Orientador: Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / CelE1 é uma endoglucanase, pertencente à família GH5, altamente ativa em ampla faixa de temperaturas e em condições alcalinas de pH. Foram examinamos os efeitos do pH sobre as estruturas secundárias e terciárias, carga líquida, e a atividade de CelE1. Embora a variação do pH tenha mostrado um pequeno efeito na estrutura da enzima, a atividade foi influenciada em condições ácidas, enquanto que atingiu a atividade ótima em pH 8. A fim de verificar a possibilidade de aplicação industrial como aditivo de detergentes, a atividade da enzimática da CelE1 foi avaliada na presença de agentes tensoativos. Surfactantes iônicos e não iônicos não foram capazes de reduzir significativamente a atividade CelE1. Portanto, notou-se que CelE1 pode ser uma candidata promissora para utilização como aditivos de detergentes. Foi relatada uma análise termodinâmica com base na estabilidade estrutural e química dos processos de desnaturação e renaturação da enzima. Os resultados indicaram que A enzima CelE1 apresenta atividade em temperaturas baixas e ambientes, em condições alcalinas e na presença de surfactantes, além de ter a capacidade de se desnaturar e renaturar, em diferentes concentrações de ureia. O processo de desnaturação e renaturação da CelE1 mostrou-se ser um processo reversível de dois estados. Estes dados podem ser úteis para aplicações biotecnológicas. / CelE1 is a cold-active endo-acting glucanase with high activity at a broad temperature range and under alkaline conditions. Here, we examined the effects of pH on the secondary and tertiary structures, net charge, and activity of CelE1. Although variation in pH showed a small effect in the enzyme structure, the activity was highly influenced at acidic conditions, while reached the optimum activity at pH 8. Furthermore, to estimate whether CelE1 could be used as detergent additives, CelE1 activity was evaluated in the presence of surfactants. Ionic and nonionic surfactants were not able to reduce CelE1 activity significantly. Therefore, CelE1 was found to be promising candidate for use as detergente additives. Finally, we reported a thermodynamic analysis based on the structural stability and the chemical unfolding/refolding process of CelE1. The results indicated that the chemical unfolding proceeds as a reversible two-state process. These data can be useful for biotechnological applications.

Orientador: Prof. Dr. Arnaldo Rodrigues dos Santos Jr. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / A engenharia tecidual aplicada a regeneracao de lesoes da pele e uma area de estudos interdisciplinar, e envolve principalmente o desenvolvimento de biomateriais em forma de arcaboucos (scaffolds) e a associacao destes as celulas. Biomateriais polimericos naturais, como quitosana (QUI) e acido hialuronico (AH), tem apresentado resultados promissores nesta area, ja que possuem propriedades biomimeticas da matriz extracelular. Este fato motiva o desenvolvimento de arcaboucos como matrizes artificiais que dao suporte mecanico para celulas do tecido a ser regenerado. Neste estudo, acido hialuronico (AH) e quitosana (QUI) foram utilizados para preparo de arcaboucos de QUI e a blenda composta por QUI-AH para a regeneracao tecidual cutanea. Os arcaboucos foram obtidos pela tecnica de gelificacao seguida de liofilizacao, o que resultou em estruturas porosas adequadas para utilizacao em engenharia tecidual, ja que permite melhor interacao e proliferacao celular. Estruturas porosas promovem a vascularizacao, essencial para a nutricao do tecido, e consequentemente, a melhora do processo de reparacao tecidual. Amostras de arcaboucos produzidas foram caracterizadas quanto ao intumescimento em meio de cultura, microscopia eletronica de varredura (MEV) e Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR). A tecnica de liofilizacao nao proporcionou distribuicao e topografia homogeneas e coordenada dos poros, porem obteve-se poros com alta distribuicao ao longo do arcabouco seco com tamanho medio de aproximadamente (20 } 7) ¿Êm em composto por QUI e de (15 } 5) ¿Êm em composto por QUI-AH. Apos o intumescimento, os arcaboucos apresentaram (95.6 }8.8) ¿Êm e (86.3 }13.6) ¿Êm, respectivamente. Ambos os compostos demonstraram perda de massa residual, porem o composto de QUI-AH demonstrou maior diminuicao de massa residual no decorrer do estudo. O presente estudo foi realizado em celulas HaCaT, um modelo in vitro para citotoxicidade cutanea. Os arcaboucos demonstraram-se nao toxicos e proporcionaram adesao e migracao celular das celulas HaCaT e HDFB sobre ambos os substratos. As celulas HaCaT demonstraram maior formacao de colonias e migracao sobre o composto de QUI-AH e HDFB apresentou maior migracao no composto de QUI. / Tissue engineering applied to the regeneration of skin wounds is an area of interdisciplinary study and involves mainly the development