Orientador: Celso Paulino da Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-19T01:11:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_ReginaldoBruno_M.pdf: 2628424 bytes, checksum: 6fdd5a85280fafadc8642743268342aa (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: Lectinas são proteínas ou glicoproteínas capazes de ligação reversível a carboidratos e compostos contendo açúcares e de aglutinar células ou glicoconjugados sem induzir mudanças químicas nos mesmos. Estão presentes em plantas, bactérias, fungos, vírus, algumas células de mamíferos e outras fontes naturais. São úteis em estudos de superfície celular, imunohistoquímicas de condições normais e patológicas e estão envolvidas no mecanismo de adesão bacteriana. Uma propriedade importante nas lectinas de Phaseolus vulgaris é a estimulação da proliferação de linfócitos e esta propriedade prevalece na isolectina rica em subunidade L (L4). A lectina de germe de trigo aglutina preferencialmente célula tumorais, reage e neutraliza aglutininas não imunes presentes na saliva e aglutinam s. mutans. Neste trabalho desenvolvemos uma técnica de cromatografia de afinidade, para o isolamento de lectinas que apresentem especificidade por uma estrutura oligossacarídica. Para isto transformamos uma proteína rica em oligossacárideos, o ovomucóide, em um gel insolúvel e estável e o depositamos numa coluna. Com esta técnica foi possível o isolamento purificação das lectina de germe de trigo, lectina de Phaseolus e sua isolectina L4. Após eluídas da coluna estas proteínas foram submetidas a eletroforeses em gel de poliacrilamida e em agarose, que demonstraram sua pureza. Com finalidade de estudar as possíveis interações entre estas lectinas purificadas e glicoproteinas salivares, realizamos dupla difusão em gel de agarose, onde encontramos precipitações proteicas entre as lectinas testadas e as glicoproteinas salivares e séricas / Abstract: Isolation of lectin of beans and wheat germ and theirs precipitations with salivary and serum glycoproteins. Lectins are proteins or glycoproteins capable of reversible linking to carbohydrate and sugars compounds, and of celular or glycoconjugated aglutination without inducing chemistry changes. They are present in plants, bacteria, fungus, virus, some mammaliam cells and others nature sources. They are useful on the study of celular surface, imunohistochemistry of normal and pathologycal condition, studies of stimulation of lyrophocyte proliferation and are involved in bacteria adherence. One important property of Phaseolus vulgaris lectins is lyrophocyte proliferation and this property dominate in the isolectin rich in L subunit (L4). Lectin of wheat germ causes tumor cell aglutination, react and neutralize aglutinins of non imune origin that are present in saliva and promote S. mutans aglutination. In this work a technique of affinity chromatography, for the isolation of lectins with oligosaccharide specificity was developed. A protein rich in oligosaccharide, the ovomucoid, was transformed in a insoluble and stable gel that was deposited in a columm. With this technique lectin isolation of wheat germ and Phaseolus vulgaris and L4 isolectin was possible. After eluted from the ovomucoid columm, these proteins were submited to polyacrylamide gel, and agarose electrophoresis, and demonstrated being pure. To study the possible interaction of these lectins with salivary and serum glycoproteins, we used double difusion on agarose gel, and we found precipitations / Mestrado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Mestre em Ciências

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los virus siempre necesitarán de la maquinaria metabólica de la célula infectada para replicar su material genético, produciendo numerosas copias del virus original. En dicho proceso, algunos virus poseen la capacidad de producir un efecto citopático denominado lisis celular. Dentro de los virus que producen este efecto se encuentran los virus Herpes, descritos en insectos, reptiles, anfibios y moluscos; como también en casi todas las especies de aves y mamíferos que se han investigado. Uno de los virus de interés veterinario es el Herpes Canino Tipo 1 (CaHV1), debido a que su persistencia en un criadero canino provoca