Orientador: Gilberto de Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T23:07:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_Renata_M.pdf: 1789158 bytes, checksum: b41a6e1998e007ca39fd7a2e06a16877 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi obter o isolamento de grânulos de plaquetas, identificar e quantificar a presença do glicosaminoglicano 4-sulfato de condroitina. O fracionamento das plaquetas foi realizado segundo o método de RENDU et al. (1982, 1989). A identificação do 4-sulfato de condroitina foi feita segundo metodologia descrita por NADER et aI. (1987). Após o fracionamento de plaquetas lisadas por gradiente descontínuo de metrizamida, obteve-se uma fração de membranas, o solúvel, uma fração contendo estruturas da plaqueta (grânulos alfa, mitocôndrias e lisossomas, o gradiente e um precipitado contendo os grânulos densos. Através da dosagem de [14C] 5-HT, foi verificada uma maior concentração deste marcador no precipitado, demonstrando que os grânulos densos, que são estruturas captadoras de 5-HT, estavam concentrados nesta fração. Pela dosagem da atividade específica da enzima b3-N-acetilglucosarninidase, poôde-se verificar a concentração desta na fração obtida logo acima do gradiente, indicando, assim, a concentração de lisossomas e de organelas de plaquetas, como mitocôndrias e grânulos a, que possuem densidades próximas nesta fração. Pela identificação de glicosaminogliéanos por eletroforese em gel de agarose, verificou-se a presença significativa do 4-sulfato de condroitina na fração contendo grânulos a, havendo grande quantidade na fração de membranas. Porém, o 4-sulfato de condroitina não foi encontrado nos grânulos densos. Com os resultados obtidos, conclui-se que, conforme sugerido por DONA TO et a!. (1994), o 4-sulfato de condroitina não é estocado nos grânulos densos e, de acordo com o perfil de isolamento, este glicosaminoglicano está presente nos grânulos <x / Abstract: The object of this thesis was to isolate platelet granules and to identify and quantify the glycosaminoglycan chondroitin 4-sulphate contained therein. Platelets were fractioned using short metrizamide discontinuous gradients (Rendu et ai, 1982,1989) and identification of chondroitin 4- sulphate was performed using agarose electrophoresis gels (Nader et ai, 1987). After fractioning of lysed platelets a membrane fraction, a supernatant, an organelles fraction (containing a-granules, mitochondria and lysosomes) were obtained as well as the gradient fraction and a pellet containing the dense granules. A [14C]-5HT labelling assay confirmed that the dense granules were located in the pellet fraction. Since the 'beta'-N acetylglycosaminidase specific activity was found in the organelle fraction we concluded that this fraction contained the a-granules, and other organelles, as their densities are similar. Agarose electrophoresis demonstrated the presence of chondroitin 4-sulphate in the a-granule fraction, but not in the dense granule fraction. These results support evidence published by Donato et ai (1994) suggesting that chondroitin 4-sulphate is not stored in the dense granules but in the a-granule / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador : Benedicto de Campos Vidal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T12:23:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yamada_AureoTatsumi_M.pdf: 6212958 bytes, checksum: 9b4e7b708d1cf94fa4414c4ce58e6218 (MD5) Previous issue date: 1983 / Resumo: Glicoproteínas estruturais (G.P.Es.) associadas aos feixes de colágeno foram isoladas por meio de extrações se letivas e analisadas as suas propriedades físicas, químicas e estruturais. o processo de extração e isolamento, além de limitar conceitualmente uma fração de glicoproteínas dentre todas aquelas encontradas na matriz do tecido conjuntivo, permite também constatar o alto grau de estabilidade fíSico-química das G.P.Es. A utilização de ácido tricloroacético (T.e.A.) aquecido, criticada por ser considerada um tratamento drástico na extração destas glicoproteínas, foi reavaliada frente a um processo alternativo ( extração pela colagenase tipo III), não revelando este diferenças significativas no produto final de extração. Por outro lado, a solubilidade destas glicoproteínas restrita a uréia '8H + 2-mercaptoetanol 0,1%, limitou alguns dos estudos bioquímicos. A heterogeneidade atribuída às G.P.Es. é discutida frente aos resultados encontrados entre tecidos heterólogos de um mesmo animal (tendões e ossos de bovinos) e tecidos homólogos de animais diferentes (tendões da cauda de rato e tendões calcaneares bovinos). Para se estabelecer a disposição e a organização das G.P.Es. nos feixes colagênicos foram efetuados estudos ultraestruturais ao nível da microscopia eletrônica e da polarização. Este último permitiu detectar" in situ " um grau de cristalinidade apreciável das