1 |
Desenvolvimento de biossensores eletroquímicos para glicoproteínas de interesse clínico a partir de filmes mistos de fosfolipídios e lectinas depositados em substratos sólidosLUNA, Débora Máximo das Neves 27 February 2015 (has links)
Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-04-27T18:47:41Z
No. of bitstreams: 2
license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5)
TESE Debora Maximo das Neves Luna.pdf: 3149214 bytes, checksum: 948556bb6aaf20df2b076b5191f11142 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T18:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2
license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5)
TESE Debora Maximo das Neves Luna.pdf: 3149214 bytes, checksum: 948556bb6aaf20df2b076b5191f11142 (MD5)
Previous issue date: 2015-02-27 / FACEPE / A imobilização de lipídios em substratos sólidos tem sido amplamente utilizada no
desenvolvimento de biossensores visando a uma alternativa simples e de baixo custo. Dessa
forma, um ambiente favorável à imobilização de proteínas pode ser criado o que viabiliza a
utilização destas moléculas como elemento de biorreconhecimento molecular. A finalidade
deste estudo consiste em imobilizar a lectina Concanavalina A, em uma plataforma
nanostruturada contendo moléculas fosfolipídicas a fim de identificar glicoproteínas
presentes no soro contaminado com dengue (DENV-1, DENV-2 e DENV-3). A resposta foi
avaliada por técnicas eletroquímica (Espectroscopia de Impedância Eletroquímica [EIE] e
Voltametria Cíclica [VC]) e piezoelétrica (Microbalança de Cristal de Quartzo [QCM]). O
biossensor eletroquímico apresentou maior resposta para DENV-3 (RCT = 180%) em
relação aos DENV-1 (RCT = 60%) e DENV-2 (RCT = 80%). Por outro lado, o biossensor
piezoelétrico identificou de forma qualitativa da presença do DENV. Com o objetivo de
aumentar a especificidade na identificação do DENV, quatro imunossensores eletroquímicos
constituídos por camada auto-organizada de cisteína, nanopartícula de ouro e anticorpo
monoclonal (Anti-DENV-1, Anti-DENV-2, Anti-DENV-3 e Anti-DENV-4) foram desenvolvidos
e avaliados após exposição ao vírus da dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Os
imunossensores demonstraram eficácia, linearidade e especificidade para todos os sorotipos
analisados. Além disso, técnicas de microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de
varredura caracterizaram satisfatoriamente a imobilização na superfície de todos os
biossensores desenvolvidos. / Immobilization of lipids on solid substrates has been extensively used in the development of
biosensors, aiming a simple and low-cost alternative. Thus, a favorable environment for
immobilization of proteins can be obtained and these molecules can be used as a molecular
element for biorecognition. The purpose of this study is to conduct the immobilization of the
Concanavalin A lectin on a nanostrutured platform containing phospholipid molecules with
the aim of identify serum infected with dengue virus (DENV-1, DENV-2 and DENV- 3). The
response was evaluated by electrochemical technique (Electrochemical Impedance
Spectroscopy [EIS] and Cyclic Voltammetry [CV]) and piezoelectric technique (Quartz
Crystal Microbalance [QCM]). The electrochemical biosensor showed greater response for
DENV-3 (RCT = 180%) compared to DENV-1 (RCT = 60%) and DENV-2 (RCT = 80%).
Moreover, piezoelectric technique identified qualitatively the presence of DENV. In order to
increase the specificity in the identification of DENV, four electrochemical immunosensors
based on self-organized layer of cysteine, gold nanoparticles and monoclonal antibody (Anti-
DENV-1, Anti-DENV-2, Anti-DENV-3 e Anti-DENV-4) were developed and evaluated after
exposure to dengue virus (DENV- 1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4). The immunosensors
demonstrated efficacy, linearity and specificity for all serotypes analyzed. In addition, atomic
force microscopy and scanning electron microscopy techniques, satisfactorily characterized
the immobilization on the surface of all developed biosensors.
