Orientador: Prof. Dr. Jean Jacques Bonvent / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / Arcabouços são estruturas de inserção para suporte e regeneração de tecidos biológicos. Vários estudos mostraram que, quando constituídas por nanofibras de biopolímeros, essas estruturas tridimensionais apresentam características favoráveis, tais como biocompatibilidade, não-toxicidade e biodegrabilidade, para adesão e proliferação de componentes da matriz extra-celular. Este trabalho teve como objetivo desenvolver nanofibras poliméricas à base de Poli (álcool vinílico) (PVA) e quitosana, avaliar suas características morfológicas e atividade bactericida in vitro para possível aplicação como arcabouço para reparo tecidual. Filmes com nanofibras poliméricas foram obtidos pelo método de eletrofiação com diferentes parâmetros da solução polimérica, formada pela mistura de dois biopolímeros, o PVA (10%) e a Quitosana (1%). A morfologia dos filmes foi estudada por imagens de microscopia de força atômica (AFM) e microscopia eletrônica de varredura (MEV), comparando o diâmetro das estruturas das nanofibras obtidas de acordo com as mudanças dos parâmetros da solução polimérica. A análise da estrutura molecular dos filmes foi realizada por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR-ATR); a análise térmica e mecânica das amostras foi efetuada por análise termogravimétrica (TGA) e análise dinâmica mecânica (DMA), respectivamente. Como teste de bioatividade, as amostras foram postas em contato com bactérias Staphylococcus aureus (ATCC 6538) para análise de inibição de crescimento. As nanofibras foram obtidas com o diâmetro variando de acordo com a proporção de quitosana na solução polimérica, além de obter fibras mais uniformes e com menos contas com PVA. As blendas de PVA e Quitosana foram obtidas de forma homogênea com aumento da estabilidade térmica e menos resistente a deformação, além de preservar características intermoleculares de cada polímero em suas blendas. Nanofibras com diferentes frações de quitosana em solução polimérica não foram capazes de inibir o crescimento de bactérias, apresentando atividade bactericida somente quando misturadas ao cloridrato de tetraciclina (1%). Tais arcabouços necessitam de estudos mais aprofundados para a aplicação na engenharia de tecidos, para a promoção do reparo tecidual. / Scaffolds are materials applied for support and tissue regeneration. Nanofibers produced by polymeric matrix should attend some basics demands for scaffolds such as being biocompatible, nontoxic, biodegradable, allowing adhesion and growing of the matrix extra cellular components (fibroblast, collagens and integrins). The aims of this work was to develop polymeric nanofibers, with morphological characteristics and bactericidal activity for cell proliferation, as future scaffold candidate for skin wound repair. The polymeric nanofibers were obtained by electrospinning method with different solutions parameters of a mixture of Poly (vinyl alcohol) (PVA) (10 %) and Chitosan (1%). Atomic Force Microscopy (AFM) and Scanning Electron Microscopy (SEM) was used in order to analyze the morphology of scaffold surface, in terms of fiber diameter and density, as well as surface layers porosity. Molecular analysis was performed with Fourier Transformed Infrared (FTIR-ATR mode); Thermal and mechanical properties of the scaffold were investigated by means of TGA and DMA, respectively. As bioactivity test, samples were placed in contact with Staphylococcus aureus bacteria (ATCC 6538) for growth inhibition analysis. The nanofibers were obtained with the diameter varying with the proportion of chitosan in the polymer solution, plus fibers uniform and less beads with PVA. The blends of PVA and chitosan were obtained homogeneously with increased thermal stability and less resistant to deformation, in addition to preserving intermolecular characteristics of each polymer in their blends. Nanofibers with different fractions of chitosan polymer solution were unable to inhibit the growth of bacteria, showing bactericidal activity only when mixed with tetracycline hydrochloride (1%). Such frameworks require further study for application in tissue engineering, to promote tissue repair.