G.P.Es. Tal grau de cristalinidade é atribuído ao ordenamento molecular decorrente do alinhamento e interação das fibrilas de G.P.Es. entre sI, cuja organização espacial lembra uma paliçada de fibrilas circunscrevendo fibras colagênicas / Abstract: Structural glycoproteins (SGP) associated to collagen fibers were isolated by a selective extraction procdure and their physical, chemical and structural properties were analysed. The extraction and isolation procedures used permit a conceptual separation of certain glycoproteins fraction from the connective tis3ue matrix, and appraisal of their high degree of physico-chemical stability. The use of hot trichloroacet acid (TCA) has been criticised by various authors who consider it a drastic method for the extraction of glycoproteins. This treatment was therefore, re-evaluated in compari30n with an alternative method (extraction with type 111 collagenase), and no significant differences were encountered in the resulting fraction. On the other hand the limiting solubility of this glicoprotein which occurs only at 8M urea + 0,1% 2-mercaptoetanol restricts others biochemical analyses. The heterogeneity attributed to SGP is discussed in relation to the results found for heterogeneous tissues of the same animal (bovine tendon and bone) and homologous tis sues from different animal sources ( rat tail tendon and bovine Achilles tendon). Based on the current model proposed by JACKSON & BENTLEY (1964) for the arrangement and organization of SGP around native collagen fibers, analyses were made at the ultrastructural leveI with the polarizing and electron microscopes. The polarizing microscope revealed a considerable crystallini ty of the SGP " in situn. This crystalline is attributed to the molecular order formed by the arrangemente and interaction of this fibrils. Considering this a spatial distribution, a model of SGP fibrils arranged as a palisad, and encircling collagen fiberis suggested. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4860_1.pdf: 2101436 bytes, checksum: 2a1f4e0a8307b77f15bc84782fc1e8a1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Em Pernambuco, onde a esquistossomose é historicamente considerada endêmica na região rural, novos focos de infecção aguda têm sido evidenciados em áreas litorâneas. Um episódio epidêmico incomum de esquistossomose aguda em Porto de Galinhas, Pernambuco, Brasil, permitiu-nos estudar alguns aspectos imunológicos, hematológicos e parasitológicos em 36 pacientes antes e após o tratamento com oxamniquine. O sangue foi coletado e diluído em meio RPMI 1640 suplementado com penicilina (100U/ml) e estreptomicina (100&#956;g/ml), e as culturas de sangue total foram realizadas em 14 pacientes sob estimulação antigênica com antígeno solúvel de ovo (SEA) e antígeno solúvel de verme adulto (SWAP) e mitogênica com acetato de forbol miristato/Ionomicina (PMA/Iono) por 96 horas em atmosfera úmida com 5% de CO2. Os sobrenadantes foram coletados para determinação das citocinas Th1 (IFN-&#947;) e Th2 (IL-4) através de ELISA. Análises estatísticas foram realizadas através do teste não paramétrico de Wilcoxon para amostras emparelhadas e p<0,05 foi considerado significativo. A infecção com Schistosoma mansoni foi predominante na faixa etária de 5-15 anos (69,44%) e nos indivíduos do sexo masculino (63,89%). A carga parasitária, avaliada pelo método semi-quantitativo Kato-Katz, variou entre 24 a 1.656 ovos/g de fezes antes do tratamento e apenas 3 pacientes permaneceram positivos após o tratamento. Leucocitose e eosinofilia foram evidenciadas antes e após o tratamento. Os níveis de IgE mostraram-se elevados antes do tratamento, ocorrendo uma redução significativa após o tratamento (p=0,0119). Os níveis de IFN-&#947; dos pacientes agudos elevaram-se significativamente após o tratamento, sob estimulação com SEA (p=0,019), SWAP (p=0,019), PMA/Iono (p=0,0029) e sem estimulação (p=0,0088). Níveis da citocina IL-4, após tratamento, apresentaram-se significativamente elevados apenas sob estimulação com SEA (p=0,0277) e sem estimulação (p=0,043). Ambas as respostas Th1 e Th2 foram exacerbadas após o tratamento. Os resultados encontrados sugerem que a resposta imune na esquistossomose é modificada pelo tratamento, provavelmente devido à destruição dos parasitas e liberação de antígenos