|
2 |
Uma Lectina do líquen Cladonia verticillaris : purificação e caracterização parcialDalvina Correia da Silva, Michele January 2004 (has links)
Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2
arquivo4879_1.pdf: 418798 bytes, checksum: e66fde5c4b3fce381304c6361e623bcf (MD5)
license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)
Previous issue date: 2004 / Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não imunológica que possuem sítios de
ligação para carboidratos e/ou glicoconjugados. Uma lectina do líquen Cladonia verticillaris
foi purificada através de cromatografia de exclusão molecular. O líquen triturado foi
submetido à extração e uma purificação parcial por fracionamentos utilizando sulfato de
amônio. As amostras foram submetidas a ensaios de atividade hemaglutinante (AH) e suas
concentrações protéicas foram estimadas. A fração mais ativa, F1 (0-30 %), foi submetida a
ensaios de inibição, a ensaios de estabilidade térmica e de dependência de íons divalentes,
assim como a ensaios cromatográficos para a purificação e caracterização lectínica. ClaveLL
foi isolada através de cromatografia de exclusão molecular de F1, e submetida aos mesmos
ensaios; foi também avaliada quanto à estabilidade da AH em valores de pH compreendidos
de 2 a 12. F1 e ClaveLL foram analisadas em eletroforeses em gel de poliacrilamida (PAGE)
para proteínas nativas ácidas e básicas, assim como para proteínas desnaturadas. F1 foi inibida
parcialmente por carboidratos (N-acetil-D-glicosamina, xilose, arabinose, ramnose e manose)
e glicoproteínas (fetuína, caseína, ovalbumina e peroxidase) ou totalmente (glicoproteínas
presentes em soro fetal bovino e em soro de coelho). ClaveLL foi inibida parcialmente por
carboidratos (N-acetil-D-glicosamina, galactose, ramnose, manose, glicose e trealose) e
ovalbumina, e inibida totalmente por fetuína, asialo-fetuína, caseína, asocaseína e
glicoproteínas presentes em colostro, soro de coelho e soro fetal bovino. F1 foi termoestável,
mantendo sua AH a 80°C, enquanto ClaveLL foi sensível ao aumento de temperatura. F1 e
ClaveLL não foram dependentes de íons, mas MnCl2, BaCl2, CaCl2 e MgCl2 estimularam sua
AH. ClaveLL foi mais ativa nos valores de pH ácido (5,5) ou básico (11,0). PAGE contendo
SDS resolveu F1 e ClaveLL como única banda polipeptídica (glicosilada) com peso molecular
menor que 14 kDa. F1 glicosilada pode ter resíduos glicose/manose uma vez que se ligou à
Cramoll 1,4-Sepharose, uma matriz de afinidade com a lectina de semente de Cratylia mollis,
isoformas 1 e 4 glicose/manose específica, imobilizada à Sepharose CL-4B. PAGE para
proteínas nativas ácidas detectou em ClaveLL uma única banda que migrou junto com a
frente de corrida; o mesmo foi observado em PAGE para proteínas nativas básicas.
Cromatografia de ClaveLL através de filtração em gel em sistema ÄKTA-FPLC, resolveu três
picos distintos com AH, que sugeriram formas de agregados moleculares para a lectina nativa,
com pesos moleculares estimados em 170, 110 (pico principal) e 82 kDa. Concluindo,
ClaveLL glicosilada altamente purificada é estável a pH e principalmente inibida por
glicoproteínas
|
3 |
Isolamento, caracterização parcial e imobilização em Sepharose CL-4B da Lectina de entrecasca de Crataeva tapia L.Maria Sousa de Araújo, Regina January 2004 (has links)
Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2
arquivo4882_1.pdf: 1485770 bytes, checksum: ace5d1f3e976bd82208a3f3bce5bafc1 (MD5)
license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)
Previous issue date: 2004 / Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não imune cuja ligação
reversível e específica a carboidratos resulta em aglutinação celular. Estas
proteínas, presentes em plantas, bactérias, invertebrados ou vertebrados, são
detectadas por ensaio de hemaglutinação. Crataeva tapia L. pertence à família
Capparaceae. Uma lectina de entrecasca de C. tapia, CrataBL, foi purificada à
homogeneidade através de fracionamento com sulfato de amônio (Fração 30-
60%), seguida por cromatografia de afinidade (gel de guar) ou troca iônica (CMCelulose).
CrataBL foi ativa com eritrócitos de humanos, galinha e coelho
(atividade hemaglutinante específica, AHE, 102) e principalmente inibida por
glicoproteínas. CrataBL foi termoestável e tratamento com EDTA não afetou a
atividade hemaglutinante (AH); atividade não foi alterada após adição de Ca2+,
Mn2+, Mg2+. CrataBL migrou como uma única banda após eletroforese para
proteínas nativas básicas e duas bandas polipeptídicas de massa molecular 21 e
40.000 Da após SDS-PAGE com ou sem agente redutor; os polipeptídeos foram
também detectados sob o gel usando reagente para glicoproteína. A natureza
glicoprotéica de CrataBL foi também revelada por sua interação com lectina
glicose/manose sob gel de agarose. A massa molecular da lectina por
cromatografia de gel filtração foi de 52.000 Da. CrataBL imobilizada em Sepharose
CL-4B adsorveu bioseletivamente e purificou caseína, fetuína e ovoalbumina
|
4 |
Avaliação da expressão da Glicoproteína-P e sua influência na concentração de antiepilépticos no córtex temporal de pacientes com epilepsia refratária / Evaluation of P-glycoprotein expression and its influence on antiepileptic drugs concentration in temporal cortex of patients with pharmacoresistant epilepsyFerreira, Flavia Isaura de Santi 07 May 2015 (has links)