Orientador: Prof. Dr. Felipe Chen Abrego / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / Na indústria de laticínios, são comuns os mais diversos tipos de fraudes, que em geral consistem na diluição do produto com outras substancias, com a intenção de aumentar o lucro. Devido às diversas possíveis conseqüências da contaminação do leite, existe a necessidade de desenvolvimento de métodos para detecção de tais fraudes, que possam ser aplicadas na indústria. As técnicas atualmente usadas vão desde testes químicos, até diversas formas de espectroscopia. Aqui propomos usar espectrometria gama como método para indicar possíveis contaminações no leite UHT. Através da medida do coeficiente de atenuação linear e do coeficiente de atenuação mássico do leite, podemos indicar mudanças na composição do mesmo, sendo que, contaminantes comuns como a água e a uréia parecem alterar o coeficiente de atenuação. Usando uma fonte de 133Ba, encontramos o coeficiente de atenuação mássico do leite e da água e de soluções com uréia para as energias de 32 keV, 81 keV e 360 keV. Os valores encontrados mostram que o leite tem um coeficiente de atenuação mássico mais alto que a água e uréia e que este tende a diminuir com a adição destes. Uma das mais importantes dificuldades no uso da técnica são as incertezas no processo, sendo que, a mais significativa é a decorrente da natureza estatística do processo de decaimento. Dentre as 3 energias usadas, a energia de 32 keV apresentou resultados mais próximos da teoria e menor incerteza que os picos de 81 e 360 keV. Atribuímos isso principalmente a maior intensidade do pico, que tem como efeito diminuir a incerteza decorrente do processo estatístico de decaimento, mas também ao fato da diferença entre os coeficientes de atenuação mássica das substancias analisadas ser maior para baixas energias. Com concluímos que para esse tipo de aplicação, é recomendável o uso de energias baixas, próximos de 32 keV, ou mesmo mais baixos. Independente da energia usada, fontes com alta intensidade também são recomendados. O coeficiente de atenuação pode ser usado para indicar alterações na composição do leite, porém, assim como com a densidade, não há como determinar precisamente a substancia adicionada, sendo necessário para isso outros testes. / In the dairy industry, there are many common types of frauds, which, in general, consist in the addition of other substances to the product, with the intent of increasing profit. Due to the possible consequences of milk contamination, there is the need of developing several methods for detection of such frauds that can be applied in industries. The techniques usually used go from chemical tests to several kinds of spectroscopy. Here we propose to use gamma spectroscopy as method to indicate possible contaminations in UHT milk. Through the measure of the linear attenuation coefficient and the mass attenuation coefficient we can indicate changes in the composition of milk, considering that additions of water and urea seem to change the attenuation coefficient. Using a gamma source of 133Ba, we found the mass attenuation coefficient of milk and water and solutions of urea in the energies of 32, 81 and 360 keV. The experimental results found indicate that milk has a higher mass attenuation coefficient, and it tends to decrease with the addition of water and urea. One of the main difficulties of the use in this technique is the uncertainties in the process, being the main one due to the statistical nature of the decay process. Among the 3 energies used, the energy of 32 keV presented the closest results to theory, and less uncertainty than the 81 and 360 keV peaks. We attribute that mainly to the bigger intensity of the peak, which has as effect lowering the uncertainty during the statistical process of decay, but also to the fact that the difference in the mass attenuation coefficient of the substances in analysis is higher for lower energies. With this we conclude that for this kind of application, it¿s recommended the use of low energies, close to 32 keV or even lower. Regardless of the energy used, sources with high intensity are recommended. The mass attenuation coefficient can be used to find changes in the composition of the milk, but alone, just like with density, it can¿t precisely determine the source of change, other tests being necessary for that purpose.

Orientadora: Prof. Dra. Marcella Pecora Milazzotto. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A maturação de oócitos in vitro é amplamente utilizada para produção de embriões e tenta mimetizar as condições fisiológicas foliculares, permitindo a capacitação oocitária. No entanto, as condições foliculares a que os oócitos estão submetidos previamente a aspiração podem ser responsáveis por diferenças que serão refletidas no fenótipo embrionário. O objetivo deste trabalho foi quantificar marcadores metabólicos no fluido folicular (FF) e transcritos das células da granulosa (CG) de bovinos envolvidos na capacitação do oócito e sua relação com a competência embrionária (avaliada pela cinética e desenvolvimento a blastocisto). Para isso, foram aspirados individualmente complexo cumulus-oocito (COCs) e respectivos FFs e CG de folículos de 7-8mm de ovários de abatedouro comercial. As moléculas de glicose, colesterol, estradiol e piruvato foram quantificadas nos FFs por fluorimetria e os transcritos de receptor de FSH (FSH-R), receptor de angiotensina II (AngIIAT2), receptor de EGF (EGF-R) e aromatase (CYP19A) foram quantificados nas CG por RT-PCR. Os COCs foram fecundados e cultivados individualmente in vitro e os índices de clivagem e cinética embrionária foram avaliados as 40hpi e índices de blastocistos as 186hpi. Posteriormente os dados de desenvolvimento embrionário foram analisados em função dos dados dos respectivos FF e CG. Foram realizadas as seguintes comparações: não clivados x clivados (NCL x CL), clivados rápidos (> 4 células as 40hpi) x clivados lentos (< 4 células as 40hpi) (CLR x CLL), desenvolvimento a blastocisto x bloqueado (BL x NBL), clivados que se desenvolveram a blastocisto x clivados bloqueados (CLBL x CLNBL) e blastocistos derivados do grupo rápido x derivados do grupo lento (BLR x BLL). Os dados foram analisados pelo programa SAS System for Windows pelo teste t de Student, e o nível de significância de 5%. Não houve diferença entre os índices de CLR e CLL (19,2±3,8% e 25,1±3,8%, respectivamente). Da mesma forma, nenhum dos metabólitos e transcritos analisados foram distintos entre CLR x CLL, tampouco NCL x CL, a exceção do FSHR, que foi menos expresso CL, BL e CLBL quando comparados a NCL, NBL e CLNBL. O índice de BL foi (27,3±3,9%) e maior índice de blastocisto foi para BLR do que BLL (18,5±2,7% e 8,8±2,5%, respectivamente). BL e CLBL apresentaram maior quantidade de piruvato e colesterol, aumento de CYP19 e, no caso de CLBL, ainda maiores níveis de ANGII e EGF-R 2 quando comparados a NBL e CLNBL. Em relação a cinética de desenvolvimento, CLR e BLR apresentaram aumento de ANGII e estradiol. Além disso, BLR ainda apresentaram diminuição de CYP19 e EGF-R, sugerindo uma alta atividade