Orientador : Antonio Roberto Martins / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-28T10:36:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_SilviaAparecida_M.pdf: 26239293 bytes, checksum: 7ea908b86edaba1ac80dbcf01653696f (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Lectinas são proteínas ligantes de carboidratos de origem não Imune, que aglutinam células e/ou precipitam glicoconjugados. Sua abundância na natureza e a facilidade de serem obtidas fez com que passassem a ser utilizadas como ferramentas valiosas para detecção, isolamento e caracterização de glicoproteínas solúveis ou de membrana. Seu uso tem permitido detectar glicoproteínas envolvidas nas diferentes etapas do desenvolvimento. Na neurogênese cerebelar, por exemplo, lectinas têm sido usadas para detectar e diferenciar componentes moleculares envolvidos nos processos de proliferação, diferenciação, migração celular e formação sináptica. Poderíamos citar, como exemplo típico dessas ferramentas, a lectina KM+, extraída da semente de jaca (Artocarpus integrifolia), recentemente purificada que apresenta especificidade para D(+)mannose e propriedade de induzir a migração de neutrófilo por mecanismos haptotático. Seus ligantes têm sido identificados na superficie e no citoplasma de células endoteliais, na superficie de células epiteliais alveolares, na membrana basal e no tecido conjuntivo intersticial de pulmão de rato. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Lectins are non-immune, non-enzymatic proteins that bind carbohydrates. They can aglutinate cells and precipitate glyconconjugates. Since they are abundant in plants and can be easily purified, they are commonly used as probes to detect, isolate and characterize soluble or membrane-bound glycoproteins. They have been employed to detect glycoproteins involved in different stages of neural development. In the cerebellar neurogenesis, for example, lectins have been used to detect and differentiate molecular components involved in the processes of cellular proliferation, differentiation and migration, as well as in synapse formation. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Paulo Bobbio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-15T04:18:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Park_YongKun_D.pdf: 2599752 bytes, checksum: 20e36d31652d348e3984265277d55f85 (MD5) Previous issue date: 1972 / Resumo: Não informado. / Abstract: Not informed. / Doutorado / Doutor em Ciências

Orientador: Celso Paulino da Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-19T21:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moral_NilsonJose_M.pdf: 1599288 bytes, checksum: fa3c278a73cf06a6c0bba35d083871fe (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: A interaçao entre lectina de jaca e glicoproteinas que compoem a pelicula adquirida in vitro foi estudada através de ele troforese em acrilamida, dupla difusão em agarose e imunoeletrofo rese em agarose. Saliva humana inicial foi incubada com hidroxiapatita por duas horas à temperatura ambiente e sob agitação constante, sendo, em seguida, elulda primeiramente em tampão fosfato O,2M pH 6,8 e em seguida em tampão fosfato 1,OM pH 6,8. O sobrenadante e os eluatos foram analizados eletroforéticamente e testados em dupla difusao contra lectina de jaca e soro de cabra anti-IgA humana. Paralelamente a estes experimentos foi conduzida a imunoeletroforese das proteinas salivares contra lectina de jaca e soro anti-IgA humana. Os resultados mostraram que a IgA está presente na composição da pellcula adquirida in vitro e que a lectina de jaca reage com as glicoprote1nas sal ivares que possuem afinidade pela hidroxiapatita in vitro / Abstract: The interaction between lectin from jackfruit and glycoproteins that compose the acquired pellicle in vitro lllas studied by poliacrilamide gel electrophoresis, double-difusion in . agarose and immunoelectrophoresis. Human sa 1 i va was incubated with hydroxyapatite for 2 hours at room temperature under continous agitation and then eluted in O,2M phosphate buffer pH 6,8 and in the same buffer at 1,OM. The supernatant and the eluted proeins were analysed electrophoretically and tested by double difusion against lectin from jackfruit and anti-IgA goat serum. At the same time immunoeletectrophoresis of human saliva anti-IgA I serum and lectin from jackfruit (IJere performed. The' results Ishowed that IgA is present in the proteins that comp.ose the acquired pellicle in vitro and that the lectin from jackfrui t . reacts with salivary glycoproteins that have affinity for the hydroxiapatite in vitro / Mestrado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Mestre em Odontologia

Doctor en Farmacología / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento en el Repositorio Académico, hasta diciembre de 2016 / Los astrocitos responden a un estímulo inflamatorio modificando su morfología y su patrón de expresión génica y participando en la formación de la cicatriz glial, en el caso de lesión traumática. La cicatriz glial se relaciona con la generación de un ambiente no permisivo para la regeneración axonal, el que contiene además moléculas responsables de la pobre reparación existente en el sistema nervioso central. Entre estas moléculas destacan los proteoglicanos de Condroitin sulfato secretado por los astrocitos que forman la cicatriz glial, la proteína Nogo presente en la membrana de los oligodendrocitos