A epilepsia, doença descrita pela primeira vez em 2000 a.C., tem a crise convulsiva ou epiléptica como fenômeno paroxístico, e a International League Against Epilepsy define a crise epiléptica como \"manifestação excessiva e/ou hipersincrônica, normalmente autolimitada, da atividade dos neurônios no cérebro\". Há 40 anos surgiram os medicamentos antiepilépticos, mas a resistência múltipla a fármacos antiepilépticos (FAEs) é um problema significante que afeta pelo menos 30% dos pacientes portadores dessa doença devastadora. O mecanismo exato da fármaco-resistência desenvolvida em pacientes epilépticos ainda é desconhecido, porém uma possível causa seria a inadequada acumulação intraparenquimal do fármaco antiepiléptico relacionada a expressão aumentada da glicoproteína-P (PgP). Neste contexto, nosso objetivo foi investigar a correlação da expressão da PgP, codificada pelo gene ABCB1, no córtex temporal de 12 pacientes fármaco-resistentes frente aos FAEs fenobarbital, carbamazepina, fenitoína e lamotrigina; comparamos também a expressão da PgP nesse mesmo grupo de pacientes, selecionados no Centro de Cirurgia de Epilepsia (CIREP) frente a um grupo controle composto por indivíduos não epilépticos que evoluíram para óbito examinados no Serviço de Verificação de Óbito do interior (SVOi). Utilizamos a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para determinar as concentrações dos FAEs no plasma e no cérebro, sendo que a metodologia utilizada no tecido cerebral foi desenvolvida e validada especialmente para esse fim. Essas concentrações foram então determinadas e a razão entre as duas medidas foi comparada com a expressão de PgP no tecido cerebral. Analisando os resultados concluímos que não há correlação linear entre a razão dos fármacos estudados e a expressão de PgP no córtex temporal de pacientes com epilepsia refratária. / Epilepsy, desease described for the first time in 2000 B.C., presents the convulsion or epileptic seizure as its paroxysmal event, and the International League Against Epilepsy defines the epileptic seizure as \"excessive and/or hypersynchronous manifestation, usually self-limiting, from brain neurons activity\". Forty years ago the antiepileptic drugs (AEDs) emerged, but multiple resistance to AEDs is a significant problem which affects at least 30% of epileptic patients. The mechanism underlaying pharmacoresistance is still unknown, but a possible cause is the inadequate accumulation of AEDs in the brain tissue related to P-glycoprotein over expression. In this context, our aim was to investigate the correlation between PgP expression, codified by ABCB1 gene, in temporal cortex of 12 pharmacoresistant patients towards AEDs phenobarbital, carbamazepine, phenytoin and lamotrigine; we also compared PgP expression between the same group of patients, selected inside Epilepsy Surgery Center (CIREP), and a control group composed by non-epileptic deceased individuals examined at the Death Verification Service from our Medicine School (SVOi). We used High Performance Liquid Chromatography to determine AEDs concentrations in plasma and brain, and the methodology applied to brain quantification was specially developed for this purpose. These two concentrations were then determined and the ratio between them was compared with PgP expression in brain tissue. Analyzing the results we concluded that there is no linear correlation between the ratio of the AEDs studied and PgP expression in temporal cortex of patients with pharmacoresistant epilepsy.
|
5 |
Estudo do mecanismo de resistência a compostos derivados da classe das tiossemicarbazonas em tripanosomatídeos, com ênfase na glicoproteína-P e na nitrorredutase do tipo ICampos, Mônica Caroline Oliveira January 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2015-11-11T12:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2
monica_campos_ioc_dout_2014.pdf: 1838588 bytes, checksum: ec217383fd2574c1a377fc8a97dc5507 (MD5)
license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)
Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os tratamentos disponíveis para a doença de Chagas e as leishmanioses não são eficientes e apresentam alta toxicidade. Diversos estudos mostram que há possibilidade de indução de resistência de Trypanosoma cruzi ao Benznidazol (BZ) o que pode interferir na eficácia do tratamento. O mesmo tem sido relatado com relação aos fármacos utilizados para o tratamento das leishmanioses, embora não exista um mecanismo de ação definido para a resistência a drogas nestes protozoários. Neste trabalho foram focalizados dois potenciais mecanismos: 1) atividade da glicoproteína-P (Pgp), uma proteína de membrana que atua como uma bomba de efluxo dependente de energia e associada ao fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR); 2) a enzima nitrorredutase presente em T. cruzi (TcNTR), reponsável pela redução de nitroderivados, como BZ, para obter o efeito tripanocida. Na busca de novos compostos seletivos contra T. cruzi e Leishmania amazonensis, nosso grupo vem estudando derivados da classe das tiossemicarbazonas. Em estudos prévios foi observado que o derivado 4-N-(2-metoxi-estiril)-tiossemicarbazona (2-MEOTIO) foi o composto mais efetivo sobre diferentes formas de T. cruzi, enquanto 4-N-(4\2019-hidroxi-3\2019-metoxi-estiril)-tiossemicarbazona (3-MEOTIO) se mostrou o mais eficiente contra L. amazonensis