esteroidogênica mais relacionada à secreção do que com a síntese de esteroides, provavelmente por um efeito negativo do estradiol no controle da expressão destes genes. Os dados deste estudo permitem concluir que o status folicular tem relação direta com a habilidade do oócito a se desenvolver a blastocisto. Além disso, o aumento da disponibilidade de substrato energético e da capacidade esteroidogênica parece influenciar positivamente a capacitação oocitária. Da mesma forma, embriões de cinética distinta parecem ser derivados de folículos com atividade esteroidogênica distinta. / Follicular conditions established prior to aspiration for in vitro maturation may be responsible for differences that will reflect in the embryonic phenotype. In this work, cumulus-oocyte complex (COCs) and their respective follicular fluid (FF) were individually aspirated from slaughterhouse ovaries. Metabolic biomarkers as glucose, pyruvate, cholesterol and estradiol were quantified in FF by fluorimetry. Specific granulosa cells (GC) transcripts related to oocyte capacitation and steroidogenic capacity such as aromatase (CYP19A), FSH (FSH-r), angiotensin II (ANGII AT2) and EGF (EGF-r) receptors were quantified by RT-PCR. Bovine embryos were produced in vitro following conventional protocols. Embryos were cultured individually and divided into: Fast (> 4 cells at 40 hpi) and Slow (< 4 cells at 40hpi). Blastocyst rates and embryonic competence (evaluated through developmental kinetics and blastocysts rates) were assessed at 186hpi. Embryonic development data was analyzed in function of FF and GC results by comparing: non-cleaved vs. cleaved (NCL x CL), fast vs. slow (CLF x CLS), development to blastocyst x blocked (BL x NBL), cleaved that reached blastocyst stage vs. cleaved that blocked (CLBL x CLNBL) and blastocysts originated from fast vs. slow (BLF x BLS). Embryonic development, quantification of metabolites and transcripts were compared by Student t test using SAS for Windows considering á=5%. Cleavage rates were not different between fast and slow embryos (19.2±3.8% and 25.1±3.8%, respectively). Except for FSH-r, that was less expressed in CL, BL and CLBL than their respective counterparts NCL, NBL and CLNBL, all the other metabolites and transcripts did not present any differences. Total blastocyst rate was 27.3±3.9%, being 18.5±2.7% from BLF and 8.8±2.5% from BLL groups. BL and CLBL presented higher amounts of pyruvate and cholesterol, and an increased expression of CYP19 when compared to NBL and CLNBL, respectively. Also, CLBL presented higher levels of ANGII AT2 and EGF-r than CLNBL, suggesting that BL and CLBL derived follicles have a greater steroidogenic capacity. Regarding developmental kinetics, CLR and BLR presented an increase in ANGII AT2 and estradiol and diminished levels of CYP19 and EGF-R, suggesting an elevated secretion of steroids. Therefore, BLL, with increased expression of CYP19 and EGF-r under lower levels of estradiol and ANGII AT2 are preferably directed to the synthesis than secretion of this hormone. In summary, our results show that follicular status is direct ly related to the oocytes 4 ability to develop to blastocyst. In addition, the increased availability of energy substrates and steroidogenic capacity appears to positively influence the oocyte capacitation. Likewise, embryos with distinct developmental kinetics seem to originate from follicles with distinct steroidogenic activity.

Orientador: Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A hidrolise enzimatica da celulose e realizada pela acao sinergica de pelo menos tres tipos de celulases distintas: endoglucanases, exoglucanases e ¿À.glicosidases. As endoglucanases e celobiohidrolases sao frequentemente inibidas pelo aumento da concentracao de celobiose (dimero de glicose) no meio reacional. As ¿À-glicosidases sao enzimas que clivam celobiose em monomeros de glicose. Portanto, as ¿À-glicosidases sao essenciais ao processo de hidrolise da celulose por impedirem o acumulo de celobiose e, assim, evitar a diminuicao da taxa de hidrolise. Processos de pre-tratamento da biomassa lignocelulosica sao empregados, antes da reacao de hidrolise enzimatica da celulose, a fim de retirar a fracao de lignina e aumentar a taxa de conversao da celulose em glicose. Porem, estes processos de pre-tratamento da biomassa lignocelulosica nao sao 100% eficientes na remocao da lignina. Estudos previos mostraram que a adicao de lignina a celulose pura pode causar a reducao da liberacao de acucar em valores superiores a 60%. Assim, neste estudo, nos caracterizamos a adsorcao nao produtiva da enzima ¿À-glicosidase da familia GH1 da bacteria Thermotoga petrophila (TpBGL1) em ligninas extraidas de diferentes biomassas (cana-de-acucar e eucalipto). Em pH 7 e 6, nossos resultados indicaram que a repulsao eletrostatica enfraquece a adsorcao nao produtiva de TpBGL1 em ligninas. Contudo, em pH 4 a atracao eletrostatica fortalece a adsorcao nao produtiva. Alem disso, o aumento da temperatura de 25 oC para 70 oC nao resultou em um aumento significativo da adsorcao de TpBGL1 em ligninas, provavelmente porque nao ocorre um aumento significativo de regioes hidrofobicas na estrutura da enzima expostas ao solvente. Todas as informacoes obtidas neste estudo poderao ser uteis para aplicacoes biotecnologicas no campo de conversao de polissacarideos estruturais em bioenergia. / The enzymatic hydrolysis of cellulose to glucose requires at least three types of enzymes working synergistically: endoglucanases that randomly cleave the â-1,4-glycosidic linkages of cellulose, cellobiohydrolases which cleave off cellobiose units from the reducing or nonreducing end of cellulose chain, and â-glucosidases responsible for hydrolysis of the released cellobiose to glucose. Endoglucanases and cellobiohydrolases are normally inhibited by cellobiose, therefore, â-glucosidases are essential to avoid the decrease the hydrolysis rates of cellulose over time due to cellobiose accumulation. The presence of residual lignin after pretreatments may affect negatively the enzymatic hydrolysis of cellulose to glucose. Cellulases bind to lignin, deactivating the enzymes and reducing the overall enzymatic activities. In this study, we examined the non-productive adsorption of one â-glucosidase from Thermotoga petrophila, belonging to the family GH1, on the lignin preparations from both sugarcane (grasses) and eucalyptus (hardwood). GH1 â-glucosidase adsorption onto lignins was found to be strongly pH-dependent, suggesting that the adsorption is electrostatically modulated. At pH 7 and 6, electrostatic repulsion weakens the non-productive adsorption of GH1 â-glucosidase to lignins. However, at pH 4, attractive electrostatic interactions strengthen the non-productive adsorption of GH1 â-glucosidase to lignins. Finally, the increase of temperature did not result in the increase of GH1 â-glucosidase adsorption, probably because there is no significant increase in hydrophobic regions in the GH1 â-glucosidase structure. These studies can be useful in the field of plant structural polysaccharides conversion into bioenergy.