y, muy importantemente para este estudio, la glicoproteína Thy-1, presente en la superficie neuronal. Por muchos años, nuestro laboratorio ha estado enfocado en estudiar las funciones y modo de señalización de Thy-1, proteína anclada por un tallo glicosilfosfatidil inositol a la cara externa de la membrana plasmática. Evidencias indican que Thy-1 participa en la inhibición del crecimiento axonal y en mediar interacciones célula - célula. Hemos mostrado además que el efecto de Thy-1 ocurre por medio de dos receptores, la Integrina αvβ3 y Sindecán-4 presentes en los astrocitos de línea DITNC1. La interacción de Thy-1 con sus receptores por tiempos cortos induce un aumento de la adhesión de los astrocitos, mientras que la estimulación prolongada con Thy-1 induce la migración de estas células. La interacción de Thy-1 con sus receptores induce en los astrocitos la activación de cascadas transduccionales que llevan al aumento en la actividad, temporalmente diferenciado, de las GTPasas RhoA y Rac1 entre otros. Además Thy-1 induce la salida de ATP desde el astrocito que resulta en la activación del receptor P2X7 y la entrada de calcio extracelular. Se sabe que estas señales son necesarias para la adhesión de estas células; sin embargo, ¿Cómo sale el ATP de los astrocitos en respuesta a Thy-1? ¿Se requiere de este ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7 para la migración de los astrocitos DITNC1 inducida por Thy-1? Son preguntas que buscamos responder en este trabajo. Por otro lado, resultados de nuestro laboratorio muestran que, contrario a lo encontrado para los astrocitos DITNC1, astrocitos de cultivo primario no responden a Thy-1 y expresan niveles muy bajos de la Integrina β3. Además, se ha descrito que astrocitos primarios aumentan la expresión de esta Integrina en condiciones de daño por derrame cerebral. Dado que los astrocitos sufren cambios morfológicos y migran en condiciones proinflamatorias para reparar el daño, es posible que las diferentes respuestas observadas en los astrocitos primarios y los de línea celular frente al estímulo de Thy-1 se deban a los distintos niveles de integrina expresada por ambos tipo de células. Por lo tanto, en este estudio proponemos que la migración de los astrocitos DITNC1 inducida por Thy-1 requiere de la salida del ATP al espacio extracelular – por mecanismos aún por dilucidar – y de la activación del receptor P2X7. Además, que la baja expresión de la Integrina β3 no permite a los astrocitos de cultivo primario responder a Thy-1. Para estudiar la salida de ATP desde el astrocito y qué vías están involucradas se realizaron mediciones de ATP extracelular por técnicas de luminiscencia, incorporación de sondas fluorescentes a las células, medición de cinéticas de calcio intracelular, entre otras. Para evaluar los requerimientos en la migración inducida por Thy-1 se llevaron a cabo ensayos de cierre de herida y ensayos de polaridad celular. La participación de las distintas moléculas en los mecanismos estudiados se analizó con el uso de inhibidores farmacológicos, bloqueadores de canales o antagonistas de receptores, también se utilizó herramientas de modificación de la expresión génica de las moléculas estudiadas. Para monitorear la respuesta de los astrocitos primarios al estímulo de Thy-1, se realizó cultivos de astrocitos corticales, los que fueron tratados o no con citoquinas proinflamatorias como TNFα. Se analizó cambios de expresión de la Integrina β3 por Western Blot frente a este tratamiento. La respuesta migratoria de los astrocitos tratados con o sin TNFα, frente al estímulo de Thy-1 se realizó por ensayo de cierre de herida en distintas condiciones, como silenciando o sobreexpresando la Integrina β3. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que Thy-1 induce la salida de ATP, requiriendo la presencia de ambos sitios de interacción con sus receptores. Mutación en el sitio de unión a integrinas anula completamente la respuesta, mientras que la mutación en el sitio de unión a Sindecán-4 disminuye y retrasa la respuesta. Se demuestra en este trabajo que la salida de ATP ocurre a través de los hemicanales Conexina 43 y Panexina 1, abriéndose estos hemicanales por medio de un mecanismo que requiere de aumentos de calcio intracelular proveniente del retículo endoplásmico y que sale al citoplasma a través del receptor de IP3R. La salida de ATP es necesaria para el aumento en el área promedio de la adhesión focal y el aumento en el número de adhesiones focales por célula inducida por estimulaciones cortas con Thy-1. Estimulaciones prolongadas llevan a un aumento en la polaridad celular y en la migración de los astrocitos DITNC1, efecto que también requiere de la apertura de hemicanales, la presencia de ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7. La estimulación de los astrocitos con BzATP, agonista del receptor P2X7, a