of biomaterials in the form of scaffolds and the association of these to cells. Natural polymeric biomaterials, such as chitosan (CS) and hyaluronic acid (HA), have shown promising results in this area since they have biomimetic properties of the extracellular matrix. This fact motivates the development of scaffolds as artificial matrices that give mechanical support to cells of the tissue to be regenerated. In this study, hyaluronic acid (HA) and chitosan (CS) were used to prepare CS and hybrid CS-HA scaffold for cutaneous tissue regeneration. The scaffolds were obtained by the gelation technique followed by lyophilization, which resulted in porous structures suitable for use in tissue engineering since it allows better interaction and cell proliferation. Porous structures promote vascularization, essential for the nutrition of the tissue, and consequently, the improvement of the tissue repair process. Samples of scaffolds produced were characterized by swelling in the culture medium, scanning electron microscopy (SEM) and FTIR. The freeze-drying technique did not provide a homogeneous and coordinated pore distribution and topography, however, the pores with high distribution along of the dry scaffolds were obtained with a mean size of approximately (20 ± 7) ìm in composites composed of CS and (15 ± 5) ìm in the compound by CS-HA. After swelling, they presented (95.6 ±8.8) ìm and (86.3 ±13.6) ìm, respectively. Both compounds showed the residual mass loss, but the CS-HA compound demonstrated a greater decrease in residual mass during the study. The present study was carried out on HaCaT keratinocytes, an in vitro model of skin cytotoxicity. The scaffolds demonstrated no toxicity and provided cell adhesion and migration of HaCaT cells on both substrates. HaCaT cells demonstrated increased colony formation and migration through the CS-HA compound. In the other hand, HDFB presented increased migration through the CS compounds.

Orientadora: Profa. Dra. Silvia Ribeiro de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / As plantas possuem mecanismos de defesas que sao classificados como diretos e indiretos, ativando varias vias de respostas. As defesas diretas estao presentes constitutivamente nas plantas e podem estar relacionadas com o sistema antioxidante que possui componentes tais como glutationa oxidada (GSSH), glutationa reduzida (GHS), acido ascorbico (AA) e acido dehidroascorbico (DHA) que agem na manutencao do balanco oxi/antioxidante das plantas, visando minimizar os danos no sistema celular. As defesas indiretas estao relacionadas com as interacoes ecologicas e sao atribuidas aos compostos organicos volateis (COV) que podem combater o ataque de herbivoros e patogenos mediando as interacoes troficas. A ativacao das defesas ocorre quando as plantas estao expostas ao agente agressor. Dentre os varios agentes, destaca-se ozonio, por ser um poluente fitotoxico que promove estresse oxidativo e danos celulares. Nesse sentido, o presente trabalho tem o objetivo de verificar se o ozonio, e capaz de alterar as defesas quimicas diretas e indiretas de individuos de Croton floribundus e Pipitadenia gonoacantha estudadas em situacao isolada e combinada. Experimentos foram realizados em condicoes controladas e plantas foram expostas a 100 ppb de ozonio em situacao isolada e combinada. As exposicoes ocorreram durante 7 dias por 5 horas. Determinou-se os niveis dos antioxidantes acido ascorbico e glutationa por meio da espectroscopia UV-vis. Os valores dos pares AA/DHA e GHS/GSSH foram comparados com o potencial redox de cada par, obtido para as formas reduzidas/oxidadas pela equacao de Nernst. Os COV foram quantificados por cromatografia gasoasa acoplada a espectroscopia de massas. Os resultados obtidos mostraram que para as defesas diretas, a especie P.gonoacantha nao apresentou diferencas entre os tratamentos ar filtrado (AF) e ar filtrado enriquecido com ozonio (AF+O3) e entre as situacoes (isolada e combinada). Ja C.floribundus apresentou diferencas entre os tratamentos dos potenciais redox AA/DHA e GHS/GSSH na situacao combinada, mesmo assim a dose de ozonio aplicada nao foi capaz de promever danos oxidativos graves. No entanto, as defesas indiretas apresentaram emissao e inibicao de alguns compostos na presenca de ozonio. C.floribundus, em situacao isolada induziu os compostos Hexanal e 1-Hexanol,2-etil, ¿À-Felandreno, Cariofileno, cis-¿À-Farneseno, ¿¿-Muuroleno e (-) Spatulenol, enquanto que na situacao combinada apenas os compostos 3-Hexanal,1 ol (z) e o MeSa foram induzidos, os demais compostos foram inibidos na presenca do ozonio. Ja P.gonoacantha apresentou uma emissao maior de compostos na situacao isolada do que na combinada. Na situacao combinada houve majoritariamente a inducao de um sesqueterpeno nao identificado e do ¿À-Ocimeno. Esses compostos foram considerados como marcadores da coexistencia entre esssas duas especies. / Plants