O mecanismo de resistência a estes compostos foi avaliado, e nossos resultados mostram a participação da Pgp na resistência a 2-MEOTIO e BZ em T. cruzi, e a 3-MEOTIO em L. amazonensis. Ainda, em T. cruzi a participação da Pgp parece estar associada não somente à membrana plasmática, como também à mitocôndria. Em T. cruzi, a perda da função do gene da TcNTR está relacionada à resistência ao BZ, no entanto, foi possível demonstrar que outros mecanismos de resistência estão atuando em conjunto nestes parasitos, e ainda, que os mecanismos são diferentes entre clones isolados de uma mesma população (B15). Também descrevemos nesta tese, a validação in vitro da expressão da luciferase em diferentes cepas de T. cruzi transfectadas com o gene red-shifted-luciferase, a serem utilizadas em futuros ensaios de imagem por bioluminescência in vivo. Os mecanismos de resistência a drogas em T. cruzi e L. amazonensis apresentados neste trabalho podem contribuir para a identificação de novos alvos nestes tripanosomatídeos, objetivando o desenho racional de novas drogas para o tratamento da doença de Chagas e leishmanioses / The available drugs for the treatment of Chagas disease and
leishmaniasis
are not efficient and cause toxic side effects. Several studies show the possibil
ity
of drug resistance induction to Benznidazol (BZ) in
T
rypanosoma
cruzi,
which
may interfere with the treatment
efficacy
. The same has been observed regarding
compounds used to treat leishmaniasis, although more studies on drug resistance
mechanism
are
n
eed
ed
. In the present study we focused on two potential drug
resistance mechanisms: 1) P
-
glycoprotein (Pgp) activity, a membrane protein
which acts as an efflux pump energy
-
dependent
and is
associated with the
multidrug resistance fenotype (MDR); 2) the en
zyme nitroreductase (TcNTR)
found in
T. cruzi,
which is responsible for the reduction of nitroheterocyclic
derivatives, such as
Bz
and Nifurtimox, generating metabolites
with
trypanocidal
activity
. In the search for new selective drugs for the treatment
of
Chagas disease
and leishmaniasis, our group has been studying
compounds from the
class of
the
thiosemicarbazone
s
. Previous studies showed that the 4
-
N
-
(2
-
methoxy
-
styryl)
-
thiosemicarbazone (2
-
MEOTIO) was the most efficient compound on different
forms of
T.
cruzi,
whereas 4
-
N
-
(4’
-
hidroxy
-
3’
-
methoxy styryl)
-
thiosemicarbazone
(
3
-
MEOTIO
) was the most active on
Leishmania amazonensis
. Here we
evaluated the drug resistance mechanism to both thiosemicarbazone derivatives,
as well as, to
BZ
which was used as r
eference drug for
T. cruzi
. Our results show
the participation of P
gp
in the resistance to
both
2
-
MEOTIO and BZ in
T. cruzi,
as
well as in the resistance in
L. amazonensis
to the compound
3
-
MEOTIO
.
Interestingly, in
T. cruzi
the participation of Pg
p is related to its localization not
only in the plasma membrane but also in the mithocondri
on
. In addition, in
T.
cruzi
, the loss of the
TcNTR
gene function is involved in
BZ
-
resistance
, however i
t
was also shown that other
mechanisms of
drug resistan
ce
a
re
also involved and
that
that these mechanisms may be different even among clones obtained from a
single population (B15).
We also described here the
in vitro
validation of the
expression of
luciferase
in different
T. cruzi
strains
transfectaded
with the
red
-
shifted
-
luciferase
gene
,
which wil
l be further used in bioluminescence imaging
assays
in vivo
.
The drug resistance mechanisms
in
T. cruzi
and
L. amazonensis
shown here may be useful in the identification of parasite targets, aiming the
rational design of new drugs to treat for Chagas disease and leishmaniasis
|
6 |
Avaliação da expressão do gene MDR1 (Glicoproteína-P) e atividade de efluxo em células do sangue periférico de pacientes sob tratamento da tuberculose multirresistenteNeves Junior, Ivan January 2013 (has links)
Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2
ivan_junior_ipec_dout_2013.pdf: 1028310 bytes, checksum: dff45af1d04ca95b16081c45df029842 (MD5)
license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)
Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O regime de tratamento com múltiplas drogas é correspondente a uma interação de drogas que pode causar efeitos adversos e falha no tratamento. Essa interação pode gerar modificações funcionais dos transportadores de membrana e por consequência a biodisponibilidade das drogas durante o tratamento. Dentre os transportadores de drogas transmembranares está a glicoproteína-P (P-gp), uma proteína de 170KD, produto do gene MDR1, caracterizada como uma \201CATP Binding cassete\201D (ABC). Seu papel está muito bem definido nas células neoplásicas multirresistentes a drogas, assim como sua relação com as drogas para o tratamento da infecção pelo HIV. Entretanto, pouco tem sido estudado sobre esta bomba de efluxo na tuberculose multirresistente (TBMR). Neste estudo analisamos por citometria de fluxo sua expressão e atividade de efluxo nos monócitos, principal célula relacionada com a tuberculose e também em linfócitos e granulócitos do sangue periférico por meio da citometria de fluxo. A taxa de efluxo foi medida através do uso da Rodamina 123 (Rho123) e a expressão da P-gp através do anticorpo monoclonal anti-CD243 (clone UIC2). A utilização direta do sangue total para a determinação da atividade de efluxo por citometria de fluxo caracterizou a implantação de uma nova ferramenta de análise para a pesquisa