Orientadora: Profa Dra Carlos Alberto Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / No Brasil a especie com maior numero de registros de acidentes ofidicos e a serpente Bothrops jararaca (Bj). Os efeitos causados pelo envenenamento amplamente caracterizados sao inflamacao no local, edema, necrose tecidual no local da picada e, acoes sistemicas, como hemorragia, coagulopatia e hipotensao arterial. Os efeitos observados ocorrem em funcao da presenca de metaloproteinases, fosfolipase, disintegrinas e peptideos biologicamente ativos presentes no veneno. Apesar disso, nao ha relatos na literatura sobre os eventuais efeitos do envenenamento no sistema reprodutor masculino de pacientes acidentados. Assim, em linhas gerais, o presente estudo visa avaliar os efeitos de componentes presentes no veneno de Bj sobre o testiculo de camundongos. Animais machos (n=6 por grupo) com 2 meses de idade, com peso entre 30 e 35 g foram separados em dois grupos. No primeiro grupo, estao os animais tratados com fracao peptidica (FP), solucao contendo componentes presentes no veneno de Bj com peso molecular inferior a 10 KDa, via intratesticular (i.t) na dose de 5¿Êg diluida em 20 ¿ÊL de solucao salina em dose unica, enquanto que o outro grupo recebeu FP com concentracao de 5¿Êg diluida em 20 ¿ÊL de solucao salina durante 15 dias via intraperitoneal (i.p). Apos o periodo de tratamento, os animais foram eutanasiados e tiveram os testiculos fixados e submetidos a analises morfologica e morfotmetrica. Posteriormente, um outro grupo de animais (n=6) foi tratado via intramuscular, e fragmentos de musculo e testiculo foram submetidos a analise por FT-Raman. Os resultados mostraram que a FP, quando injetada via i.p ou via i.t, provocam intensas alteracoes no epitelio seminifero. Ainda, a FP promoveu o aumento na quantidade de alguns tipos celulares (Espermatocito paquiteno; Espermatide circular; e Figuras meioticas) com papel importante na espermatogenese quando tratados via i.p, e diminuicao no numero de celulas germinativas (Esermatocito paquiteno; Espermatide circular; Espermatogonia tipo B; e Espermatocito zigoteno) durante os estadios de espermiogenese quando tratados via i.t., sendo que os valores de celulas obtidas apresentam diferencas estatisticas com valor de p<0,05. Para avaliar os efeitos toxicologicos do veneno sobre o testiculo, foi empregada a tecnica FT-Raman, que se mostrou efetiva na caracterizacao do envenenamento analisando fragmentos de musculo estriado esqueletico, assim como, pelas analises morfologica do musculo e niveis sericos de creatino quinase. Entretanto, quando aplicada a tecnica FT-Raman na analise de testiculo, nao foi possivel identificar alteracoes que evidenciaram a acao toxicologica do veneno sobre este orgao. Apesar disso, analise dos espectros pelo estudo dos componentes principais, verificou-se diferencas no grupo tratado com veneno botropico em relacao ao controle. Assim, os dados obervados abrem possibilidades de estudo utilizando outras tecnicas para avaliar niveis de expressao de proteinas importantes que indicam eventuais comprometimentos da espermatogenese. / The Bothrops jararaca snake shows the highest number of accidents recorded by the health ministry in Brazil. The effects caused by envenomation can be characterized by edema, tissue necrosis in the local bite and, systemic actions, such as bleeding, coagulopathy and hypotension. These effects are caused by metalloproteinases, phospholipase, disintegrins andbiologically active peptides present in the venom. However, there are no reports in the literature. In the present study, we evaluated if the envenomation effects induced via i.m cause changes on the testis functionality. Male animals at 2 months of age and weighing between 30g and 35g, were divided into 2 groups. The first one received peptide fraction (FP), solution containing components present in Bj venom with a molecular weight below 10 kDa, with dose about 5ìg diluted in 20ìL of saline solution, via intratestis (i.t) in single dose, while the second group received FP 5ìg diluted in 20ìL of saline solution via intraperitoneal (i.p) once a day, during 15 days. Subsequently another group of animals was poisoned, so induced via intramuscular, and testis and muscle were collected after 24h of treatment, and the fragments were subjected to analysis by FT-Raman. FP affected the seminiferous epithelium structure in the groups treated via i.p. and via i.t. Quantitative analysis of seminiferous epithelium showed an increase of some cell types (Spermatocyte pachytene; Spermatid circular; and Meiotic figures) with an important role in spermatogenesis when treated via i.p., and decrease in the number of germ cells (Spermatocyte pachytene; Spermatid circular; Spermatogonia type B, and Spermatocyte zygotene) during the stages of spermatogenesis when treated via i.t. The differences of number of germ cells obtained between the groups show statistical diference with p value <0.05. To evaluate the toxicological effects of the poison on the testis, we used the FT-Raman. The technique was effective in muscle fragments analyses. confirming morphology analysis and the level of creatine kinase, however, when applied the FT-Raman technique in testicular analysis was not possible to identify changes that can complete toxicological poison action on this body as to derail matured germ cells, although further analysis of the spectra, which uses key components, showed differences, opening possibilities to invest time in different analyzes that can prove or disprove this hypothesis.