altas concentraciones estimula la migración celular, mientras que bajas concentraciones, por si solas, no provocan este efecto. Sin embargo, nuestros estudios muestran que frente a una estimulación concomitante de Thy-1 mutado en el sitio de unión a Integrina y BzATP a bajas concentraciones es suficiente para inducir la migración de los astrocitos DITNC1 sugiriendo que el aumento extracelular de ATP requiere de la actividad del sitio de unión a Integrina de Thy-1. Estos resultados indican además que la activación del receptor P2X7 por ATP (o BzATP) y la ruta activada río debajo de la interacción de Thy-1 con probablemente Síndecan-4 (Thy-1 mutado en el sitio de unión a Integrina posee sitio de unión a heparina intacto) son necesarias para inducir la migración de los astrocitos. Los astrocitos de cultivo primario cambiaron su fenotipo tras ser expuestos a la citoquina pro-inflamatoria TNFα, aumentando la expresión de las proteínas Integrina β3, GFAP y receptor P2X7, lo que permitió también a los astrocitos migrar en respuesta a Thy-1. Ensayos realizados con astrocitos primarios en que se sobre-expresa o silencia el gen codificante para la Integrina β3, demostraron que la respuesta a Thy-1 luego del tratamiento con agentes pro-inflamatorios, es dependiente de la expresión de dicha Integrina. Se demostró además que la migración de estos astrocitos inducida por Thy-1 también requiere de ATP extracelular y de la activación del receptor P2X7. Estos datos aportan al entendimiento del papel que tienen los astrocitos en el desarrollo de una respuesta inflamatoria tras un daño al sistema nervioso central. Además, aportan antecedentes interesantes sobre cómo una interacción neurona – astrocito, a través de Thy-1 y sus receptores, regula la migración de los astrocitos modificando la señalización intracelular, la permeabilidad de la célula y generando un fenómeno de transactivación que induce cambios en el comportamiento celular. Comprender cómo cambia el comportamiento de los astrocitos frente a la interacción con Thy-1 es importante para generar oportunidades terapéuticas y posibles blancos farmacológicos para contrarrestar la inhibición del crecimiento axonal relacionada con esta interacción. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo aparecen numerosas preguntas nuevas, por ejemplo qué vías se relacionan con la apertura de los hemicanales y cómo estas rutas se conectan con cambios en la adhesividad y migración de los astrocitos. Importante será también comprender el papel que tiene Síndecan-4 en la liberación de ATP inducida por Thy-1 y en la respuesta de los astrocitos de cultivo primario a Thy-1 en un contexto inflamatorio. Finalmente, llevar este conocimiento obtenido en modelos celulares a un modelo animal con perspectivas de tratamiento sería un objetivo clave para reforzar esta investigación / Astrocytes respond to inflammatory stimuli by modifying their morphology and gene expression pattern, and participate in the formation of the glial scar in the case of a traumatic lesion. This glial scar represents a non-permissive environment for axonal regeneration that harbors many inhibitory molecules thought to be responsible for the poor capacity of neurons in the Central Nervous System to repair themselves. In this context, molecules like Chondroitin sulfate proteoglycans secreted by astrocytes, the Nogo protein present on the surface of oligodendrocytes and, importantly for our studies, the neuronal surface glycosyl phosphatidylinositol protein Thy-1, all are highly relevant. For many years, our laboratory has focused on the study of Thy-1 function and signaling. We have shown that Thy-1 inhibits axonal growth and engages in cell-cell interactions. We have also demonstrated that these effects are elicited through the interaction with two receptors present in DITNC1 astrocytes: αvβ3 Integrin and Syndecan-4. We have observed that short-term interaction of Thy-1 with these two receptors enhances astrocyte adhesion; however, following prolonged stimulation, Thy-1 induces astrocyte migration. Thy-1 interaction with its receptors induces the activation of signal transduction pathways in astrocytes that increase RhoA and Rac1 GTPase activity with different kinetics. Thy-1 also induces ATP release from the astrocytes, resulting in the activation of the P2X7 receptor and entry of extracellular calcium. We know that these signals are necessary for astrocyte adhesion. However, how ATP is released in response to Thy-1 remains to be determined. Also whether extracellular ATP and P2X7 receptor activation are required for DITNC1 astrocyte migration induced by Thy-1 is unknown. These and related questions we sought to answer with the studies described in this thesis. On the other hand, results from our laboratory have shown that, in contrast to DITNC1 cells, primary astrocytes in culture do not respond to