have mechanisms of defenses that are classified as direct and indirect, activating several response pathways. Direct defenses are constitutively present in plants and may be related to the antioxidant system that has components such as oxidized glutathione (GSSG), reduced glutathione (GSH) and ascorbic acid (AA) and dehydroascorbic acid (DHA), acting in the pro-antioxidant balance, minimizing damages in the cellular system. Indirect defenses are related to ecological interactions and are attributed to volatile organic compounds (VOCs) that can be against the attack of herbivores and pathogens mediater in the trophic interactions. Activation of defenses occurs when plants are exposed to the stressor agent. Among several agents, ozone stands out because it is a phytotoxic pollutant that promotes oxidative stress and cellular damage. In this sense, the present work has the objective of verifying that the ozone is capable of altering the direct and indirect chemical defenses of individuals of Croton floribundus and Pipitadenia gonoacantha studied in an isolated and combined situation. Experiments were carried out under controlled conditions and plants were exposed to 100 ppb of ozone in an isolated and combined situation. Exposures occurred for 7 days for 5 hours. The levels of the antioxidants ascorbic acid and glutathione were determined by UV-vis spectroscopy. The values of the DHA/AA and GSH / GSSGpairs were compared with the redox potential of each pair, obtained for the reduced / oxidized forms by the Nernst equation. The VOCs were quantified by gas chromatography coupled to mass spectroscopy. The results showed that the P.gonoacantha species did not indicate any differences between the treatments (AF) and filtered air enriched with ozone (AF + O3) and between situations (isolated and combined). C.floribundus presented differences between treatments of redox DHA/AA and GSH / GSSG potentials in the combined situation, even though the dose of ozone applied was not able to promise serious oxidative damages. However, the indirect defenses showed emission and inhibition of some compounds in the presence of ozone. C.floribundus, in the isolated situation induced the compounds Hexanal and 1-Hexanol, 2-ethyl, â-Felandren, Cariophilene, cis-â-Farnesene, á-Muurolene and (-) Spatulenol, whereas in the combined situation only compounds 3 -Hexanal, 1 ol (z) and MeSa were induced, the other compounds were inhibited in the presence of ozone. Already P.gonoacantha presented a greater emission of compounds in the isolated situation than in the combined one. In the combined situation, there was mainly the induction of an unidentified sesqueterpene and â-Ocimene. These compounds were considered as markers of coexistence between these two species.

Orientador: Prof. Dr. Arnaldo Rodrigues dos Santos Júnior / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / Os fosfatos de calcio, tendo como principais componentes inorganicos de hidroxiapatita (HAp - Ca10(PO4)6(OH)2) e ¿À-Fosfato tricalcico (¿À-TCP-Ca3(PO4)2), vem sendo estudados como substitutos osseo, devido a constituicao mineral similar a dos ossos e dentes, apresentando elevada biocompatibilidade e baixa toxicidade. A substituicao dos ions Ca2+ por ions Mg2+ favorece o metabolismo da mineralizacao dos tecidos mineralizados e estimula a proliferacao osteoblastica. A dopagem com ion Eu3+ possibilita a obtencao de fosfatos de calcio fluorescentes, permitindo assim o bioimageamento das nanoparticulas nos testes in vitro. Neste trabalho, nanoparticulas de HAp, ¿À-TCP e bifasicas (50%HAp e 50%¿À-TCP) dopadas com europio (1,5%) e/ou magnesio (1%) foram sintetizadas pelo metodo de co-precipitacao e tratadas termicamente a 1000¿C por 10-20 minutos. O po foi caracterizado por microscopia eletronica de varredura (MEV), difracao de raios-X (DRX), FTIR e espectroscopia de fluorescencia. Todas as bioceramicas foram analisadas quanto a dissolucao, em meio simulado (pH 7,4) e meio extremo (pH 3,0) por 120 horas. Foi avaliada a citotoxidade in vitro dos extratos com celulas Vero pelo metodo do cristal violeta e por contraste de fase das celulas vivas. Essas celulas foram cultivadas em meio de cultura 199 com 10% de soro fetal bovino a 37o C com 5% de CO2, durante 24 horas. Por MEV caracterizou-se o tamanho e morfologia das particulas puras e dopadas com Mg+2 e/ou Eu+3. O DRX apresenta as fases cristalinas caracterizadas nas respectivas amostras de HAp, ¿À-TCP e HAp/¿ÀTCP com a incorporacao de seus dopantes Mg+2 e/ou Eu+3. Por FTIR identificou-se os grupos funcionais atraves da comparacao dos modos vibracionais nas amostras antes e apos os testes de dissolucao simulado e extremo. Pela tecnica de espectroscopia de fluorescencia obteve-se os espectros de emissao caracteristicos para as diferentes estruturas dos fosfatos de calcio (HAp, ¿À-TCP e bifasicas) dopados com Eu+3 e Mg+2/Eu+3 antes e apos os testes de dissolucao