Orientador: Prof Dr Luciano Soares da Cruz / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / As alterações climáticas vêm se tornando cada vez mais acentuadas e preocupantes. É muito provável que ocasionem impactos diretos na agricultura e, consequentemente, na produção de alimentos. Com isto, são necessários mais estudos para mensurar os efeitos destas mudanças em nosso ecossistema. Com este intuito, estudamos as modificações dos voláteis emitidos por plântulas de soja, quando estas são expostas à índices de radiação ultravioleta diferentes da incidência natural solar. Os compostos orgânicos voláteis têm papel fundamental em diversas interações ecológicas e são produtos do metabolismo secundário, em especial, participam do sistema de defesa química das plantas. No presente estudo, caracterizamos o bouquet dos compostos orgânicos voláteis associados a ontogênese da soja, especialmente, focamos nossos estudos nos estádios V1 a R5 e determinamos os monoterpenos, sesqueterpenos, voláteis das folhas verdes e oxigenados para cada um deles. Também avaliamos o bouquet dos voláteis em plantas de soja que foram crescidas desde a germinação em ambientes com excesso de radiação UV (UV+), na ausência de UV (UV-) e na composição habitual da incidência solar (UV0), que era nosso controle. Nestes experimentos com UV, observamos não apenas variação nas quantidades dos voláteis emitidos, o que é uma resposta proporcional direta ao nível de dano, mas também mudanças claras no bouquet, com a priorização da emissão de uma classe específica de voláteis em relação a outra, sugerindo que tanto o tipo de agente estressor quanto a intensidade da sua atuação são importantes para a escolha das estratégias de defesas químicas das plantas. A partir de nossos resultados, deduzimos que a cultivar Sambaíba possui um complexo sistema de defesas que está intimamente associado a fotorreceptores específicos que são ativados na presença da radiação ultravioleta, tornando-a bem adaptada as regiões em que a incidência solar é elevada, como as regiões norte e nordeste, em que é amplamente cultivada. / Climate changes are increase and worrying us by their possible outcomes. In fact, they are affecting the agriculture and, consequently, the food production. Thus, more studies are needed to measure the real effects of these changes in our ecosystem. For this reason, we studied the volatile emission for soybean seedlings when they are exposed to ultraviolet radiation different of the natural solar spectrum. The volatile organic compounds have essential functions on various ecological interactions and are products of secondary metabolism; in particular, they participate in chemical defense system of the plants. In this work, we characterize the bouquet of volatile organic compounds associated with soybean ontogenesis, especially focusing our studies on stages from V1 to R5 and determining the quantity of monoterpenes, sesqueterpenes, oxygenates and green leaves volatiles for each stage. We also evaluate the volatile bouquet emitted by soybean seedlings that were grown from germination to stage V3 in three different environments: with excess of UV radiation (UV +); in the absence of UV radiation (UV- ) and with usual composition of sunlight (UV0), which was our control. In these experiments, we observed not only variation in the emitted volatile quantity, which is a proportional to the level of damage, but also distinct changes in the bouquet, with the prioritization of the some specific class of volatile relative to another, suggesting that both, the type of stressor and its intensity, are important in the choice of the chemical defenses routes for the plants. From our results, we conclude the Sambaíba soybean has a complex defense system which is closely linked to specific photoreceptors, which are activated in the presence of ultraviolet radiation. It makes this soybean variation well adapted to the regions with strong sunlight intensities, such as Brazilian North and Northeast, where it is widely cultivated.