pérdidas económicas considerables, que incluso pueden significar el cierre de este tipo de empresas. El CaHV1 provoca una alta cantidad de cuadros clínicos, en especial en cachorros menores de cuatro semanas, en donde se ha descrito una mortalidad cercana al 90% de la camada. Si bien en Chile su detección y caracterización biológica fue descrita hace algunos años, obteniéndose un aislado nativo denominado RP5, lamentablemente aún no existe un método diagnóstico rápido. Bajo este contexto, el objetivo de este estudio fue la detección simultánea de dos fragmentos del gen de la glicoproteína B del CaHV1 en un mismo PCR (variante múltiplex) a partir del aislado RP5. Así, al determinar las temperaturas y tiempos óptimos para las etapas de alineamiento y elongación, se pudo implementar una herramienta de diagnóstico molecular que podría ser utilizada y comparada con otros protocolos de PCR, que actualmente se están desarrollando en otras memorias de Título en la Unidad de Virología de nuestra Facultad

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La diferencia fundamental entre un virus y los microorganismos reside en la forma de generar progenie, pues los virus no siguen la estrategia de formar nuevas partículas mediante fisión binaria. Su proceso de replicación es particular, pues considera la unión a la célula blanco, la exposición del genoma viral, la replicación del genoma, la producción de proteínas virales, el ensamble de la partícula viral y la salida al exterior de la célula. En esta última etapa, algunos virus destruyen la membrana celular produciendo un daño irreparable que lleva a la muerte celular, fenómeno denominado citolisis y que puede ser observado a través del microscopio óptico, lo cual permite un acercamiento al diagnóstico de su presencia. El virus herpes es uno de los que presentan esta capacidad citolítica y ha sido descrito en insectos, reptiles, anfibios y moluscos; también en prácticamente todas las especies de aves y mamíferos que se han investigado. Dentro de la medicina veterinaria se han descrito varios virus herpes de importancia, dentro de los cuales se encuentra el Virus Herpes Canino tipo 1 (CaHV1), debido principalmente al cuadro que ocasiona al infectar cachorros, pudiendo provocar la pérdida de camadas completas y en reproductores, ya que quedan como portadores de por vida. Lo anterior, se traduce finalmente en cuantiosas pérdidas económicas para los planteles, sobretodo si se trata de animales de alto valor genético. Debido a esto, es indispensable poder realizar un diagnóstico temprano. En este estudio, se aportó tanto a la caracterización genómica de un aislado nacional del virus CaHV1 -denominado RP5, detectado y caracterizado biológicamente en el año 2005- como también a la medicina veterinaria de pequeños animales con un método diagnóstico específico, sensible y de rápido resultado. Para ésto, se realizó la detección del gen de la glicoproteína C del CaHV1 mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando un par de partidores diseñados in silico. Con la utilización de un termociclador de gradiente de temperaturas se estableció la temperatura de alineamiento (55ºC) mediante la observación nítida e inequívoca de un fragmento de DNA de aproximadamente 200 pb. Estos fragmentos fueron secuenciados y se estableció un porcentaje de identidad nucleotídica de 95% respecto del dato oficial del GenBank. Este alto valor de identidad indica que el fragmento amplificado corresponde al fragmento del gen gC y constituye una evidencia mas que confirma que el aislado nacional utilizado como fuente viral, corresponde a CaHV1

A glicosilação é uma das modificações mais comuns ocorridas naturalmente nas cadeias polipeptídicas. As glicoproteínas exercem papéis essenciais para os seres vivos desde o ínicio vida e, por essa razão, qualquer mutação nos resíduos de açúcares a elas ligados causam diversos efeitos não desejados ao indivíduo. O padrão de glicosilação de proteínas é regido tanto por fatores genéticos quanto por fatores externos. Em relação aos defeitos de glicosilação hereditários, diversas mutações em genes específicos causam anormalidades na síntese de glicoproteínas. No grupo de doenças causadas por defeitos de glicosilação hereditários estão incluídas