no meio simulado e extremo, por 120 horas. Por ICP OES determinou as concentracoes de ions dissolvidos das amostras apos os testes de dissolucao no meio simulado e extremo. Os ensaios citotoxicos mostraram que os biomateriais estudados nao apresentaram efeitos toxicos a viabilidade celular, sendo, portanto, materiais biocompativeis para aplicacoes in vitro. / Synthetic calcium phosphate bioceramics containing inorganic components hydroxyapatite (HAp-Ca10(PO4)6(OH)2) and â-phosphate tricalcium (â-TCP-Ca3(PO4)2) have been studied for bone repair applications because of their mineral constitution similar to that of bones and teeth, high biocompatibility and low toxicity. The substitution of Ca2+ by Mg2+ in the crystal structure of either the HAp or the â-TCP favors mineralization metabolism of mineralized tissues and stimulates osteoblast proliferation. The Eu3+ doping enables obtaining fluorescent calcium phosphates, thus allowing bioimaging of nanoparticles in vitro. In this work, HAp, â-TCP and biphasic (50% HAp and 50% â-TCP) nanoparticles doped with europium (1.5%) and / or magnesium (1%) were synthesized by the co-precipitation method and termically treated at 1000°C for 10-20 minutes. The powder was characterized by scanning electron microscopy (SEM), diffraction X-ray (XRD), FTIR and fluorescence spectroscopy. All bioceramics were analyzed on dissolution test in simulated (pH 7.4) and extreme (pH 3.0) during 120 hours. The bioceramic extracts were also used for cytotoxicity on vero cells in vitro by the crystal violet method and phase contrast microscopy of living cells. These cells were grown in culture medium 199 with 10% FBS at 37 °C with 5% CO2 for 24 hours. The particle size, and morphology characterized by SEM were compared with the ceramics without dopants and with incorporation of Mg+2 and / or Eu+3. The XRD shows the crystal phases characterized in their respective samples of HAp, â-TCP and HAp / âTCP with the incorporation of its dopants Mg2+ and / or Eu+3. With FTIR were identified functional groups by comparing the vibrational modes in the samples before and after the dissolution tests simulated and extreme. The fluorescence spectroscopy technique yielded the characteristic emission spectra for the different structures of calcium phosphates HAp, â-TCP and biphasic, dopants Mg+2 and / or Eu+3 before and after the dissolution test in simulated and extreme through time 120 hours. The ICP OES determined the dissolved ion concentrations of the samples after the dissolution tests in the medium simulated and extreme. Cytotoxic assays showed that the biomaterial studies showed no toxic effects on cell viability and, therefore, biocompatible materials in vitro applications.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / As calicreinas 5 (KLK5) e 7 (KLK7) sao serino proteases que pertencem a um grupo de 15 calicrei.nas teciduais humanas (KLKs) encontradas em diversos tecidos do corpo. A KLK5 e encontrada principalmente no tecido mamario, sistema nervoso central, testiculos, prostata e traqueia, enquanto a KLK7 e encontrada no esofago, figado, rins e glandulas salivares. Alem disso, ambas as enzimas sao mais abundantemente expressas na pele humana, onde acredita-se que exercam importante papel no processo de descamacao epidermal, a partir da hidrolise de proteinas que compoem as estruturas de adesao intercelular dos corneodesmossomos. Estudos tambem demonstram, que a atividade dessas duas enzimas aparece aumentada em patologias relacionadas ao processo de descamacao da pele, como psoriase e dermatite atopica. Desta forma, o desenvolvimento de inibidores para KLK5 e KLK7 podera contribuir nao apenas para elucidar seus mecanismos fisiologicos e patologicos, mas como um arquetipo de novas drogas, visando ao desenvolvimento de novos procedimentos terapeuticos para patologias relacionadas ao processo de descamacao epidermal. Neste projeto, foram testados 17 pseudopeptideos e 10 compostos derivados do acido tetramico frente as calicrei.nas teciduais humanas 5 e 7, tripsina e quimotripsina. Dos 17 pseudopeptideos, oito compostos nao foram soluveis na fase de teste em meio aquoso e nove compostos foram soluveis em meio aquoso e puderam ser testados como inibidores das KLK 5 e KLK 7, sendo que quatro destes apresentaram inibicao utilizando concentracoes da ordem micromolar perante a KLK5. No entanto, apenas um composto obteve acao inibitoria frente a KLK7, porem com potencial inibitorio menor, comparado com resultados anteriores, relatados pelo nosso grupo de pesquisa. Os dez compostos aciltetramicos foram soluveis em tampao aquoso e apenas tres nao apresentaram atividade inibitoria contra as enzimas. Os resultados referentes as KLKs e tripsina foram significativos com uma acao inibitoria da ordem de micromolar. Os compostos derivados do acido tetramico nao inibiram a quimotripsina. Esses resultados abrem uma discussao sobre a especificidade