Orientadora: Prof. Dra. Fernanda Dias da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A microplusina e um peptideo antimicrobiano, quelante de Cu2+ e Fe2+, isolado do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Estudos com macrofagos murinos, derivados de camundongos C57BL/6, demonstraram que a microplusina induziu a producao de TNF- ¿¿ e IL-6, independente da adicao de mediadores do sistema imune como o LPS e IFN-¿Á e potencializou a atividade dos macrofagos estimulados com IFN-¿Á, aumentando a sintese de NO e TNF-¿¿, o que sugere uma possivel atividade pro-inflamatoria da microplusina. Porem, estudos adicionais eram necessarios a fim de se elucidar sua atividade imunomoduladora. Sendo assim, este projeto teve como objetivo investigar a capacidade da microplusina induzir respostas anti-inflamatorias, atraves da sintese da enzima arginase I, ou pro-inflamatorias, atraves da sintese de oxido nitrico (NO), em macrofagos J774, derivados de camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que a microplusina recombinante (25¿Êg/mL) induziu a producao de arginase I, com 6 horas de estimulo, com igual eficacia ao controle positivo estimulado pelo extrato de Bordetella parapertussis (30¿Êg/mL), porem nao foi capaz de induzir a sintese de NO, independente da dose do peptideo (5, 25 e 50 ¿Êg/mL), do tempo de estimulo da cultura (24h ou 72h) ou mesmo da adicao de IFN-¿Á (500 pg/mL), o que indica um efeito anti-inflamatorio da microplusina sobre essas celulas. Essa divergencia de resultado entre as duas linhagens pode ser devido a um perfil de respostas imune distinto entre as mesmas. Macrofagos derivados de camundongos BALB/c sao menos sensiveis ao estimulo com IFN-¿Á do que macrofagos derivados de C57BL/6, consequentemente produzindo menos NO. Por outro lado, a linhagem J774 tambem tende a produzir respostas anti-inflamatorias, como por exemplo, a arginase I, em resposta ao LPS. Os dados obtidos mostram que o efeito imunomodulador da microplusina pode variar de uma linhagem celular para outra, sendo necessarios mais estudos a fim de elucidar melhor seu potencial imunomodulador, para que futuramente possa ser estudada em modelos de infeccao. / The microplusin is an antimicrobial peptide, chelating of Cu2+ and Fe2+, isolated from the wood tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Studies with murine macrophages, extracted from C57BL/6 mouse, demonstrated that the microplusin induced the production of TNF-á and IL-6 by these cells, regardless of the addition of mediators of the immune system such as the LPS and IFN-ã, and it also enhanced the macrophages activity stimulated by IFN-ã, increasing the synthesis of NO and TNF-á, suggesting a potential post inflammatory microplusin activity. However, further studies were necessary to elucidate its immunomodulatory effect. Therefore, this project aimed to investigate the ability of microplusin to induce anti-inflammatory responses through the production of the arginase I enzyme, or proinflammatories, through the production of nitric oxide (NO) in the J774 macrophages lineage, derived from BALB/c mouse strain. The results show that recombinant microplusin (25ìg/ml) induced the production of arginase I, within 6 hours of stimulation, having equal efficacy as the positive control stimulated by the extract Bordetella parapertussis (30ìg/ml), but it was not able to induce the production of NO, independently of the peptide dosage (5, 25 e 50 ìg/mL), culture stimulus time (24h or 72h), or even adding IFN-ã (500 pg/mL), indicating a microplusin anti-inflammatory effect on these cells. This divergence of results between these two lineages might be due a distinct immune response profile among themselves. Macrophages derived from BALB/c mouse strain are less sensitive to IFN-ã stimulation than macrophages derived from C57BL/6 mouse strain, thus producing less NO. Moreover, the J774 strain also tends to produce anti-inflammatory responses, such as arginase I in response to LPS. The data show that the immunomodulating effect of microplusin may vary from one cell line to another, requiring further studies to better elucidate immunomodulating potential, so that hereafter, it can be studied in infection models.

Orientador: Prof. Dr. Fernando Carlos Giacomelli / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A internalização celular de acidos nucleicos requer um agente de transfeccao, uma vez que o DNA isolado nao e capaz de atravessar membranas lipidicas. Embora diversos agentes polimericos de transfeccao tenham sido estudados, nenhum dos veiculos de entrega de gene propostos preenche todos os requisitos necessarios para uma terapia eficaz (capacidade de condensar e compactar o DNA, estabilidade em ambiente plasmatico, baixa toxicidade, eficiencia de internalizacao, escape endossomal e liberacao intracelular de material genetico). Nesta direcao, foram produzidos poliplexos a partir da complexacao entre copolimeros cationicos e DNA. Os poliplexos foram preparados a partir de DNA de timo de bezerro (ctDNA) dissolvido em tampao fosfato. Medidas de espectroscopia de correlacao de fluorescencia (FLCS), potencial-¿ê e eletroforese em gel de agarose indicaram complexacao eficiente entre as cadeias de DNA e os copolimeros em bloco PEO113-b-PDEA50 e POEGMA70-b-P(OEGMA10-co-DEA47-co-DPA47). Os copolimeros em bloco foram capazes de condensar as cadeias de DNA em particulas com tamanho desejado para absorcao celular por meio das vias de endocitose (RH ~ 65-85 nm). Os resultados obtidos por AFM, SAXS e SLS sugerem que as estruturas supramoleculares sao esfericas, porem de elevado grau de hidratacao. Os dados de ITC revelaram que a ligacao polimero/DNA e endotermica, e consequentemente o processo e governado por efeitos entropicos. A combinacao dos resultados sugerem que POEGMA70-b-P(OEGMA10-co-DEA47-co-DPA47) condensa as cadeias de DNA de forma mais eficiente do que PEO113-b-PDEA50. Mostrou-se tambem por medidas de espectroscopia de dicroismo circular que a conformacao do DNA permaneceu estavel, mesmo apos a complexacao e os poliplexos se mostraram estaveis em meio plasmatico. Os resultados obtidos de