Thy-1 and express very low levels of β3 integrin, which however increase under pro-inflammatory conditions, such as those produced in the brain by a stroke. Because astrocytes undergo morphological changes and migrate under these conditions in an attempt to limit and repair the damage, we hypothesized that the different responses observed in DITNC1 cells and primary astrocytes, after Thy-1 stimulation, are due to the different levels of integrin expression observed in the two types of cells. Therefore, in this study we propose that DITNC1 cell migration induced by Thy-1 requires ATP release into the extracellular space – by still unknown mechanisms – and P2X7 receptor activation. Furthermore, we hypothesize that primary astrocytes do not respond to Thy-1 due to their low levels of β3 Integrin expression. In order to study ATP release from the astrocytes, and the signaling pathways involved, we measured extracellular ATP by luminescence techniques, and evaluated calcium kinetics by loading the cells with fluorescent probes, and follow fluorescent dye uptake. To assess the requirements of astrocyte migration induced by Thy-1, we performed wound healing and cell polarity assays. The participation of the different molecules in the mechanisms under study was analyzed by the use of pharmacological inhibitors, channel blockers or receptor antagonists. Also, expression of some of these molecules was modified using shRNA and siRNA or other approaches. Primary astrocyte responses to Thy-1 were monitored in cortical astrocytes treated or not treated with pro-inflammatory cytokines, such as TNFα. Then, changes in β3 Integrin expression were analyzed by Western Blotting, and astrocyte migration was evaluated using the wound healing assay under different conditions, including silencing or overexpression of β3 Integrin. The results shown in this study indicate that ATP release induced by Thy-1 required the interaction with both αvβ3 Integrin and Syndecan-4 receptors. Mutation of the integrin-binding site completely abolished the response, while mutation in the heparin-binding domain decreased and delayed ATP release. We further demonstrate that ATP release occurred through Connexin 43 and Pannexin 1 hemichannels, which are opened by a mechanism that required an increase in intracellular calcium stored in the endoplasmic reticulum. This calcium was released to the cytoplasm through IP3R receptor activation. ATP release was necessary for the increase of both average focal adhesion area and the number of focal adhesions per cell induced by stimulation for short periods with Thy-1. Prolonged stimulation induced DITNC1 cell polarization and migration, and both of these effects required the opening of hemichannels, the presence of extracellular ATP and P2X7 receptor activation. Treatment of astrocytes with BzATP, a P2X7 receptor agonist, stimulated cell migration at high concentrations. However, our study shows that DITNC1 astrocytes treated with low concentrations of BzATP, which did not induce cell migration, were able to migrate upon co-stimulation with a mutant form of Thy-1 lacking the integrin-binding site, but with an intact heparin-binding domain, suggesting that increases in extracellular ATP requires the integrin-binding site of Thy-1. These results also indicate that activation of the P2X7 receptor by ATP (or BzATP) and downstream signaling induced by Thy-1 through Syndecan-4, are necessary for astrocyte migration. Primary astrocytes changed their phenotype after treatment with TNFα, increased the expression of β3 Integrin, GFAP and P2X7 receptor, and migrated in response to Thy-1. Furthermore, experiments in which β3 Integrin was overexpressed or silenced indicated that after treatment with pro-inflammatory agents, the observed responses to Thy-1 depended on the expression of this integrin. Migration of TNFα-treated astrocytes induced by Thy-1 also required extracellular ATP and the activation of the P2X7receptor. These results improve our understanding of the role that astrocytes play during an inflammatory response after damage to the Central Nervous System. They also uncover mechanisms relevant to how neuron-astrocyte interactions, established via neuronal Thy-1 and its astrocytic receptors, regulates astrocyte migration, modifies intracellular signaling, cell permeability and generates changes in cell behavior. These results set the stage for future studies that will yield a deeper understanding of how astrocytes change their behavior after interacting with Thy-1. These insights may eventually help in generating therapeutic opportunities and pharmacological targets to counteract the inhibition of axonal growth ascribed to interaction with astrocytes. With our results, new questions arise. For example, which pathways are related to the opening of hemichannels? How do these pathways regulate changes in adhesion and migration of astrocytes? What role does Syndecan-4 play in ATP release induced by Thy-1? What is the role of Syndecan-4 in primary astrocytes stimulated with Thy-1 under inflammatory conditions? Finally, it would be very interesting to compare these results with the responses that are observed in animal models. In conjunction, these approaches may eventually help to define new approaches for the treatment of patients with post-trauma brain damage / Conicyt