algumas distrofias musculares relacionadas a mutações em proteínas que são glicosiltransferases comprovadas ou putativas. O uso de modelos animais facilita o estudo dessas doenças neuromusculares e, por isso, o presente trabalho foi desenvolvido utilizando tecidos de camundongos controle (C57Black6) e LARGE. O camundongo LARGE possui características fenotípicas semelhantes às de humanos afetados pela distrofia muscular congênita tipo 1D. Diferentes estratégias de análise e de instrumentação foram empregadas para a obtenção de informações relacionadas tanto ao conjunto de glicoproteínas em geral quanto à alfa-distroglicana especificamente. A alfa-distroglicana mostra-se modificada em relação aos resíduos de açúcares nela ligados em animais com mutação no gene LARGE, resultando em diversos problemas de saúde. A técnica de eletroforese bidimensional, aliada à pré-purificação das glicoproteínas por colunas de lectinas e posterior identificação por espectrometria de massas, não garantiu a obtenção de resultados adequados para esta classe de estruturas. Portanto, a comparação glicoproteômica de tecidos musculares de animais controle e LARGE não foi bem sucedida por esta estratégia instrumental. Técnicas imunoanalíticas, em destaque o western blot, por sua vez, garantiram a visualização das diferenças de glicosilação da alfa-distroglicana, e experimentos de cromatografia de imunoafinidade iniciados neste trabalho mostraram o potencial da especificidade de interação anticorpo-antígeno no isolamento desta glicoproteína para estudos futuros de seus resíduos de oligossacarídeos. Finalmente, análises de espectrometria de massas dos resíduos de oligossacarídeos isolados das glicoproteínas foram realizadas. Os resultados obtidos indicaram a necessidade de otimização do preparo e purificação mais eficiente dessas amostras, mas alguns íons puderam ser relacionados a N- e O-glicanas. / Glycosylation is one of the most common modifications that occur naturally in the polypeptide chains. Glycoproteins play key roles in living organisms from the beginning of life and, therefore, any mutation in the sugar residues attached to them may cause many undesirable effects. The glycosylation pattern of proteins is regulated by both genetic and external factors. Regarding hereditary defects of glycosylation, different mutations in specific genes cause abnormalities in the synthesis of glycoproteins. In the group of diseases caused by defective glycosylation are included some hereditary muscular dystrophies, related to mutations in proteins that are proven or putative glycosyltransferase. The use of animal models facilitates the study of neuromuscular diseases and, therefore, this study was conducted using tissues from control mice (C57Black6) and LARGE. The LARGE mouse has phenotypic characteristics similar to those of humans affected by congenital muscular dystrophy type 1D. Different strategies for analysis and instrumentation were employed here to obtain information related both to the set of glycoproteins in general and specifically to alpha-dystroglycan. The alpha-dystroglycan is modified in relation to its linked sugar residues in animals with LARGE gene mutation, resulting in several health problems. Twodimensional electrophoresis technique, coupled with the pre-purification of glycoproteins by lectin column and subsequent identification by mass spectrometry, did not guarantee resultssuited for this class of structures. Therefore, the glycoproteomic comparison of muscle tissues from LARGE and control animals was not effective by this instrumental strategy. Immunoanalytical techniques, highlighting here the western blot, in turn, assured the visualization of the differences in glycosylation of alpha-dystroglycan, and immunoaffinity chromatography experiments undertaken in this work indicate the potential of the specific antibody-antigen interaction in isolation of this glycoprotein for the future study of their attached oligosaccharides. Finally, mass spectrometer analyses of the isolated oligosaccharides residues of the glycoproteins were performed. The results indicated the need for optimization of preparation and purification of these samples more efficiently, but some ions could be related to N-and O-glycans.