da KLK7, que e classificada como uma enzima do tipo quimotripsina-like, no entanto, neste trabalho, apresentou um padrao de inibicao semelhante a tripsina. / The kallikreins 5 and 7 are serine proteases which belong to a group of fifteen human tissue kallikreins (KLKs) found in a diverse of body tissues. The KLK5 is mainly found on mammary tissue, central nervous system, testicles, prostate and trachea, while the KLK7 is found in the esophagus, liver, kidneys and salivary glands. Moreover, both enzymes are abundantly expressed on the human skin, and its believed that they have an important role on the epidermal desquamation process, from the hydrolysis of proteins that make up the corneodesmosomes intercellular adhesion structures. Recently it was shown that both kallikreins activity appears to be increased in diseases relates to the desquamation process, such as psoriasis and atopic dermatitis. Thus, the development of inhibitors for KLK5 and KLK7 would not only contribute to the elucidation of their physiological and pathological mechanisms, but also serve as an archetype for new drugs, aiming the development of new therapeutic procedures for diseases related to epidermal desquamation. In this project, 17 pseudo-peptides and 10 tetramic acid derived compounds were tested against the human tissue kallikreins 5 and 7, trypsin and chymotrypsin. From the 17 pseudo-peptides, nine were soluble in aqueous medium and could be tested; four of them showed inhibition in the micro molar range against the KLK5. Just one compound was effective against the KLK7, but with low inhibitory action. The 10 aciltetramic compounds were soluble in aqueous buffer, and only three of them did not show any inhibitory activity against the kallikreins. The results referring to the kallikreins and trypsin were significant, with an inhibitory action in the micro molar range. The compounds did not inhibit the chymotrypsin. These results open a discussion about the KLK7 specificity, which despite of being classified as a chymotrypsin-like enzyme, showed, in this work, an inhibition pattern similar to trypsin.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Soares da Cruz / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / O desenvolvimento das plantas depende fortemente das condições ambientais em que estes organismos se encontram. Assim, as plantas desenvolveram mecanismos de adaptação e defesa que permitem seu crescimento e proliferação, mesmo sem a habilidade de se deslocar. Devido a este altamente sofisticado sistema de defesa e adaptação das plantas, as suas características (fenotípicas e bioquímicas) são fortemente influenciadas pelo ambiente no qual a planta se desenvolve. Para garantir a reprodutibilidade dos experimentos em biologia de plantas é fundamental a mensuração e, se possível, o controle adequado dos parâmetros ambientais essenciais ao crescimento das plantas. A não observação disso pode incorrer na não reprodutibilidade do experimento e, consequentemente, obtenção de conclusões incorretas ou distorcidas dos resultados experimentais. Neste trabalho analisamos a manipulação do espectro luminoso a fim de controlar as características da luz incidente nas plantas. Para isto, foram estudados materiais poliméricos para uso como filtros da luz solar e isolamento dos espécimes do ambiente externo. Dessa forma, analisamos os efeitos destes filtros na qualidade e quantidade de luz e seu uso no redirecionamento das trajetórias metabólicas e propriedades biométricas no ciclo de crescimento das plantas. Além disso, para fins práticos, também verificamos as mudanças nas propriedades físicas destes materiais ao longo do tempo por meio de exposição a processos de degradação acelerada. Dessa forma, verificamos os possíveis efeitos de deterioração nos materiais poliméricos devido a sua exposição ao meio ambiente por longos períodos, o que nos permite garantir o uso das câmaras de crescimento desenvolvidas por um período de tempo adequado, no qual suas características essenciais não sofram danos que poderiam influir nos resultados experimentais esperados. / The development of the plans depends heavily on the environmental conditions in which these organisms are. Thus, plants are developed to adapt and defend maximizing their growth and proliferation, even without the ability to move. Due to this highly sophisticated system of defense and adaptation of the plants, their characteristics (phenotypic and biochemical) are strongly influenced by the environment where plant develops. In order to guarantee the reproducibility of the experiments in plant biology, it is fundamental the measurement and, if it is possible, adequate control of environmental parameters essential to plant growth. Failure to observe this may result in non-reproducibility of the experiment and consequently incorrect or distorted conclusions of the experimental results. In this work, we analyzed