El objetivo de la tesis es analizar el patrón de expresión y la localización específica de las mucinas y de Rhbdd2, como así también de los antígenos carbohidratos asociados, en los epitelios normales de distintos estadios de desarrollo prenatal de la rata, y comparar con los patrones de expresión hallados en ratas adultas. Por otra parte, se procura estudiar la expresión y localización específica de las mucinas en diferentes estadios de desarrollo postnatal de la glándula mamaria y comparar con los patrones de expresión hallados en neoplasias mamarias de rata. El cáncer de mama constituye la primera causa de muerte por tumores en mujeres en el mundo. En Argentina, se producen 5400 muertes por año a causa de esta enfermedad y se estima que se producirán 18000 casos nuevos por año. Las mucinas son glicoproteínas que se expresan en los epitelios normales y sufren alteraciones en los neoplásicos que favorecen su crecimiento y diferenciación. La MUC1 es la mucina característica de la glándula mamaria normal y neoplásica y hasta se la ha propuesto como posible blanco para inmunoterapia. Es por ello que se escogió a la glándula mamaria como modelo de desarrollo en el cual comparar los patrones de expresión de las mucinas entre células tumorales y células normales en crecimiento. Esta información podría proporcionar una mayor comprensión acerca del rol biológico de estas proteínas y carbohidratos asociados, en la formación y diferenciación normal de los epitelios, como así también establecer modelos de desarrollo, con fines comparativos de los procesos patológicos que afectan a los epitelios. <i>(Párrafo extraído del texto a modo de resumen)</i>

Orientadora : Profª Drª Adriana Frohlich Mercadante / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 10/03/2017 / Inclui referências / Área de concentração / Resumo: A proteína prion celular (PrPC) e uma glicoproteina extracelular, ancorada na membrana plasmática por uma molécula de glicofosfatidilinositol (GPI). A conversão de PrPC em uma isoforma patologica (PrPSc), a partir de modificações estruturais, e responsável pelo desenvolvimento das encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs) ou doenças periódicas. Vários trabalhos indicam que formas citosólicas de PrP podem ser formadas durante erros na sua biossintese. Os príons citosólicos (CytPrP) são gerados por meio de duas vias: ERAD (ER-associated Degradation) e ineficiência do peptídeo sinal. Alguns estudos demonstram que estas formas de príons citosólicos exercem função neurotoxica, contribuindo para a manifestação das doenças periódicas. Trabalhos anteriores do nosso grupo, foram capazes de identificar uma interação entre PrPC e CHIP/Stub1. CHIP/Stub1 e uma proteína citoplasmática o qual funciona como um co-chaperona molecular e apresenta atividade ubiquitina E3- ligase, participando do controle de qualidade das proteínas desde o dobramento ate a fase de degradação. Ainda, CHIP/Stub1 e homologa a proteína STI1/Hop, uma cochaperona e um ligante bem estabelecido de PrPC. O objetivo desse trabalho foi avaliar em diferentes linhagens celulares se o efeito neurotoxico de PrP citosólico, ja descrito para algumas células, era capaz de ser modulado através dessas co-chaperonas. Em nossos resultados mostramos por diferentes ensaios de viabilidade celular, tais como MTT, vermelho neutro, que CytPrP reduziu de 30-50% a viabilidade celular de três linhagens neuronais testadas: N2a, SH-SY5Y e CF10. Esse mesmo efeito nao foi observado para linhagem renal HEK293T. A expressão das co-chaperonas CHIP e STI-1 foi capaz de reverter a toxicidade do CytPrP em todas linhagens neuronais. Nossos resultados ainda mostraram que mutantes de CHIP e STI-1 com domínios deletados também foram capazes de reverter o efeito neurotoxico causado pela CytPrP. Ensaios utilizando o inibidor MG132 e hidroxicloroquina sugerem que essa reversao do efeito neurotoxico de CytPrP por CHIP e STI-1 parece não ser dependente da via de degradação por proteossomo, nem por lisossoma. Assim, um mecanismo através do qual as co-chaperonas exercem seu efeito de proteção da neuroxicidade ainda esta sendo investigado. Os dados obtidos nesse trabalho poderão contribuir para elucidar os possíveis mecanismos da neurotoxicidade de prions, permitindo um auxilio futuro no desenvolvimento de alvos terapêuticos relacionadas a doenças prionicas. Palavras-chave: PrP