A glicosilação é uma das modificações mais comuns ocorridas naturalmente nas cadeias polipeptídicas. As glicoproteínas exercem papéis essenciais para os seres vivos desde o ínicio vida e, por essa razão, qualquer mutação nos resíduos de açúcares a elas ligados causam diversos efeitos não desejados ao indivíduo. O padrão de glicosilação de proteínas é regido tanto por fatores genéticos quanto por fatores externos. Em relação aos defeitos de glicosilação hereditários, diversas mutações em genes específicos causam anormalidades na síntese de glicoproteínas. No grupo de doenças causadas por defeitos de glicosilação hereditários estão incluídas algumas distrofias musculares relacionadas a mutações em proteínas que são glicosiltransferases comprovadas ou putativas. O uso de modelos animais facilita o estudo dessas doenças neuromusculares e, por isso, o presente trabalho foi desenvolvido utilizando tecidos de camundongos controle (C57Black6) e LARGE. O camundongo LARGE possui características fenotípicas semelhantes às de humanos afetados pela distrofia muscular congênita tipo 1D. Diferentes estratégias de análise e de instrumentação foram empregadas para a obtenção de informações relacionadas tanto ao conjunto de glicoproteínas em geral quanto à alfa-distroglicana especificamente. A alfa-distroglicana mostra-se modificada em relação aos resíduos de açúcares nela ligados em animais com mutação no gene LARGE, resultando em diversos problemas de saúde. A técnica de eletroforese bidimensional, aliada à pré-purificação das glicoproteínas por colunas de lectinas e posterior identificação por espectrometria de massas, não garantiu a obtenção de resultados adequados para esta classe de estruturas. Portanto, a comparação glicoproteômica de tecidos musculares de animais controle e LARGE não foi bem sucedida por esta estratégia instrumental. Técnicas imunoanalíticas, em destaque o western blot, por sua vez, garantiram a visualização das diferenças de glicosilação da alfa-distroglicana, e experimentos de cromatografia de imunoafinidade iniciados neste trabalho mostraram o potencial da especificidade de interação anticorpo-antígeno no isolamento desta glicoproteína para estudos futuros de seus resíduos de oligossacarídeos. Finalmente, análises de espectrometria de massas dos resíduos de oligossacarídeos isolados das glicoproteínas foram realizadas. Os resultados obtidos indicaram a necessidade de otimização do preparo e purificação mais eficiente dessas amostras, mas alguns íons puderam ser relacionados a N- e O-glicanas. / Glycosylation is one of the most common modifications that occur naturally in the polypeptide chains. Glycoproteins play key roles in living organisms from the beginning of life and, therefore, any mutation in the sugar residues attached to them may cause many undesirable effects. The glycosylation pattern of proteins is regulated by both genetic and external factors. Regarding hereditary defects of glycosylation, different mutations in specific genes cause abnormalities in the synthesis of glycoproteins. In the group of diseases caused by defective glycosylation are included some hereditary muscular dystrophies, related to mutations in proteins that are proven or putative glycosyltransferase. The use of animal models facilitates the study of neuromuscular diseases and, therefore, this study was conducted using tissues from control mice (C57Black6) and LARGE. The LARGE mouse has phenotypic characteristics similar to those of humans affected by congenital muscular dystrophy type 1D. Different strategies for analysis and instrumentation were employed here to obtain information related both to the set of glycoproteins in general and specifically to alpha-dystroglycan. The alpha-dystroglycan is modified in relation to its linked sugar residues in animals with LARGE gene mutation, resulting in several health problems. Twodimensional electrophoresis technique, coupled with the pre-purification of glycoproteins by lectin column and subsequent identification by mass spectrometry, did not guarantee resultssuited for this class of structures. Therefore, the glycoproteomic comparison of muscle tissues from LARGE and control animals was not effective by this instrumental strategy. Immunoanalytical techniques, highlighting here the western blot, in turn, assured the visualization of the differences in glycosylation of alpha-dystroglycan, and immunoaffinity chromatography experiments undertaken in this work indicate the potential of the specific antibody-antigen interaction in isolation of this glycoprotein for the future study of their attached oligosaccharides. Finally, mass spectrometer analyses of the isolated oligosaccharides residues of the glycoproteins were performed. The results indicated the need for optimization of preparation and purification of these samples more efficiently, but some ions could be related to N-and O-glycans.