A análise contemplou 52% do total de pacientes em tratamento de TBMR no ambulatório do Laboratório de Pesquisa em Micobacterioses do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC). Para as análises foram levadas em consideração a idade, cor da pele, o tempo de tratamento e a quantidade de drogas administradas. O estudo revelou que há correlação entre a expressão da P-gp nos monócitos e a idade dos pacientes (P<0,01). Diferenças entre pacientes brancos e não brancos também foram observadas. Em linfócitos a expressão de P-gp quando aumentada foi diretamente proporcional à atividade de efluxo observada nos monócitos (P< 0,05). Além disso, pacientes submetidos ao tratamento para TBMR por até seis meses apresentaram uma maior expressão de P-gp e, linfócitos quando comparados àqueles que receberam o tratamento por mais de seis meses (P<0,01) / When two or more drugs are administrated, such interactions can cause additive, synergistic
or antagonistic effects. The
drug transporters may undergo
treatments effects and therefore
change the dr
ugs bioavailability during the
treatment and can cause treatment failure. Among
the
know
n
drug transporters
there is transmembrane
P
-
glycoprotein (P
-
gp). It is
a 170 KDa
transmem
brane protein w
h
ich is a product of multidrug resistance
MDR1
gene. This protein is
a
well
-
characterized
ABC transporter (
ATP Binding Cassette
)
and is responsible for efflux of
the chemotherapeutic agents from resistant cancer cells. There
are few studies
about this
protein in multidrug
-
resistant tuberculosis (MDR
-
TB)
. In this study, P
-
gp
expression and
activity
were detect by flow cytometry
in monocytes,
the
main cell related with the
M.tuberculosis
infection
,
as well as in lymphocytes and granulocytes
from whole peripheral
blood
.
P
-
gp mediated efflux was
determined
indirectly by measuring the
retention of a
fluorescent P
-
gp substrate,
rhodamine 123 (
Rho123)
.
P
-
gp expression
was assessed using
anti
-
P
-
gp
monoclonal antibody UIC2
(CD243
).
The efflux
activ
ity
with whole blood
using
flow cytometry technique
as a new tool to pharmacogenetic research was
developed
in
this
study.
We analyzed 52 % of outpatient
in MDR
-
TB treatment from Laboratory Research
Mycobacteriosis Institute Evandro Chagas Clinical Researc
h (IPEC). We
considered variables
as age, race, treatment time, amount of drug administered at the time of blood collection and
their correlation with P
-
gp expression and activity. The
result
revealed a correlation between
the P
-
gp expression in monocytes
and ag
e
(
P
<
0
.01).
In addition, difference
between white
and nonwhite patients
was observed
.
Lymphocyte P
-
gp expression was
statistically significant
greater in patients w
ith
increased
monocytes efflux activity evidenced by P
-
gp inhibition with
CSA (
P
<
0
.0
5
).
P
atients undergoing MDR
-
TB treatment for six
months
had a higher P
-
gp
expression in lymphocytes compared to those who received the treatment for more than
six
months (
P
<
0
.01).
|
7 |
Produção de baculovírus recombinante para a glicoproteína E2 do arbovirus Mayaro em células de insetosVasconcelos, Ligia Marinho Pereira January 2016 (has links)
Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O arbovírus Mayaro (MAYV), pertence ao gênero Alphavirus, família
Togaviridae e grupo sorológico A. Como parte do projeto de pesquisa sobre
"Arboviroses Emergentes na Amazônia Ocidental", foi isolada uma estirpe de um
alphavirus Mayaro a partir de um indivíduo febril de Acrelândia, Acre. O MAYV
ocorre no ambiente silvestre ou rural em áreas próximas a florestas e seu ciclo de
transmissão envolve a participação de primatas não humanos, aves e mosquito
Haemagogus ssp. As características patogênicas do vírus MAY em humanos são
pouco compreendidas e o potencial de dispersão desses vírus e a possibilidade de
participação de espécies de mosquitos do gênero Aedes em seu ciclo de
transmissão fazem desse vírus um importante organismo para estudos biológicos e
epidemiológicos. Devido à natureza não específica dos sinais e sintomas de
doenças febris agudas causadas por MAYV, o diagnóstico clínico é difícil e pode ser
confundido com outras doenças febris, como: a febre da dengue, febre do
chikungunya, febre amarela e a malária. Já o diagnóstico laboratorial por isolamento
viral é laborioso e depende de infraestrutura e pessoal especializado, disponível em
poucos laboratórios brasileiros. O diagnóstico imunoenzimático possui limitações
quanto à utilização de partículas virais infecciosas e também por produzirem reações