viabilidade celular mostram que ambos os sistemas apresentam baixa citotoxicidade, entretanto ensaios de microscopia e citometria de fluxo mostram que os sistemas nao sao funcionais do ponto de vista de expressao de GFP. Porem, quando estes sistemas sao avaliados na presenca de cadeias polimericas livres de polietilenoimina (PEI) se obtem sucesso nas etapas da internalizacao e transfeccao genica indicando que a presenca de cadeias livres de PEI tem papel fundamental nos processos. / PThe intracellular delivery of nucleic acids requires a vector system as they cannot diffuse across lipid membranes. Although polymeric transfecting agents have been extensively investigated, none of the proposed gene delivery vehicles fulfills all the requirements needed for an effective therapy namely ability to bind and compact DNA into polyplexes, stability in serum environment, endosome-disrupting capacity, efficient intracellular DNA release and low toxicity. Accordingly, investigations aiming at safe and efficient therapies are still essential to achieve clinical success of gene therapies. Polyplexes based on the complexation between DNA and cationic copolymers have been produced. The polyplexes were prepared by previously dissolving DNA from calf thymus (ctDNA) in phosphate buffer saline. Measurements of FCS, ¿ê-potential and agarose gel electrophoresis indicated the complexation of DNA and some of block copolymer systems, namely PEO113-b-PDEA50 and POEGMA70-b-P(OEGMA10-co-DEA47-co-DPA47). The block copolymers were evidenced to properly condense DNA into particles with desirable size for cellular uptake via endocytic pathways (RH ~ 65-85 nm). The shape and surface morphology of the polyplexes were investigated using SLS, SAXS and AFM and the data suggest that the supramolecular structures are spherical, however, highly swollen by water. The ITC data revealed that the polymer/DNA binding is endothermic and therefore the process in entropically driven. The combo of results supports that POEGMA70-b-P(OEGMA10-co-DEA47-co-DPA47) condenses DNA more efficiently and with higher thermodynamic outputs as compared to PEO113-b-PDEA50. Finally, circular dichroism spectroscopy indicated that the conformation of DNA remained the same after complexation and that the polyplexes are highly stable in serum environment. The cell viability results show that both systems have low cytotoxicity, however microscopy and flow cytometry assays showed that the polymers are poor tranfecting agents themselves. Nevertheless, in the presence of PEI chains, cellular uptake and transfection efficiency are subtantially enhances point out the fundamental importance of positive charges in the processes.

Orientador: Prof.Dr.Arnaldo Rodrigues dos Santos Jr / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A rotofiação é uma técnica recente que surgiu para melhorar a taxa de produção de fibras que podem ser usadas na regeneração ou cicatrização tecidual. Existe um interesse crescente no desenvolvimento de matrizes poliméricas com o objetivo de auxiliar a cicatrização.Foi utilizadas soluções poliméricas compostas por PCL/PLLA (50/50%) com e sem tetraciclina (TC), nas concentrações de 3%, 5%, 7%(m/v) dissolvidos em clorofórmio e uma variação produzida com 5% (m/v) utilizando 20% de acetona e 80% de clorofórmio como solventes, que denominamos de 20:80(v/v). As soluções foram padronizadas em volume de 10ml para serem rotofiadas e formaram fibras e membranas, fato não relatado na literatura. Constatou-se que a produção aumenta juntamente coma utilização de soluções poliméricas mais concentradas, visto que a solução 3% não produziu fibras e a 7% foi a que resultou em maior quantidade. O teste de viscosidade demonstrou a relação direta entre o aumento da viscosidade com o aumento da concentração de polímero. A TC interferiu na morfologia das membranas e fibras, tanto na porosidade quanto na espessura. Na análise de espessura das membranas foi verificado que as soluções mais viscosas produzem membranas mais espessas. A espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) no módulo de refletância total atenuada (ATR) demonstrou picos característicos de PCL/ PLLA e TC. O microscópio invertido de fluorescência foi utilizado para análise de incorporação e quantificação da TC, a incorporação da TC foi confirmada pela emissão de fluorescência somente nas amostras contendo TC. A análise microbiológica foi realizada em cultura de bactérias Staphylococcus aureus em todas as membranas e somente na fibra 7%, no teste em placas de Petri a formação de halo de inibição representou a atividade antibacteriana em todas as amostras, um teste de diluição em caldo foi realizado e confirmou o resultado somente nas membranas com TC, as fibras não mostraram capazes de matar as bactérias.Foram feitos 2 testes de citotoxicicidade, o primeiro com células inoculadas diretamente sobre o material por um período de 48h mostrou que as amostras com TC eram tóxicas, o segundo foi realizado um tratamento retirando o excesso de TC sobrenadante e apresentou resultado oposto nas membranas, com formação de tapete celular em todas as amostras, exceto nas fibras 7%T, indicando que a morte celular ocorria pelo excesso de TC liberada num primeiro momento nas membranas, porém, nas fibras esse tratamento não foi eficaz. A análise citoquímica mostrou a presença de células em todas as membranas e nas fibras 7% controle, porém, notamos ausência de células nas fibras 7%T corroborando com a citotoxicidade apresentada. Os resultados indicam que a técnica de rotofiação produz fibras e membranas com alta porosidade utilizando baixas concentrações de polímeros, em quantidades satisfatórias para as fibras a partir da concentração de 7%. A concentração de TC necessita de ajuste para excluir a citotoxicidade. As amostras controles não apresentaram citotoxicidade sendo indicadas para testes in vivo. Este trabalho pretende colaborar com as poucas informações sobre a técnica de rotofiação. / The centrifugal spinning is a recent technique that has emerged for improving the production of fibers which can be used in tissue regeneration or healing. There is