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-13T18:45:42Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71849.pdf: 2246590 bytes, checksum: 7639c33dbb5172d14f0b7af9a2d0ab34 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-29T14:14:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71849.pdf: 2246590 bytes, checksum: 7639c33dbb5172d14f0b7af9a2d0ab34 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T14:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71849.pdf: 2246590 bytes, checksum: 7639c33dbb5172d14f0b7af9a2d0ab34 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é considerada uma doença infecciosa negligenciada que causa, anualmente cerca de 15.000 mortes na América Latina, causando impactos econômicos e redução da produtividade em países endêmicos. A expansão da infecção por Trypanosoma cruzi tem induzido avanços científicos na prevenção da doença por meio da vacinação. A principal resposta contra o parasito é celular de perfil Th1 com ativação de linfócitos T CD8+ e produção de citocinas como IFN-\03B3, TNF-\03B1. A construção de vírus recombinantes utilizando o vírus vacinal da febre amarela (VFA) 17DD como vetor para expressão da proteína ASP-2 de T. cruzi, constitui uma promissora abordagem para protótipos vacinais para Doença de Chagas, já estudada por nosso grupo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imunológica induzida por vírus recombinante expressando um fragmento de ASP-2 através da imunização de camundongos C57BL/6 e A/J. Visando melhorar a imunogenicidade, novas construções virais foram realizadas e testadas neste trabalho. Esses vírus recombinantes diferem entre si quanto à plataforma de expressão e quanto ao inserto. O primeiro, VFA Tc1, possui um fragmento maior da protéina ASP-2296-560 expresso na plataforma I, entre as proteínas E/NS1 do VFA 17DD. O segundo possui epítopos imunodominantes para linfócitos T CD8+, TEWETGQI ou VNHRFTLV, expressos entre as proteínas NS2B/NS3 do VFA Análises da expressão do inserto heterólogo nesses vírus indicaram a capacidade de expressar o fragmento inserido, então foi realizada uma predição de epítopos imunodominates restritos a MHC classe I. Epítopos foram selecionados e testados, através da técnica de ELISPOT, em esplenócitos de camundongos imunizados com os vírus recombinantes. A imunização promoveu aumento de células produtoras de IFN-\03B3 responsivas ao inserto de ASP-2. A resposta humoral também foi avaliada, para o vírus da Febre Amarela e para a ASP-2. A maioria dos camundongos obtiveram soroconversão para o vírus FA pela técnica de PRNT, mas não foram detectados anticorpos anti-ASP2 por ELISA, no entanto quando realizada imunofluorescência com os soros dos camundongos imunizados em ninhos de amastigotas, houve marcação, indicando que há anticorpos anti-ASP2 nesses soros. Ensaios de desafio sugerem indução de resposta protetora, indicando tendências de redução de pico parasitêmico assim como retardo na morte de camundongos imunizados / Abstract: Chagas disease is considered an infectious neglected tropical disease that causes, annually, around 15.000 deaths in Latin America, decreasing productivity and causing an economic impact in endemic countries. The expansion of Trypanosoma cruzi infection has led to scientific advances, as new therapies and vaccine candidates. It´s known that the main response against the parasite is Th1, leading to CD8+ T cell activation and cytokine production as IFN-\03B3 and TNF-\03B1. The construction of recombinant viruses using the Yellow Fever 17DD vaccine strain as a vector for T. cruzi ASP-2 protein expression is considered a promising approach for a novel Chagas disease vaccine, which our laboratory has been investigating. This study aim was to evaluate the immune response induced by recombinant viruses expressing an ASP-2 fragment, a protein well known to induce cellular and humoral responses in animal model, through C57BL/6 and A/J mice immunization. Aiming to improve the immunogenicity, new viral constructions were obtained and tested in this study. These recombinant viruses differ in the expression platform and the insert. One of the recombinant virus has the ASP-2296-560 fragment inserted between E/NS1, while the other one has immunodominant CD8+ T cell epitope TEWETGQI or VNHRFTLV, inserted between NS2B/NS3 proteins The heterologous protein expression was evaluate by different assays, and the results showed the recombinant viruses were capable of expressing ASP-2. Thereafter, a MHC class I epitope prediction was performed, and immunodominant epitopes were selected and tested by ELISPOT, using splenocytes from immunized mice. This assay showed that the immunization was able to increase the number of IFN-\03B3 producing cells. The humoral response was also evaluated for 17DD virus and ASP-2. Results from PRNT assay, showed that the majority of the mice, from both lineages, presented serum-conversion for YFV, but anti- ASP-2 antibodies were not detected by ELISA. However, immunofluorescence using cells infected with amastigotes and serum obtained from immunized mice, detected antibodies anti-ASP2. Challenge assays results suggested a protective response in immunized mice, indicating a possible reduction in the parasitemic peak as well a delay in mortality