citosólico. Neurotoxicidade. CHIP/Stub1. STI1. Prion. / Abstract: The cellular prion protein (PrPC) is an extracellular glycoprotein, anchored to the plasma membrane by a glycophosphatidylinositol (GPI) molecule. The conversion of PrPC to a pathological isoform (PrPSc), through structural modifications, is responsible for the development of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases. Several data indicate that cytosolic forms of PrP can be formed during errors in its biosynthesis. Cytosolic prions (CytPrP) are generated by two pathways: ERAD (ER-associated Degradation) and signal peptide inefficiency. Some studies have shown that these forms of cytosolic prions exert neurotoxic function, contributing to the manifestation of prion diseases. Previous work by our group was able to identify an interaction between PrPC and CHIP/Stub1. CHIP/Stub1 is a cytoplasmic protein, identified as a co- chaperone with E3 ligase activity, participating in the quality control of proteins, from folding to the degradation phase. Still, CHIP/Stub1 is homologous to STI1 (stress - inducible protein 1 ), a co-chaperone and a well-established PrPC bind protein. The objective of this work was to evaluate in different cell lines whether the neurotoxic effect of cytosolic PrP, already described for some cells, was able to be modulated through these co-chaperones. In our results we showed by different cell viability assays, such as MTT, neutral red, that CytPrP reduced from 30% to 50% the cell viability of three tested neuronal lines: N2a, SH-SY5Y and CF10. This same effect was not observed for HEK293T renal lineage. Our results also show that CHIP and STI-1 mutants with deleted domains were also capable of reversing the neurotoxic effect caused by CytPrP in all neuronal lines. Assays using the proteasome inhibitor MG132 and Hydroxychloroquine suggest that this reversal of the neurotoxic effect does not appear to be dependent of the proteosome or lysosomal degradation pathways. Thus, a mechanism through which co-chaperones exert their protective effect of CytPrP neuroxicity is still being investigated. The data obtained in this work may contribute to elucidate possible mechanisms of neurotoxicity of prions, allowing future aid in the development of therapeutic targets related to prion diseases. Keywords: cytosolic PrP. Neurotoxicity. CHIP/Stub1. STI1. Prion

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3082_1.pdf: 5230395 bytes, checksum: c63ef5e4b991b9c47d567dff34b2f53c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Sendo a esquistossomose uma patologia de grande incidência no nordeste brasileiro, estudos a cerca das glicoproteínas particularmente as hepáticas encontradas em pacientes portadores dessa parasitose pode representar importante passo no entendimento de sua fisiopatologia. Além disso, a utilização de duas diferentes lectinas, uma comercial e amplamente caracterizada (Concanavalina A) e outra isolada de sementes de planta típicas da região nordeste (lectina Cramoll) possibilita análise comparativa dos diferentes glicoconjugados plasmáticos ligados a partir da utilização de colunas de afinidade. Numa primeira abordagem, foram realizadas identificações de glicoproteínas plasmáticas, a partir do plasma de indivíduos saudáveis, pré-purificadas em duas diferentes lectinas de mesma especificidade oligossacarídica (glicose/manose). Num segundo momento, identificou-se glicoconjugados em indivíduos, já cirurgiados, acometidos pela esquistossomose no seu mais avançado nível. Nesse contexto, foram realizadas abordagens proteômicas que incluem eletroforeses bidimensionais com posterior digestão enzimática, análise em espectrômetro de massas do tipo Maldi-tof e Maldi-tof/tof e, por fim, a partir dos espectros obtidos, busca em banco de dados através da ferramento Mascot. A grande maioria das glicoproteínas identificadas constituem proteínas de fase aguda incluindo hemopexina, componente 3 do complemento, immunoglobulinas e subunidades, transferrina, haptoglobina, inibidor de protease (c1), beta 2- glicoproteína I, antitrombina, alfa 1-beta-glicoproteina, subunidades de fibrinogênio e alfa- 1 antiquimiotripsina. A Concanavalina A diferentemente da lectina Cramoll, ligou-se a proteínas tais como PRO 1400, PRO2619, eritropoietina, KIAA1492, proteína SPTAN1, R32611_2, cadeia beta do fibrinogênio, alfa-1-B-glicoproteína e Beta-2-glicoproteína. Por outro lado, a lectina Cramoll ligou-se a SH2/SH3 adaptor NCK-beta, proteína de Bence-Jones, anidrase carbônica II e apolipoproteina A-I. Ao analisar o plasma de pacientes cirurgiados utilizando a Concanavalina A e os mesmos parâmetros experimentais, observou-se ausência de proteínas tais como PRO 1400, PRO2619, KIAA1492, proteína SPTAN1 e R32611_2. Em contra partida, foram identificadas proteínas tais como glicoproteína rica em histidina e deferentes subunidades de imunoglobulinas