the manipulation of the light spectrum in order to control the characteristics of the incident light in the plants. For this, we studied polymeric materials for use as sunlight filters and isolation of the specimens from the external environment. Thus, we analyzed the effects of these filters on the quality and quantity of light and their effects in the redirection of the metabolic trajectories and biometric properties in the plant growth cycle. In addition, for practical purposes, we also monitoring at changes in the physical properties of these materials over time through exposure to accelerated degradation processes. In this way, we verify the possible effects of deterioration in the polymeric materials due to their exposure to the environment for long periods, which allows us to guarantee the use of developed growth chambers for an adequate period of time, in which their essential characteristics do not suffer degradation that could influence incorrectly the experimental results.

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Augusto Christoffolete / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2018. / A investigação da obesidade tornou-se sólida com a descoberta do gene ob, responsável por codificar o hormônio leptina e, com a deficiência de leptina (ob/ob), bem como pela identificação dos genes que codificam os receptores de leptina (lepr), assim, foi possível observar que pacientes obesos apresentavam níveis elevados de leptina sérica e desenvolvimento de resistência à leptina. Através da elucidação de sua ação no sistema nervoso central (SNC), observou-se que os sítios alvo da leptina no encéfalo, como o núcleo arqueado do hipotálamo (ARC), o núcleo hipotalâmico ventromedial (VMH) e núcleo hipotalâmico distomedial (DMH), ricos em receptores de leptina (LepR), representam um excelente modelo para circuitos neurais distintos que controlam a homeostase energética. A leptina é degradada por proteases de cisteínas lisossomais, mais precisamente pelas catepsinas B, K, L e S, as quais estão altamente relacionadas com a obesidade. O objetivo deste estudo é investigar o possível envolvimento das catepsinas B, K, L e S na resistência central à leptina em camundongos C57Bl/6J submetidos à HFD (dieta rica em gordura). Para tanto, foram utilizados 2 grupos de camundongos C57Bl/6J. Um grupo submetido ao tratamento com dieta HFD e outro grupo com dieta Chow, ambos tratados por 68 dias. Os hipotálamos dos animais foram submetidos à imunomarcação para avaliação dos níveis e localização de catepsinas B, K, L e S, bem como submetidos à investigação da expressão de mRNA das catepsinas mencionadas por RT-qPCR e dos níveis proteicos por Western Blot. Os camundongos do grupo HFD apresentaram obesidade e hiperleptinemia; porém, apesar de não haver diferença nos níveis de mRNA de LepR entre os grupos HFD e Chow, houve uma diminuição de aproximadamente 20% nos níveis de mRNA de MC4R no grupo HFD sugerindo dessensibilização desta via de sinalização da leptina. Os dois grupos apresentaram níveis semelhantes de mRNA das catepsinas B, K, L e S, assim como níveis proteicos semelhantes destas catepsinas. Portanto, com base nos resultados obtidos, verificou-se que no hipotálamo de camundongos C57Bl/6J, as catepsinas B, K, L e S, não parecem ser moduladas por HFD, diferente no que ocorre em tecido adiposo branco em modelo de animais DIO (diet-induced obesity). / Obesity research has become solid with the discovery of the gene ob, responsible for encoding the leptin hormone and, with leptin deficiency (ob/ob), as well as by the identification of the leptin receptor¿s genes (lepr), thus, it was possible to observe that obese patients would present high seric leptin levels and development of leptin resistence. Through the elucidation of its action in the central nervous system (CNS), it was observed that the leptin target sites in the brain, as the arcuate nucleus of the hypothalamus (ARC), the hypothalamic ventromedial nucleus (VMH) and distal hypothalamic nucleus (DMH), rich in leptin receptors (LepR), represent an excellent model for different neural circuits that control energy homeostasis. The leptin is degraded by lysosomal cysteine proteases, more precisely the catepsins B, K, L and S, which are highly related to obesity. The aim of this study is to investigate the possible involvement of the B, K, L and S cathepsins in the leptin central's resistance in C57Bl/6J mice submitted to HFD (high fat diet). For this, 2 groups of C57Bl/6J mice were used. One group underwent treatment with HFD diet and another group with Chow diet, both treated for 68 days. The hypothalamus of the animals were submitted to immunostaining to evaluate the levels and location of cathepsins B, K, L and S, as well as submitted to the investigation of mRNA expression of cathepsins mentioned by RT-qPCR and protein levels by Western Blot. The HFD mice presented obesity and hyperleptinemy; however, although there was no difference in LepR mRNA levels between the HFD and Chow groups, there was about 20% decrease in MC4R mRNA levels in the HFD group suggesting desensitization of this leptin signaling pathway. Both groups showed similar levels of cathepsin B, K, L and S mRNA, as well as similar protein levels of these cathepsins. Therefore, based on the results achivied, it was verified that in the hypothalamus of C57Bl/6J mice, cathepsins B, K, L and S do not appear to be modulated by HFD, different in what occurs in white adipose tissue of DIO animals model (diet-induced obesity).