cruzadas com vírus da mesma família. Sendo assim, com o intuito de obter antígeno
recombinante específico para detecção de MAYV, este projeto teve por objetivo
expressar a glicoproteína E2 do vírus em células de insetos utilizando baculovírus
recombinante como vetor. A glicoproteína E2 dos alphavirus tem a função de se ligar
a receptores presentes na membrana plasmática da célula alvo para a entrada do
vírus através de uma vesícula endossomal. Como resultado, foi obtido o baculovírus
recombinante para a glicoproteína E2 de MAYV, e a mesma foi expressa pela
primeira vez em células de inseto High-FiveTM. Apesar de utilizar vetor com sinal de
exportação da proteína recombinante para o meio extracelular, a glicoproteína
recombinante E2 de MAYV não foi exportada, permanecendo na fração celular da
cultura. Análises da estrutura tridimensional da E2 homóloga de alphavirus
indicaram que esta glicoproteína apresenta um domínio transmembrana, o que
justifica sua permanência na bicamada fosfolípidica da célula hospedeira. / The arbovirus Mayaro (MAYV), belongs to the genus Alphavirus, family
Togaviridae and serological group A. As part of the research project on "Emerging
Arboviroses in the Western Amazon", a strain of Mayaro alphavirus was isolated from
a febrile individual of Acrelândia, Acre. MAYV occurs in the wild or rural environment,
in areas near to forests and its life cycle includes the participation of non-human
primates, birds and mosquito Haemagogus ssp. The pathogenic characteristics of
MAYV in humans are poorly understood and the dispersal potential of these viruses
and the possibility of participation of species of Aedes mosquitos in its transmission
cycle make this virus an important organism for biological and epidemiological
studies. Because of the nonspecific nature of the signs and symptoms of acute
febrile illness caused by MAYV, clinical diagnosis is difficult and can be confused
with other infectious diseases, such as dengue fever, chikungunya fever, yellow fever
and malaria. Moreover laboratory diagnosis by viral isolation is laborious and
depends on infrastructure and trained personnel available in a few Brazilian
laboratories. The enzyme immunoassay diagnosis has limitations on the use of
infectious viral particles and also for producing cross-reactions with other virus from
the same group. Thus, in order to obtain recombinant antigen for specific detection of
MAYV, this project aimed to express the MAYV E2 glycoprotein in insect cells using
recombinant baculovirus as vector. The E2 glycoprotein of the alphaviruses has the
function of binding to receptors in the plasma membrane of the target cell for viral
entry through an endosomal vesicle. The recombinant baculovirus was obtained for
the MAYV E2 glycoprotein, and this protein was expressed for the first time in High-
FiveTM insect cells. Despite using a vector with signal to exportation of the
recombinant protein to the extracellular medium, the MAYV E2 glycoprotein was not
exported, remaining in the cell fraction of the culture. Structural analyses of
alphavirus E2 homologous protein indicated that the glycoprotein has a
transmembrane domain, which justifies its permanence in the host cell phospholipid
bilayer.
|
8 |
Expressão da glicoproteína-p e da mrp1 em tecidos de cães portadores de leishmaniose visceralCalado, Andréa Maria Campos [UNESP] 21 July 2010 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0
Previous issue date: 2010-07-21Bitstream added on 2014-06-13T18:51:20Z : No. of bitstreams: 1
calado_amc_me_jabo.pdf: 1098325 bytes, checksum: e69e94e5c8654a5cdbae32a66649fbe3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença sistêmica e imunomediada. É provocada pelo protozoário da espécie Leishmania (L.) chagasi, que é transmitido ao homem e aos animais através da picada do vetor infectado, o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis. Até o momento não há tratamento que leve a cura parasitológica dos cães e o arsenal de fármacos leishmanicidas é limitado. A resistência aos medicamentos constitui um impedimento importante para o controle de enfermidades e a manifestação de resistência a vários medicamentos é conhecida como MDR (“multidrug resistance”). Um desses mecanismos de resistência a múltiplas drogas é o aumento da expressão da glicoproteína-P (gp-P), um sistema de efluxo de xenobióticos codificadas pelo gene MDR1. Na presente pesquisa, buscou-se avaliar a possibilidade do fenômeno de resistência a múltiplas drogas em cães naturalmente parasitados por Leishmania (L.) chagasi . Foram objetivos do estudo avaliar a expressão da glicoproteína-P (gp-P) e da proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP) por meio da imuno-histoquímica, em amostras fígado, adrenais, rins, baço e pele de cães portadores da LV. Os resultados mostraram que o fígado, rins e adrenais expressam significativamente (p<0,001) mais gp-P do que a pele e o baço; também que as adrenais expressam significativamente (p<0,001) mais MRP do que a pele e o baço e que este ultimo expressa significativamente (p<0,001) mais MRP do que a pele. Quando se comparou os dois anticorpos verificou-se que o fígado, rins e adrenais expressam porcentagens