Orientador: Gil Eduardo Serra / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-21T21:03:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Assis_ElaineMeirede_D.pdf: 4507712 bytes, checksum: 47b546d8fc82531b28946f071612f253 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A parede celular de levedura de fermentação industrial de cerveja (Saccharomyces cerevisiae) é composta basicamente de polissacarídeos, representando um material que pode ter utilização industrial e importante valor econômico. Embora exista um considerável conhecimento da estrutura dos polissacarídeos componentes da parede celular de S. cerevisiae, neste trabalho foram estudadas duas fontes comerciais representadas por: a) células residuais de levedura de fermentação industrial de cerveja; b) parede celular residual de produção de extrato de levedura, com autólise das células referidas no item a. O processo de rompimento das células intactas de leveduras foi realizado em um moinho de esferas de vidro em escala piloto (Dyno-Milí) e otimizado, permitindo atingir aproximadamente 95% de rompimento. O fracionamento delineado permite uma separação seqüencial de frações a partir das paredes brutas, e, praticamente, isolar frações purificadas e homogêneas e assim determinar o polissacarídeo componente de cada uma e indiretamente sua ocorrência nas frações de origem. Cada fração foi quantificada, caracterizada quimicamente e o polissacarídeo teve sua estrutura identificada. Para a verificação da estrutura as amostras foram submetidas às análises por CG-EM, RMN13C e espectrometria de infravermelho (IR). A parede celular obtida por rompimento mecânico apresentou um rendimento de 30% do peso total da célula em base seca. As frações de polissacarídeos isoladas da parede celular obtida por rompimento e parede celular industrial residual apresentaram, respectivamente, um rendimento em peso seco em relação à parede celular de: 16,7 e 11,2% de glicoproteína; 7,1 e 7,8% de manana; 0,8 e 1,0% de glucana álcali solúvel; 59,2 e 63,8% de glucana insolúvel, e 1,8 e 2,2% de glucana ácido solúvel, respectivamente. Quanto à glicoproteína, quatro subtrações foram isoladas, com 1,3 e 2,7% (fração A), 56,3 e 44,2% (fração B), 10,5 e 12,0% (fração C) e, 10,6 e 12,7% (fração D). As três principais frações de polissacarídeos da parede celular, quantitativamente, foram a glicoproteína, a manana e a glucana insolúvel. As duas primeiras tiveram seu polissacarídeo confirmado como a-D-{1->6) manopiranana 2-O-substituída, com ramificações a-D-(1->2) manopiranosidicas e uma unidade terminal não redutora a-D-(1-»3) manopiranosídica; a glucana insolúvel foi confirmada como ß-D-(1->3) glucopiranana. Das subtrações isoladas a partir da glicoproteína através de fracionamento com Cetavlon, a fração mais abundante (Fração B) teve seu polissacarídeo identificado com estrutura idêntica à da fração de manana. O RNA presente na parede celular foi encontrado integralmente na fração A da glicoproteína, o que elimina tal composto das demais frações e subfrações. A parede celular constituída pelo subproduto industrial de autólise, mostrou características gerais similares à da parede separada por rompimento mecânico, ou seja, mesmo exposta a enzimas nativas e outras, durante a autólise, esta parede foi basimente preservada, embora seja possível observar seu comportamento diferenciado quanto à solubilização e dispersão durante as etapas de fracionamento. o trabalho consolida num texto único, novas informações em adição a outras, já descritas de forma segmentada e em condições diversas. / Abstract: The cell wall of yeast (S. cerevisiae) from industrial beer fermentation is composed of polissacharides which can be utilized in the food and others industries. Considerable information about the chemical structure of cell wall polissacharides of S. cerevisiae is related in the literature and was obtained from laboratory cell cultures grown in synthetic media. The aim of this work was to establish a parallel between the fractionation routine, the yield of each fraction and their compositions, using two commercial sources of raw material: a) residual yeast cells from industrial beer fermentation; b) residual cell wall material from the production of yeast extract, with autolysis of the cells referred to in item a. The rupture of the yeast cells was carried out in a pilot glass ball mill (Dyno Mill);this operation was optimized and reached near 95% of cell disruption. The fractionation design for the sequential separation of the fractions obtained from the cell