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Augusto Christoffolete / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2018. / O autismo é um distúrbio do desenvolvimento caracterizado pelo prejuízo comportamental e tendência ao isolamento social. Existe uma gama de sintomas utilizados para o diagnóstico do paciente autista como deficiências sociais, anormalidades na comunicação, comportamentos repetitivos e inflexibilidade cognitivia. Como modelo de autismo experimental validado, têm-se a administração de LPS nos 9,5 dias da gestação de ratas. Assim, questionou-se se esse tratamento poderia provocar uma alteração do ambiente materno e se seria suficiente para modular o comportamento maternal e doentio em mães, bem como parâmetros reprodutivos e moleculares, sendo que nas proles avaliar o desenvolvimento físico e neurocomportamental e comportamentos ligados à interação social e aprendizado e memória e parâmetros moleculares. Associado ao tratamento com LPS aplicou-se a terapia homeopática com Zincum metallicum nas potências 5CH e 30CH para observar se poderia reverter possíveis prejuízos nas mães e nas proles. Os resultados demonstraram que o tratamento pré-natal materno com LPS promoveu quadro de febre 4, 5 e 24 horas após a exposição ao agente, não prejudicou a performance reprodutiva, o comportamento maternal e os parâmetros do desenvolvimento físico e neurocomportamental em ambas as proles independente do tratamento homeopático. Por outro lado, prejudicou a interação social, atividade locomotora e aprendizado e memória nas proles masculina e feminina aos 21 dias de idade sendo esses efeitos revertidos pelo tratamento com Zincum metallicum 30CH porém aos 60 dias de idade animais da prole masculina cujas mães não foram tratadas com Zincum metallicum continuaram a apresentar prejuízos comportamentais. Ainda, ambas as proles apresentaram redução da expressão de Shank1 e SHANK1 no córtex pré-frontal aos 21 dias de idade, sendo que somente a prole masculina continuou a apresentar esses resultados quando avaliados aos 60 dias de idade. Esses resultados demonstram que a administração de LPS induziu comportamento tipo autístico nas proles de ratas e que esses prejuízos comportamentais foram parcialmente revertidos pelo tratamento homeopático materno. / Autism is a developmental disorder characterized by behavioral impairment and a social isolation tendency. There is a range of symptoms used to autistic patient diagnosis, such as social deficiencies, communication abnormalities, repetitive behaviors and cognitive inflexibility. As a previous experimental autism model, LPS administration is given at 9.5 days of gestation in rats. Thus, it was questioned whether this treatment could make a change in the maternal environment and whether it would be sufficient to modulate maternal and sick behavior, as well as reproductive and molecular parameters in dams, and the evaluate the physical and neurobehavioral development and behaviors related to social interaction and learning and memory and molecular parameters in offspring. Associated with LPS treatment, homeopathic therapy with Zincum metallicum at 5CH and 30CH potencies was applied to see if it could reverse injury in mothers and offspring. The results showed that maternal prenatal treatment with LPS promoted fever at 4, 5 and 24 hours after exposure to the agent, did not affect reproductive performance, maternal behavior and parameters of physical and neurobehavioral development in offspring independently of homeopathic treatment. On the other hand, it impaired the social interaction, locomotor activity and learning and memory in the male and female offspring at 21 days of age, and these effects were reversed by treatment with Zincum metallicum 30CH, but at 60 days old male offspring whose mothers were not treated with Zincum metallicum continued to exhibit behavioral injury. Moreover, both offspring presented reduction of Shank1 and SHANK1 expression in the prefrontal cortex at 21 days of age, and only the offspring continued to present these results when evaluated at 60 days of age. These results demonstrate that the administration of LPS induced autistic type behavior in the offspring of rats and that these behavioral losses were partially reversed by maternal homeopathic treatment.