semelhantes de células imunomarcadas e que o MRP é significativamente (p<0,01) mais reativo na pele que a gp-P. Esses resultados poderiam justificar a redução da carga parasitária na pele que se acompanha durante o tratamento. Todavia, a não obtenção da cura parasitológica poderia ser devido a alta expressão... / Canine visceral leishmaniasis (LVC) is a systemic immunomediated disease. It is caused by the protozoary from the Leishmania (L.) chagasi species, wich is transmitted to man and animals through the infected vector bite, the phlebotomine sand fly Lutzomyia longipalpis. Until present, there is no treatment leading to a parasitologic cure for dogs and the leishmanicide medicine arsenal is limited. Drug resistance is one of the important impediments for infirmity control and the resistance manifestation to multiple drugs is known as MDR. One of those multiple drugs resistance mechanisms is the increase of the glycoprotein-P (gp-P) expression, a xenobiotic efflux system encoded by the MDR1 gene. At the present research, it aimed to evaluate the possibility of resistance phenomenon the multiple drugs in dogs naturally parasited by Leishmania (L.) chagasi. The objectives of this study was to evaluate glycoprotein-P (gp-P) and multiple drugs resistance protein (MRP) immunohistochemical expressions in LVC infected dogs’ liver, adrenals, kidneys, spleen and skin samples. Results showed that liver, kidneys and adrenals express significantly (p<0,001) more gp-P than skin and spleen; also, adrenals express significantly (p<0,001) more MRP than skin and spleen and that spleen express significantly (p<0,001) more MRP than skin. When the two antibodies were compared, it was verified that liver, kidneys and adrenals express similar percentages of immunomarked cells and that MRP is significantly more reactive in skin than gp-P. These results could justify the parasitary load reduction in skin during treatment. Nevertheless, the lack of parasitologic cure could be due to the high pg-P and MRP1 expressions in liver, adrenals and kidneys, which could increase the pharmac efflux at these organs
|
9 |
Efeito da temperatura na otimização da produção de glicoproteína do vírus da raiva em cultivos em suspensão de células recombinantes de Drosophila melanogaster S2Rossi, Nickeli 14 March 2008 (has links)
Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1
1835.pdf: 1426469 bytes, checksum: f474e4a11463f269c448f21cb7cd2ed6 (MD5)
Previous issue date: 2008-03-14 / Universidade Federal de Sao Carlos / The increment of the expression of complex correctly processed recombinant proteins,
like the ones produced by animal cells, is essential for the development of an efficient large
scale bioprocess. The manipulation of culture conditions plays a very important role in the
controlled and optimized expression of these proteins in bioreactors. The response of
mammalian and insect cells to temperature effect has been studied by several researchers as a
potential strategy to enhance production of recombinant proteins. The present study evaluated
the influence of the temperature in the culture of recombinant Drosophila melanogaster S2
cells in Sf-900 II medium supplemented with aminoacids with the aim of enhancing the
production of the rabies virus glycoprotein (RVGP). The cultures were carried out in Schott
flasks (in shaker) as well as in a bubble-free stirred tank bioreactor. Five temperatures were
tested in Schott flasks cultures: 16, 20, 24, 28 and 34ºC. The results obtained in cultures at
those temperatures in terms of maximum specific growth rate (µmax) and maximum RVGP
concentration (CGPV
max) were, respectively: 0.009, 0.020, 0.039, 0.036 and 0.022 h-1, and
0.075, 2.973, 0.480, 1.404 and 0.013 mg.mL-1. The best temperature for RVGP production
(20oC) was chosen to be evaluated in the bioreactor operated in batch and feed-batch mode,
keeping 28oC as control. The results of µmax and CGPV
max in batch mode were: 0,061 h-1 and
0,149 mg.mL-1 at 28oC and 0,027 h-1 and 0.354 mg.mL-1 at 20oC. A batch experiment with
stepwise temperature decrease from 20ºC to 16ºC presented a µmax ranging from 0.024 to
0.012 h-1 and a final CGPV
max of 0.567 mg.mL-1. On the other hand, at 20ºC in feed-batch
mode, µmax was 0.024 h-1 and CGPV
max 1.155 mg.mL-1. The larger production of RVGP
observed in Schott flasks can be a consequence of a more favorable condition for the
expression of the protein at low values of dissolved oxygen concentrations that are seen in
flasks but not in controlled bioreactor cultures at 50% DO. Overall, these results show an
increase of recombinant protein expression at lower temperatures, especially when µmax is
kept fairly low. The largest production of RVGP was obtained in the culture at 20°C in Schott
flask when CGPV
max was 2.973 mg.mL-1, while the production obtained at the control
temperature of 28ºC was only of 1.404 mg.mL-1. Thus, the use of reduced culture
temperatures, around 20°C, seems to be the best strategy for the optimization of RVGP
production. / aumento da expressão de proteínas recombinantes complexas corretamente processadas
como as produzidas por células animais é essencial para o desenvolvimento de um