growing interest in the development of polymer matrices in order to promote the wound healing mainly due to the limitations of available products. Polymer solutions composed of PCL/PLLA (50/50%) with and without tetracycline (TC) were used in the concentrations of 3%, 5%, 7% (m/v) dissolved in chloroform and a variation produced with 5% (m/v) using 20% acetone and 80% chloroform as solvents, which we call 20:80 (v/v). The solutions were standardized in 10 ml volume to be rotofied and formed fibers and membranes, which has not yet been reported in the literature. It was found that the production increases along with the use of more concentrated polymer solutions, since the 3% solution did not produce fibers and 7% resulted in higher amounts. The viscosity test demonstrated a direct relationship between increasing viscosity with increasing polymer concentration. CT interfered in the morphology of membranes and fibers, both in porosity and thickness. In the analysis of the thickness of the membranes it was verified that the more viscous solutions produce thicker membranes. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) in the attenuated total reflectance (ATR) module demonstrated characteristic peaks of PCL/PLLA and TC. The fluorescence inverted microscope was used for CT incorporation and quantification analysis, the TC incorporation was confirmed by the emission of fluorescence only in samples containing TC. Microbiological analysis was performed on culture of Staphylococcus aureus bacteria in all membranes and only on 7% fiber, in the Petri dish test the inhibition halo formation represented antibacterial activity in all samples, a broth dilution test was Performed and confirmed the result only on TC membranes, the fibers were not able to kill the bacteria. Two cytotoxicity tests were performed, the first with cells inoculated directly on the material for a period of 48h showed that the TC samples were toxic, the second was a treatment removing the excess TC presented opposite result in the membranes, with Cell carpet formation in all samples, except for the 7%T fibers, indicating that cell death occurred due to the excess of TC released at the first moment in the membranes, but in the fibers this treatment was not effective. Cytochemical analysis showed the presence of cells in all membranes and in the 7% control fibers, however, there were no cells in the fibers 7% T corroborating with the presented cytotoxicity. The results indicate that the rotofiation technique produces membranes and fibers with high porosity using low concentrations of polymers, in quantities satisfactory to the fibers from the concentration of 7%. TC concentration needs adjustment to exclude cytotoxicity. Control samples did not show cytotoxicity being indicated for in vivo testing. This work intends to collaborate with the few information about rotofiação technique.

Orientador: Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / A hidrolise enzimatica da celulose e realizada pela acao sinergica de pelo menos tres tipos de celulases distintas: endoglucanases, exoglucanases e B.glicosidases. As endoglucanases e celobiohidrolases sao frequentemente inibidas pelo aumento da concentracao de celobiose (dimero de glicose) no meio reacional. As ¿À-glicosidases sao enzimas que clivam celobiose em monomeros de glicose. Portanto, as B-glicosidases sao essenciais ao processo de hidrolise da celulose por impedirem o acumulo de celobiose e, assim, evitar a diminuicao da taxa de hidrolise. Processos de pre-tratamento da biomassa lignocelulosica sao empregados, antes da reacao de hidrolise enzimatica da celulose, a fim de retirar a fracao de lignina e aumentar a taxa de conversao da celulose em glicose. Porem, estes processos de pre-tratamento da biomassa lignocelulosica nao sao 100% eficientes na remocao da lignina. Estudos previos mostraram que a adicao de lignina a celulose pura pode causar a reducao da liberacao de acucar em valores superiores a 60%. Assim, neste estudo, nos caracterizamos a adsorcao nao produtiva da enzima ¿À-glicosidase da familia GH1 da bacteria Thermotoga petrophila (TpBGL1) em ligninas extraidas de diferentes biomassas (cana-de-acucar e eucalipto). Em pH 7 e 6, nossos resultados indicaram que a repulsao eletrostatica enfraquece a adsorcao nao produtiva de TpBGL1 em ligninas. Contudo, em pH 4 a atracao eletrostatica fortalece a adsorcao nao produtiva. Alem disso, o aumento da temperatura de 25 oC para 70 oC nao resultou em um aumento significativo da adsorcao de TpBGL1 em ligninas, provavelmente porque nao ocorre um aumento significativo de regioes hidrofobicas na estrutura da enzima expostas ao solvente. Todas as informacoes obtidas neste estudo poderao ser uteis para aplicacoes biotecnologicas no campo de conversao de polissacarideos estruturais em bioenergia. / The B-glucosidases are a group of important enzymes employed in a large number of industrial applications. In this study, we reported for the first time the photobiosynthesis of stable and functional silver nanoparticles (AgNPs) using two hyperthermostable bacterial â-glucosidases with industrial potential. The syntheses were simple and rapid processes carried out by mixing â-glucosidases and silver solution under irradiation with light (450-600 nm), therefore, compatible with the green chemistry methodology. The synthesized AgNPs were characterized using a series of physical techniques. Absorption spectroscopy showed a strong absorption band at 460 nm due to surface plasmon resonance of the AgNPs. X-ray diffraction analysis showed that the AgNPs were purely crystalline in nature. Electron microscopy showed AgNPs of variable diameter ranging from 20 to 100 nm. In addition, electron microscopy, zeta potential and Fourier transform infrared spectroscopy results confirmed the presence of â-glucosidases coating and stabilizing the AgNPs. The results also showed that the enzymatic activities were maintained in the â-glucosidases assisted AgNPs. The data described in this study should provide a useful basis for future studies of â-glucosidases assisted AgNPs, including biotechnological applications.