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Augusto Christoffolete / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. / Desde o século XV, animais fazem parte da rotina na área da pesquisa, principalmente para estudos de doenças, e hoje em dia o modelo animal mais utilizado para estes estudos é o camundongo, tendo uma participação em mais de 90% das pesquisas em todo o mundo, sendo considerado como uma primeira via para definir funções de genes em mamíferos. Os camundongos são considerados os principais modelos nas técnicas de transgenia animal, porém estas técnicas ainda estão em desenvolvimento, uma vez que as metodologias hoje utilizadas para a geração de animais transgênicos ainda se encontram com uma taxa de sucesso considerada baixa e são dispendiosas, necessitando de muitas etapas. Uma das dificuldades é o contato com a membrana do óvulo devido a zona pelúcida, que é considerada uma barreira física. Vetores virais estão em evidência nas técnicas de transgenia animal, sendo o lentivírus o mais utilizado. Portanto, o objetivo deste projeto é estabelecer um protocolo para a integração de DNA exógeno em óvulos por infecção lentiviral, anteriormente a fertilização in vitro juntamente com a técnica de dissecção parcial da zona pelúcida. Como vetor foi utilizado um lentivírus com GFP em sua construção. Para ocorrer a fertilização in vitro, foram feitas coletas de óvulos em camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6, tratadas com injeções hormonais, e coletas de espermatozoides em machos desta mesma linhagem. Os óvulos obtidos foram divididos em grupos controle e com dissecção parcial da zona pelúcida, e estes foram subdivididos em grupos com e sem infecção lentiviral. Entre os grupos houve variação de 20% a 56,25% de embriões em estágio de duas células, e em alguns grupos foi possível alcançar o estágio de blastocisto eclodido. Porém não foi possível visualizar a emissão de fluorescência para confirmar a infecção lentiviral. Em conclusão as metodologias utilizadas tanto para a fertilização in vitro como para a dissecção parcial da zona pelúcida foram de sucesso. Porém a integração do DNA exógeno mostrou resultados não conclusivos, necessitando de estudos futuros. / Since the XV century, animals are used routinely in research, mainly for diseases studies, and nowadays the most used animal model is the mouse, which one has more than 90% of participation in researches around the world and it is considered the first track to define gene function in mammals. Mouse is the main model in transgenic techniques, however the methods available to generate transgenic animals still have a considerable low rate, and also it is expensive, requiring many degrees. An ordinary issue is the contact with the membrane of oocyte due zona pellucida that is considered a physical barrier. In transgenic animals technique, it is in evidence the utilization of viral vectors, and the most used are the lentiviruses. Therefore, the objective of this project is to establish a protocol for the integration of exogenous DNA by lentiviral infection into oocytes, before the in vitro fertilization, using the technique of partial dissection of the zona pellucida. It was used as a vector a lentivirus with GFP in your construction. For in vitro fertilization, were collected oocytes from C57Bl/6 mice, treated with hormones, and sperm from males of the same strain. The obtained oocytes were divided in control group and partial dissection of the zona pellucida group, and then subdivided in groups with and without lentiviral infection. Between the groups, was achieved 20% to 56,25% of two cells stage embryo, and hatched blastocysts stage were obtained at some groups. Therefore it was not possible to visualize florescence emission to confirm the lentiviral infection. In conclusion we have a practicable protocol for in vitro fertilization and partial dissection of the zona pellucida, reaching blastocysts stages in two groups. However the integration of exogenous DNA results were inconclusive, requiring further studies.

Orientador: Prof. Dr. Jean-Jacques Bonvent / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017.