wall, allowed for the isolation of virtually homogeneous purified fractions and the polysaccharide component's of each one could then be determined and indirectly their ocurrence in the original fractions. Each fraction was quantified, characterized chemically and identified structurally. The samples were subjected to GC-MS, 13C NMR and IR spectroscopy in order to determine the structure. The cell wall obtained mechanical rupture showed a yield of 30% of the dry cell weight. The purified polissacharide fractions of cell walls obtained from the mechanical rupture of cells and from the cell walls of industrial residues showed, respectively, the following yields in dry weight related to the cell wall: 16.7 and 11.2% of glycoprotein; 7.1 and 7.8% of mannan; 0.8 and 1.0% of alkali soluble glucan; 59.2 and 63.8% of insoluble glucan and 1.8 and 2.2% of acid soluble glucan. From the glycoprotein four subfractions were isolated with yields of: 1.3 and 2.7 %, fraction A; 56.3 and 44.2%, fraction B; 10.5 and 12.0 %, fraction C and 10.6 and 12.7 %, fraction D. The three quantitatively main fractions of cell wall polissacharides were glycoprotein, manan and insoluble glucan. The polissacharide of the former two fractions was confirmed as 2-O-substituted a-D- (1->6) mannopyranan with a-D-(1-»2) mannopyranosidic branches and a non- reducing terminal unit of a-D-(1->3) mannopyranoside; the insoluble glucan being ß-D-(1->3) glucopyranan. From the subfractionation of the glycoprotein using Cetavlon, the polissacharide of the most abundant subtraction (B) showed a structure identical to that of the mannan fraction. The RNA present in the cell wall was almost totally found in subtraction A, practically eliminated this compound from the other fractions and subtractions. The cell wall byproduct from industrial autolysis, showed almost the same general characteristics when compared to that from mechanical rupture, i.e., even when exposed to native and others enzymes during autolysis, it was basically preserved, although a different behaviour with respect to solubilization and dispersion during the fractionation procedures was observed. This work consolidates in one publication some new information together with information already described but in a fragmented form and obtained under a variety of conditions. / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los astrocitos son el tipo celular más abundante de la glia en el Sistema Nervioso Central y cuando son expuestos a factores sanguíneos durante un daño cerebral, éstos se vuelven “reactivos”, cambiando su forma estrellada a una de tipo fibroblasto. Los astrocitos “reactivos” también proliferan y migran al sitio dañado para formar la cicatriz glial, constituyendo uno de los mayores impedimentos para que ocurra la regeneración neuronal. Se piensa que estos cambios morfológicos que sufren los astrocitos in vivo, podrían tener una relación con los gatillados in vitro por Thy-1, una glicoproteína neuronal muy abundante, que se une a la Integrina αVβ3 en la membrana de astrocitos provocando cambios dramáticos en la forma de estas células. Con estos antecedentes se planteó la hipótesis de que la estimulación sostenida de la Integrina αVβ3por Thy-1 provoca la migración y/o proliferación de astrocitos, activando vías de transducción de señales que involucran a las proteínas quinasa PI3-K y Erk, respectivamente. Para poner a prueba esta hipótesis, se utilizaron ensayos in vitro de cicatrización de herida, la cual consiste en la remoción de una porción de células desde una monocapa de astrocitos en cultivo de la línea celular de rata DI-TNC1 con punta de pipeta y el subsecuente monitoreo de la migración de éstos al área libre de células después de la estimulación con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Adicionalmente, se realizaron en paralelo, análisis de Inmunofluorescencia indirecta a diferentes tiempos para la visualización de estructuras de avance como filopodios y lamelipodios en los astrocitos del borde de la herida estimulados con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Para demostrar la participación de la enzima PI3-K, los ensayos de cicatrización de herida se realizaron en presencia de inhibidores específicos de esta quinasa como son LY294002 y Wortmanina y mediante técnica de Inmunoblot se determinaron los niveles de fosforilación de un sustrato de esta enzima, la proteína Akt, en los astrocitos estimulados con el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A. Para determinar si el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A inducía cambios en la proliferación y viabilidad de los astrocitos, se utilizaron técnicas de MTS y de exclusión de azul de tripán, así como también se analizó el ciclo proliferativo de éstas células por citometría de flujo. Los resultados demuestran que Thy-1: 1) Induce la migración de los astrocitos DI-TNC1 al sitio de la herida; 2) Induce una