bioprocesso eficiente em larga escala. A manipulação das condições de cultivo desempenha
um papel muito importante na expressão otimizada e controlada dessas proteínas em
biorreatores. A resposta de células de mamíferos e de insetos quando submetidas ao efeito da
temperatura vem sendo estudada por vários pesquisadores como estratégia potencial para o
aumento de expressão de proteínas recombinantes. No presente trabalho propõe-se avaliar a
influência da temperatura no cultivo celular com o propósito de intensificar a produção da
glicoproteína do vírus da raiva (GPV) em cultivo de células de Drosophila melanogaster S2
recombinante em meio de cultura Sf900-II suplementado com aminoácidos, em frascos Schott
(em shaker) e em biorreator de tanque agitado livre de bolhas. Para tal, foram avaliadas cinco
temperaturas de cultivo em frasco Schott: 16, 20, 24, 28 e 34ºC. Os resultados obtidos de
velocidade específica de crescimento máxima (µmax) nesses cultivos foram, respectivamente:
0,009, 0,020, 0,039, 0,036 e 0,022 h-1, e de concentração máxima de GPV (CGPV
max): 0,075,
2,973, 0,480, 1,404 e 0,013 mg.mL-1. A melhor temperatura para produção de GPV (20oC) foi
escolhida para ser testada em biorreator operado em batelada e batelada alimentada, mantendo
28oC como controle. Os resultados de µmax e CGPV
max em batelada foram: 0,061 h-1 e 0,149
mg.mL-1 a 28oC e 0,027 h-1 e 0,354 mg.mL-1 a 20oC. Um experimento em batelada com
temperatura decrescente em etapas de 20ºC a 16oC apresentou um µmax variando de 0,024 a
0,012 h-1 e uma CGPV
max final de 0,567 mg.mL-1. Por outro lado, a 20ºC em batelada
alimentada, µmax foi de 0,024 h-1 e CGPV
max de 1,155 mg.mL-1. A maior produção de GPV
observada em frascos Schott pode ser conseqüência de uma condição mais favorável para
expressão da proteína em condições de baixa concentração de oxigênio dissolvido como as
usuais em frascos Schott mas não em cultivos em biorreator com oxigênio dissolvido
controlado a 50%. Em geral, estes resultados mostram uma maior expressão da proteína
recombinante nas temperaturas mais baixas, especialmente quando µmax é mantido
razoavelmente baixa. A maior produção de GPV foi obtida no cultivo realizado a 20ºC em
frasco Schott quando CGPV
max=2,973 mg.mL-1 em comparação a 1,404 mg.mL-1 obtida no
cultivo controle a 28ºC. Assim, a utilização de temperaturas de cultivo mais baixas, próximas
de 20ºC, pode ser considerada a melhor estratégia na otimização da produção de GPV.
|
10 |
Purificação e caracterização de uma proteína de semente de soja (Glycine max L. Merr): avaliação in vitro de atividade antiagregante plaquetária e anticoagulanteCristina Cabral Silva, Mariana 31 January 2008 (has links)
Made available in DSpace on 2014-06-12T15:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1
license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)
Previous issue date: 2008 / Uma nova proteína de semente de soja (Glycine max), denominada ApcSP (antiplatelet and anticoagulant soybean protein) foi isolada, purificada e caracterizada bioquimicamente. A partir de extratos brutos destas sementes, foi realizado um fracionamento com sulfato de amônio, obtendo-se a fração F0-60%, com posterior submissão à cromatografia de afinidade em coluna de Cramoll 1,4-Sepharose. As proteínas adsorvidas eluídas com NaCl 1,0 M em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0 foram submetidas à cromatografia de fase reversa HPLC. SDS-PAGE na presença de β-mercaptoetanol revelou uma banda polipeptídica de 51 kDa. Coloração com o reagente de Schiff revelou a natureza glicoprotéica de ApcSP. A seqüência do N-terminal obtido pela degradação de Edman foi EGQFGPMIQS (10 resíduos), que apresenta 20% de homologia com a proteína albumina 2S tipo 3. O espectro de dicroísmo circular foi característico de uma proteína predominantemente α-hélice, e este foi utilizado para estimar as contribuições das frações de estruturas secundárias presentes em ApcSP. Desconvolução usando o programa CDPro indicou a presença de 35% de alfa hélice, 17% de folhas-beta, 22 % de volta-beta e 26% de desordenada. O espectro de Fluorescência de ApcSP revelou uma emissão máxima em torno de 339 nm. A proteína da soja foi excitada em 280 nm e 295 nm, e os espectros de emissão foram monitorados na faixa de 290-450 nm e de 305-450 nm. Atividade peroxidásica foi detectada utilizando guaiacol e diaminobenzidina como substratos. Biologicamente, houve uma inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno (100% de amplitude e 98% de slope), trombina (79% de amplitude e 77% de slope) e ADP (62% de amplitude e 58% de slope) na concentração de 2 μM de ApcSP em relação ao controle. Foi também avaliado o efeito da proteína de soja purificada nos tempos de coagulação, afetando as vias extrínseca e intrínseca da coagulação. O tempo de tromboplastina parcialmente ativada (TTPa) foi bloqueado na concentração de 3 e 4 μM, apresentando um R (Relação do tempo de coagulação com o tempo controle de coagulação) > 7,5. Estes resultados evidenciam que ApcSP com as atividades antiagregação plaquetária e anticoagulante pode ser de grande importância para a terapia anti-trombótica e anticoagulante
|
Page generated in 0.0503 seconds