steps: solubilization and neutralization. In the first step, the chitosan was solubilized with three different concentrations of acetic acid (1%, 0.8% and 0.5%) in order to evaluate whether the acid affects the physical-chemical properties of the chitosan films. In the second step, the polycation of chitosan was neutralized with two different strong bases (NaOH and KOH) using three different molar concentrations (0.5, 1 and 5), by the slow drip method of base until reaching a pH of 6.0 for the polycation and obtaining films with pH close to neutrality. The characterization of the membranes obtained from neutralized chitosan showed that the different concentrations of acetic acid did not affect the physical-chemical properties of the films significantly. In contrast, the neutralization process did affect the physical-chemical properties, and particularly, different behaviors were observed depending on the type of base used for neutralization. More ductile films were obtained after neutralization with KOH, exhibiting plastificant capacity by the used base, whereas the films neutralized with NaOH exhibited a more fragile behavior. Beyond this, regarding the electrical properties, the films with KOH presented a higher ionic conductivity, which could be interesting for developing biosensors or fuel cells.