mayor formación de estructuras de avance y migración como filopodios y lamelipodios, en los astrocitos del borde de la herida; 3) No induce proliferación ni aumento de la viabilidad de los astrocitos como tampoco cambios significativos en el ciclo proliferativo de éstas células; y 4) La quinasa PI3-K está implicada en la migración de los astrocitos estimulados por Thy-1. En conjunto, estos datos sugieren que la interacción de Thy-1 con la Integrina αVβ3 en la membrana de los astrocitos estimula cambios morfológicos llevando a estas células a una mayor adhesión celular para luego inducir su migración. Cabe destacar que la secuencia de eventos observados in vitro en este trabajo es similar a lo que ocurre en el proceso de astrogliosis, en el cual luego de un daño cerebral, los astrocitos se tornan reactivos, migran al sitio dañado y producen la cicatrización de la herida / Financiamiento: FIRCA 1R03TW006024 - FONDECYT 1040390 - FONDECYT 1070699

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El virus herpes canino tipo 1 (CaHV1) provoca una enfermedad hemorrágica mortal en cachorros menores de cuatro semanas, mientras que en cachorros mayores de cuatro semanas produce algunos signos clínicos de menor gravedad como rinitis, faringitis o conjuntivitis. En adultos, es capaz de producir afecciones oculares y trastornos en la reproducción, y es un patógeno participante de la denominada “tos de las perreras”. El gen que codifica para gB, una glicoproteína presente en la envoltura viral, se encuentra descrito en una gran variedad de virus herpes, debido a que es esencial para el proceso de ingreso del virus a la célula y así definir la ruta de neuroinvasión. Este trabajo se realizó en los laboratorios de Virología y Microbiología del Departamento de Medicina Preventiva Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile y su propósito fue contribuir a la caracterización molecular del aislado viral RP5, y confirmar la presencia de un virus herpes nativo, mediante la detección del gen de la glicoproteína B usando la reacción de la polimerasa en cadena (PCR). Los resultados obtenidos permiten demostrar una alta sensibilidad de la técnica implementada y una especificidad superior a otro protocolo de PCR implementado en otra memoria de título. Así, un porcentaje de identidad nucleotídica de 97% respecto de la secuencia publicada en GenBank permite calificar este protocolo como un serio aspirante a convertirse en un método diagnóstico para CaHV1 en Chile y por otra parte concluye que el aislado RP5 nativo corresponde a CaHV1. Finalmente, con este estudio confirmatorio el aislado RP5 podrá ser nombrado oficialmente como AFLC-61, la cepa chilena de CaHV1 / Financiamiento: Programa AUCAI, Universidad de Chile

Os hantavírus, membros da família Bunyaviridae, são os agentes infecciosos responsáveis pela Febre Hemorrágica com Síndrome Renal e pela Síndrome Cardiopulmonar por Hantavírus. São vírus com genoma constituído por três segmentos de RNA fita simples, de polaridade negativa, designados como S, M e L, que codificam, respectivamente, a nucleoproteína, as glicoproteínas G1 e G2 e a RNA polimerase dependente de RNA. Com o objetivo de estudar a montagem de pseudopartículas quiméricas de hantavírus, a proteína N do vírus Araraquara e as glicoproteínas G1 e G2 do vírus Andes foram expressas em sistema baculovírus. A microscopia confocal mostrou a colocalização das proteínas G1 e G2 com a proteína N. Pelos ensaios de imunoprecipitação e de centrifugação em gradiente de sacarose, foi observada a interação entre as proteínas N, G1 e G2. Nas análises por microscopia eletrônica de transmissão foi observada a montagem do pseudo-hantavírus quimera, com morfologia semelhante ao do vírion. O pseudo-hantavírus quimera obtido neste estudo poderá, no futuro, ser utilizado em estudos imunológicos, estruturais e morfológicos. / Hantaviruses, members of the Bunyaviridae family, are the infectious agents responsible for Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome and the Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome. The viral genome is composed by three segments of single-stranded negative-sense RNA, designated as S, M and L, which encode, respectively, the nucleoprotein, the G1 and G2 glycoproteins, and the RNA-dependent RNA polymerase. In order to study the assembly of a chimeric hantavirus-like particle, the Araraquara nucleoprotein and the Andes glycoproteins were expressed in a baculovirus system. Confocal microscopy showed the colocalization of G1 and G2 proteins with the N protein. Immunoprecipitation assay and sucrose density gradient showed the interaction among N, G1 and G2 proteins. The transmission electron microscopy showed the hantavirus-like particle with the same morphology of the virion. The chimeric hantavirus-like particle produced in this study could be used, in the future, in immunological, structural and morphological studies.